一种聚合物泡沫涂层支架及其制备方法
阅读说明：本技术 一种聚合物泡沫涂层支架及其制备方法 (Polymer foam coating support and preparation method thereof ) 是由 郑兆柱 刘静宜 李刚 吕强 王晓沁 于 2021-09-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种聚合物泡沫涂层支架,包括支架本体和形成于所述支架本体表面的聚合物多孔泡沫涂层,所述聚合物多孔泡沫涂层中负载有药物和/或活性物质；所述聚合物多孔泡沫涂层不溶于水性液体或部分溶于水性液体,其原料为天然聚合物材料；所述药物和/或活性物质是将聚合物泡沫涂层支架灭菌后,通过后载药的方式负载于所述聚合物多孔泡沫涂层中的。本发明还公开了所述聚合物泡沫涂层支架的制备方法。本发明的聚合物泡沫涂层支架,采用后载药的方式将药物、活性物质负载于聚合物多孔泡沫涂层中,从而有效地解决了现有涂层技术中灭菌过程药物和活性物质活力损失的问题。(The invention discloses a polymer foam coating stent, which comprises a stent body and a polymer porous foam coating formed on the surface of the stent body, wherein a medicament and/or an active substance are loaded in the polymer porous foam coating; the polymer porous foam coating is insoluble or partially soluble in aqueous liquid, and the raw material of the polymer porous foam coating is a natural polymer material; the drug and/or active substance is loaded in the polymer porous foam coating in a post-drug loading mode after the polymer foam coating stent is sterilized. The invention also discloses a preparation method of the polymer foam coating bracket. According to the polymer foam coating stent, a drug and an active substance are loaded in the polymer porous foam coating in a post-drug loading manner, so that the problem of activity loss of the drug and the active substance in a sterilization process in the prior coating technology is effectively solved.)
技术领域
本发明涉及组织工程材料技术领域，具体涉及一种聚合物泡沫涂层支架及其制备方法。
背景技术
支架是管腔组织、器官手术中常用的医疗器械，具有疏通体液的作用。目前，支架主要分为由不锈钢、镍钛合金或钴铬合金等制备的金属支架，以及由聚合物材料制备的聚合物支架。
以不锈钢、钴铬合金、镍钛合金等材料为主的金属支架已经较广泛地应用于治疗心血管疾病中，且取得了较好的治疗效果。但这些心血管支架存在在治疗过程中在体内不能降解、易发生心血管再狭窄、致栓塞反应、慢性炎症反应以及在体内释放出毒性金属离子等副作用。为解决这一系列问题，研究人员在支架表面进行涂层，涂层中带有药物、生长因子或其他活性物质。这种涂层支架植入体内后，药物和/或生长因子等活性物质便会缓慢释放出来，在抑制副作用出现的同时，还能促进组织再生。
然而，现有的药物和/或生长因子等活性物质性质普遍不稳定，在体内释放速度难以控制。更为重要的是，支架制备工艺中普遍存在终端灭菌过程，该过程很容易导致药物和/或生长因子等活性物质失活，而且是非常高比例的失活，其药物和/或生长因子等活性物质涂层性质与灭菌前存在显著性差异。中国发明专利CN 106913915 B公开了一种自愈合支架复合涂层，通过合成可降解双键封端嵌段聚合物，涂布于支架表面后经交联、冷冻后得到自愈合多孔涂层，这种自愈合多孔涂层可以通过改变温度实现多孔结构的愈合，从而制备得到负载有药物和/或活性分子的自愈合支架复合涂层。该专利使用合成聚合物，并通过温度的改变诱导多孔结构愈合实现载药。中国发明专利CN 108485512 B公开了一种图案化多孔聚合物涂层，通过在涂层材料中引入光交联基团，并结合涂层自身的动态特性，实现调控局部微相分离，对不同形状、不同尺寸的区域实现选择性致孔，即得图案化多孔聚合物涂层。但是，这些专利中的涂层材料均使用的是合成聚合物，一方面合成聚合物合成过程使用有机溶剂，不仅会对环境造成污染，残留的反应物或者中间产物还会产生不可预知的生物安全风险；另一方面，合成聚合物在体内的降解复杂，聚合物本身及降解产物均会产生不可预知的生物安全风险。此外，采用自愈合聚合物和光交联聚合物限制了其涂层的形成物质及应用范围。中国专利CN00137207.6公开了一种具有防再狭窄功能的血管支架，通过将聚合物载体配成分散液涂覆在支架表面，真空干燥后形成多孔结构的聚合物涂层，再通过浸渍的方式使药物吸附聚合物涂层中。该专利中虽然公开了采用明胶作为涂层材料，但是按照实施例中方法(60℃干燥1h)制备的明胶涂层均为实心的涂层，而无法得到多孔泡沫涂层，因此也就无法实现对活性物质的保护。因此，如何使用生物相容性高的天然聚合物制备多孔支架涂层实现对活性物质的保护是目前支架研究和应用领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种聚合物泡沫涂层支架，该支架采用后载药的方式将药物和/或活性物质有效负载于聚合物多孔泡沫涂层中，且具有缓释作用，从而有效地解决了药物缓释和现有涂层技术中灭菌过程药物和活性物质活力损失的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
本发明提供了一种聚合物泡沫涂层支架，包括支架本体和形成于所述支架本体表面的聚合物多孔泡沫涂层，所述聚合物多孔泡沫涂层中负载有药物和/或活性物质；所述聚合物多孔泡沫涂层不溶于水性液体或部分溶于水性液体，其原料为天然聚合物材料；所述药物和/或活性物质是将聚合物泡沫涂层支架灭菌后，通过后载药的方式负载于所述聚合物多孔泡沫涂层中的。所述聚合物多孔泡沫对所载药物和/或活性物质具有缓释作用。
本发明中，所述天然聚合物材料包括但不限于玻尿酸、胶原、藻酸盐、壳聚糖、丝素蛋白、明胶、白蛋白，以及它们的衍生物中的一种或多种。
优选地，所述聚合物多孔泡沫涂层具有弹性恢复能力，其在置入体内之前先进行预压缩；置入体内后回弹，从而使所述聚合物多孔泡沫涂层不会从支架本体上脱离。
本发明中，所述聚合物多孔泡沫涂层具有弹性恢复能力，即所述聚合物多孔泡沫涂层是可发生形变的，且同时可以维持其物体完整性的。在置于待修复或扩充的组织中之前和/或期间，可以将聚合物孔泡沫涂层进行预压缩。然后再置于组织中，压缩的聚合物泡沫涂层可以在组织中膨胀，并在一段时间内在组织中恢复其初始形状。
本发明中，聚合物泡沫涂层在组织内膨胀以达到平稳体积可以是自发的(例如，5秒钟或更短时间内)，或在一段时间(例如，数秒、数分钟和数小时)内发生。同时根据支架孔径的大小和/或聚合物泡沫的性质，聚合物泡沫(压缩前)可适于为任何大小。聚合物泡沫在组织内的膨胀速率可取决于若干因素，包括但不限于水合状态、压力、空隙空间的体积、以及泡沫结构性质(包括孔隙率)、以及流体和结构体之间的相互作用。
本发明中，对于聚合物多孔泡沫涂层上药物、活性物质的负载量不限。优选地，所述聚合物多孔泡沫涂层中，药物的负载量为1～5000纳克/毫米，生物活性分子的负载量为1～5000纳克/毫米。
聚合物泡沫涂层的厚度会影响所载药物的释放性能。本发明中，对于聚合物多孔泡沫涂层的厚度不限，优选地，聚合物多孔泡沫涂层的厚度为1nm～1mm。
本发明还提供了所述的聚合物泡沫涂层支架的制备方法，包括以下步骤：
S1.提供一支架本体，在所述支架本体上形成聚合物多孔泡沫涂层，所述聚合物多孔泡沫涂层的原料为天然聚合物材料；
S2.将带有所述聚合物多孔泡沫涂层的支架本体进行灭菌处理，再以后载药的方式将药物和/或活性物质负载于所述聚合物多孔泡沫涂层中，即得到所述聚合物泡沫涂层支架。
本发明中，所述支架本体从材质上区分，可分为金属支架或聚合物支架。作为所述金属支架，其材料包括但不限于不锈钢、镍钛合金和钴铬合金。作为所述聚合物支架，可为可降解支架或不可降解支架。所述聚合物支架的材料包括但不限于尼龙、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯、聚四氟乙烯、奥纶、埃弗伦和涤纶。此外，支架本体可以包括已经通过已报道的化学交联或者层层自组装方法涂层后的支架，还可以包括已经通过已报道的化学交联或者层层自组装方法进行非灭菌过程易失活药物和或活性物质涂层后的支架。
本发明中，所述药物可为疏水性药物或亲水性药物，所述疏水性药物包括但不限于雷帕霉素及其衍生物、紫杉醇及其衍生物、依维莫司、新型西罗莫司，所述亲水性药物包括但不限于亲核NO供体。根据主要药理作用的不同，可以将涂层药物分为五大类：(1)抗血栓药物，如肝素、水蛭素、前列环素、阿昔单抗等。(2)抗炎症药物，如地塞米松(DXM)、甲基强的松龙、双磷酸盐脂质体等。(3)抗VSMC增殖药物，如雷帕霉素(RAPM)、紫杉醇(PTX)、血管肽素、Mycophenolic Acid、Tracolimus、Everolimus、环孢素A、甲基-RAPM等。(4)抗VSMC移行药物，如巴马司他等。(5)促内皮愈合药物，如17β雌二醇、血管内皮生长因子等。
本发明中，所述活性物质包括但不仅限于血管内皮细胞生长因子、血管内皮细胞特异性抗体anti-CD34等、血管内皮细胞生长因子基因等。
本发明中，形成所述聚合物多孔泡沫涂层的方法包括以下步骤：
(i)将聚合物原料配制成涂层母液；
(ii)通过浸渍或涂覆的方式将涂层母液加载于支架本体的表面；
(iii)使支架本体表面的涂层母液形成多孔泡沫状，即得到所述聚合物多孔泡沫涂层。
本发明中，所述聚合物原料包括天然聚合物材料，所述天然聚合物包括但不限于玻尿酸、胶原、藻酸盐、壳聚糖、丝素蛋白、明胶、白蛋白，以及它们的衍生物中的一种或多种。这类天然聚合物不仅具有良好的生物相容性，而且在体内环境中可以逐渐降解。
优选地，所述天然聚合物材料为丝素蛋白。丝素蛋白是从蚕丝提取的蛋白质，占蚕丝质量的75-80％，具有低、无免疫原性，优异且可调的力学性质。丝素蛋白中疏水氨基酸与亲水氨基酸的比例6：1，且可通过多种交联机制形成凝胶或者支架材料。后载药后材料界面与药物、生物活性因子甚至金属离子之间存在多种作用力(亲疏水作用、氢键、范德华力等)，可有效实现对所载制剂的缓释作用，可以通过水不溶性处理方式调控与所载制剂的作用力，实现对所载制剂的有效控释。
进一步地，所述涂层母液形成水不溶性多孔泡沫状的方法包括下列方法中的一种或多种：(1)形成水不溶性凝胶，再经冻干过程形成水不溶性多孔泡沫。(2)直接形成不溶性多孔泡沫状。(3)直接冻干形成水溶或者部分水溶的多孔泡沫，再经后处理形成水不溶性多孔泡沫。
其中，形成水不溶性凝胶的方法包括物理交联法和化学交联法。
直接形成不溶性多孔泡沫状指的是在低温条件下使涂层母液中的聚合物化学交联形成冷冻凝胶，所述低温是指温度低于涂层母液的冰晶形成温度。
将水溶或者部分水溶的多孔泡沫，再经后处理形成水不溶性多孔泡沫的方法包括蒸汽熏蒸法、溶剂浸泡法和化学交联法中的一种或多种。
进一步地，所述聚合物原料还包括化学交联剂，化学交联剂的存在使得聚合物原料中的高分子材料发生化学交联，从而降低了涂层的水溶性，有利于提高涂层的稳定性，延长活性物质的释放周期。其中，所述化学交联剂包括但不限于甲醛、戊二醛、EDC-NHS、辣根过氧化物酶(HRP)/H2O2、BDDE、Ca2+、光敏剂中的一种或多种。
进一步地，所述聚合物原料还包括增塑剂，通过添加增塑剂，提高了聚合物材料的塑性，从而增加了涂层的韧性和弹性。所述增塑剂包括甘油、线形聚合物分子材料中的一种或多种，所述线形聚合物分子材料包括但不限于包括聚醚。
本发明中，所述灭菌的方法可采用本领域常用的灭菌方法，包括但不限于高温高压灭菌、环氧乙烷灭菌和辐照灭菌。
本发明中，将药物和/或活性物质负载于聚合物多孔泡沫涂层中的方法为：将带有聚合物多孔泡沫涂层的支架本体浸渍于含有药物和/或活性物质的溶液中，使得药物和/或活性物质负载于聚合物多孔泡沫涂层中。
本发明中，聚合物多孔泡沫涂层的厚度优选为1nm～1mm。聚合物泡沫涂层中药物和/或活性物质的释放速度与涂层的体积以及厚度呈正相关，即聚合物泡沫涂层越厚，药物释放速度越快，反之亦然。聚合物种类、聚合物衍生物的表面物理化学性质与药物、活性物质的作用力是多样化的。故本发明可以通过控制多孔泡沫涂层的厚度以及体积的方式，聚合物种类、聚合物衍生物的选择对负载的药物、活性物质的缓释作用进行控制。
另外，利用聚合物多孔泡沫的降解和/或溶解特性，可以部分地对聚合物泡沫涂层的体积进行控制，从而进一步地对药物、活性物质的释放进行控制。聚合物泡沫涂层可适于以预定的速率降解，使得随着涂敷聚合物的支架应用于人体中时，所述聚合物泡沫涂层的体积在逐渐减小的同时，仍提供足够的支持。
在一种优选的实施方式中，为了进一步控制药物释放曲线，使药物实现持续释放(药学活性药物在约6个月以上的时间段内释放)，可在具有或不具有粘度诱导组分、表面活性剂和/或包含润滑剂的流体(如盐水)的情况下，将带有聚合物多孔泡沫涂层的支架本体浸渍于含有药物/活性物质的凝胶前体中，使含有药物/活性物质的凝胶前体填充于聚合物多孔泡沫涂层的孔隙中并形成凝胶，从而延长某些生长因子或细胞因子的释放周期，并稳定其功能性。其中，所述凝胶前体材料包括但不限于玻尿酸、胶原、藻酸盐、壳聚糖、丝素蛋白、明胶、白蛋白及它们的衍生物中的一种或多种。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明采用后载药的方式，将活性物质负载于聚合物多孔泡沫涂层中，从而有效地解决了现有涂层技术中灭菌过程药物和活性物质活力损失的问题。
2.本发明的聚合物泡沫涂层支架中，涂层采用天然聚合物制备而成，与合成聚合物相比，天然聚合物无需人工合成，避免了合成过程中反应物及中间产物对环境造成的危害；同时天然聚合物本身具有良好生物相容性、无/低免疫原性以及可控的降解性质，不会造成潜在的生物安全风险，且有利于促进细胞的增殖和组织的愈合。
3.本发明的聚合物泡沫涂层支架中，支架上的涂层与药物或者活性物质之间存在物理限域作用、静电作用、亲疏水作用、离子作用等作用力，可对所载药物或者活性物质起到了缓释的作用。
4.本发明的聚合物泡沫涂层支架中，支架上的涂层与药物或者活性物质受到聚合物的保护作用，避免温度、pH值、渗透压等对所载涂层与药物或者活性物质的活性影响，从而能够更好地发挥药物或活性物质的作用。
附图说明
图1是分别采用全程灭菌、载药后灭菌、后载药和凝胶状后载药四种方式时，药物灭菌过程的活性变化图；
图2是分别采用全程灭菌、载药后灭菌、后载药和凝胶状后载药四种方式时，生长因子灭菌过程的活性变化图；
图3是实施例1制备的丝素蛋白冻干支架、全程灭菌支架和载药后灭菌支架的药物释放曲线；
图4是实施例2制备的丝素蛋白冻干支架的药物释放曲线；
图5是实施例3制备的丝素蛋白冻干支架的药物释放曲线；
图6是实施例4制备的丝素蛋白冻干支架的药物释放曲线；
图7是实施例1-2及实施例5制备的丝素蛋白支架的药物释放曲线；
图8是实施例6制备的玻尿酸支架的药物释放曲线；
图9是实施例7制备的丝素蛋白/玻尿酸冻干支架的药物释放曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：丝素蛋白冻干支架涂层
1.丝素蛋白溶液制备
将适量蚕丝或蚕茧(去蛹)置于0.02M的Na2CO3溶液中煮沸1.5小时脱胶，随即用蒸馏水反复冲洗干净，通风橱风干，得到脱胶蚕丝。将脱胶后的脱胶蚕丝按照质量体积比1：10放入混合溶液中(CaCl2/H2O/C2H5OH＝1/8/2，摩尔比)，在75-80℃水浴温度下不断搅拌直至丝素纤维全部溶解(约2小时)，溶解液用蒸馏水透析72小时，离心去除不溶性颗粒，得到浓度约为50-60mg/ml丝素蛋白溶液。
2.浸渍
将支架本体(镍钛合金)浸渍在丝素蛋白溶液(0.1～30％wt/v)之中得到水溶性初级丝素蛋白涂层。
3.冻干
将涂敷丝素蛋白涂层的支架本体在约-5，-6、-7、-9、-10、-20、-40、-80、-196℃温度下直接预冻2～48小时，或各种温度组合下预冻、淬火2～72小时。维持3天后再将该水溶性丝素蛋白涂层支架本体冷冻干燥48～96小时。表面冷冻干燥的丝素蛋白涂层成为具有非常一致的、相互连接的细孔结构的泡沫状材料。将丝素蛋白泡沫涂层进一步交联处理：采用水、甲醛、乙醇、乙醇、二苯乙醇等蒸汽熏蒸，或者直接浸泡于醇类溶剂中，以诱导β-折叠形成。表1为丝素蛋白溶液浓度与涂层厚度的关系。
表1
序号
丝素蛋白溶液浓度
单次涂层厚度
厚度达1mm的涂层次数
1
0.1％w/v
1nm
100
2
1％w/v
75nm
60
3
3％w/v
150nm
55
4
6％w/v
500nm
45
5
10％w/v
750nm
30
6
15％w/v
0.001mm
10
7
20％w/v
0.05mm
4
8
25％w/v
0.1mm
2
9
30％w/v
1mm
1
4.灭菌
将所制得的丝素蛋白浸渍涂层的心血管支架进行环氧乙烷熏蒸消毒、高温高压灭菌、γ-射线灭菌。表2为采用不同浓度的丝素蛋白溶液涂布的涂层在灭菌后的刚性和韧性的变化。
表2
从表2中可以看出，经过灭菌处理后，不同浓度的丝素蛋白溶液涂布的涂层的刚性和韧性变化均小于15％。
5.后载药
将谷氨酰胺溶于三蒸水中，得到谷氨酰胺溶液，谷氨酰胺溶液浓度为0.2mol/mL。随后，在室温环境下，将上述涂覆有丝素蛋白涂层的支架浸渍到谷氨酰胺溶液中，浸渍时间为30分钟。随后直接无菌条件下内包，开内包后可直接临床使用。最终支架上谷氨酰胺的载药量为1μmol/mL。通过药物母液浓度调节，可以调节药物的负载量为1～5000纳克/毫米。
将血管内皮细胞生长因子(VEGF)溶于水中，得到VEGF水溶液，浓度2000pg/ml。随后，在室温环境下，将上述涂覆有丝素蛋白涂层的支架浸渍到混合溶液中，浸渍时间为30分钟。随后直接无菌条件下内包，开内包后可直接临床使用。最终支架上内皮生长因子的载药量为200ng/mm。通过药物母液浓度调节，可以调节药物的负载量为1～5000纳克/毫米。
图1-2分别为采用无菌条件下层层自组装法载药涂层(全程灭菌)、层层自组装法载药涂层(载药后灭菌)和聚合物支架涂层后载药(后载药)的方式时，药物以及生长因子灭菌过程的活性变化图。
从图中可以看出，灭菌过程对药物以及生长因子的活性影响非常大，这也将影响临床应用效果。此外，无菌条件下层层自组装法载药涂层总的药物活性低于聚合物支架涂层后载药方式的药物活性，说明聚合物支架涂层对所载药物既具有保护作用，又不影响其全部释放。
药物释放试验：
(1)药物释放量测量操作以及计算步骤：
浸提介质制备：称量100g SDS(十二烷基硫酸钠)、120g乙醇和780g pH6.0的醋酸缓冲液，加入到带有磁性搅拌棒的合适密闭容器中，搅拌至所有固体完全溶解，注意尽量减少泡沫。
供试品溶液制备：用移液管精密量取8mL浸提介质移入棕色试样瓶中，将支架转移至提取介质中(支架必须完全浸入浸提介质中)，用聚四氟乙烯内衬螺帽盖住试样瓶。将试样瓶放入摇床中，设置摇床温度为(37±0.5)℃和100r/mim。在指定时间点(1天、7天、15天、30天、45天、60天、90天和180天)取出支架，将提取液经0.45μm滤膜过滤，滤液直接进样分析。
测量操作：取样品，分别按供试品溶液的制备方法，制备待测溶液。用一个由0.4064mm不锈钢丝制成的挂钩(或等效物)从玻璃瓶中取出支架。处于挂钩上时，为防止各个时间点的交叉污染，使用一块锥形无绒布的尖端部分仅仅触及支架最末端的底部，擦除支架内剩余的液体，然后将支架移至下一个含有洗脱液的玻璃瓶中，盖上取出支架的玻璃瓶，混合均匀，继续进行洗脱试验至下一个时间点。取80μL进样，测定峰面积，计算累积含量，记录色谱图。按外标法以峰面积计算，得到样品缓释量的测定结果。
(2)生长因子释放量测量操作以及计算步骤：
将支架放入磷酸缓冲盐溶液PBS(pH为7.4)中，之后置于转速为80rpm的室温(20℃～25℃)摇床。缓释一定时间后(1天、7天、15天、30天、45天、60天、90天和180天)，10000rcf离心5分钟，取上清保存，并加入等量新鲜的PBS缓冲液(pH为7.4)继续进行缓释；在缓释周期内按此方式依次取多个上清样品。使用ELISA试剂盒测定上清样品中生长因子的浓度并计算生长因子的累积释放量。每组测试3个样品，结果取平均值。
图3为无菌条件下层层自组装法载药涂层(全程灭菌)、层层自组装法涂层载药后灭菌(载药后灭菌)和聚合物支架涂层后载药的方式的药物释放曲线。从图中可以看出，实施例1的丝素蛋白泡沫涂层所载的药物，释放速度最慢，缓释效果最佳，具有更为有效的缓释效果。
支架本体为金属支架或聚合物支架时，都可以得到图1-3类似的结果和结论。
聚合物材料为玻尿酸、胶原、藻酸盐、壳聚糖、丝素蛋白、明胶、白蛋白，以及它们的衍生物中的一种或多种时，都可以得到图1-3类似的结果和结论。
实施例2：丝素蛋白冻干支架涂层
1.丝素蛋白溶液制备
按照实施例1的方法制备丝素蛋白溶液。
2.浸渍
将支架本体浸渍在丝素蛋白溶液(0.1～30％wt/v)和PEG400浓度为5～20％wt/wt混合液溶液之中，得到水溶性初级丝素蛋白涂层。
3.成凝胶
将涂敷丝素蛋白混合溶液的支架置于37摄氏度，湿度≥60％的容器中，至丝素蛋白成凝胶。
4.水洗
水洗72小时除去PEG。
5.冻干
将涂敷丝素蛋白涂层的支架本体在约-20℃温度下直接预冻48小时，冷冻干燥48～96小时。表面冷冻干燥的丝素蛋白涂层成为具有非常一致的、相互连接的细孔结构的泡沫状材料。
6.灭菌
将所制得的丝素蛋白浸渍涂层的心血管支架进行环氧乙烷熏蒸消毒、高温高压灭菌、γ-射线灭菌。
7.后载药
将姜黄素溶于PEG-400中，并加入0.1％没食子酸丙酯作为稳定剂，姜黄素溶液浓度为37.5mg/ml。随后，在室温环境下，将上述涂覆有丝素蛋白涂层的支架浸渍到姜黄素溶液中，浸渍时间为30分钟。随后直接无菌条件下内包，开内包后可直接临床使用。最终支架上姜黄素的载药量为1μmol/mL。
取适量羊抗猪CD34抗体，溶于0.01mo 1/L PBS(pH 7.4)溶液中，以1:15的比例加入20mmo l/L SPDP溶液，4℃冰箱中反应60min,将反应混合物加入microcon YM 230超滤管中离心洗涤3次(7000转/min,10min/次)以除去剩余的SPDP，在得到的羊抗猪CD34抗体--PDP溶液中加入过量的二硫苏糖醇醋酸溶液(DTT)(PH＝4.5)，置于4C冰箱中反应30min后再次经mirocon YM超滤管离心洗涤3次(具体方法同上)以除去剩余的二硫苏糖醇，最终得到羊抗猪CD34抗体-PDP-SH溶液。用SPDP偶联剂将125I标记的抗猪CD34抗体IgG化学偶联到将上述涂覆有丝素蛋白涂层的支架上，并在多聚物中加入20mmol/L SPDP溶液，4℃冰箱中反应60min后，反应溶液经0.01mmol/LPBS(pH7.4)溶液采用漂浮法洗涤，得到多聚物-PDP支架，将多聚物-PDP支架浸入羊抗猪CD34抗体-PDP-SH溶液中，4C冰箱中反应10h后，再次用漂浮法进行洗涤，最终得到包被抗体的支架。随后直接无菌条件下内包，开内包后可直接临床使用。最终支架上内皮生长因子的载药量为(0.64325±0.1325)μg。
按照实施例1中同样的方法，对制备的支架进行药物释放试验，得到如图4所示的药物释放曲线。从图中可以看出，实施例2的丝素蛋白冻干支架对于药物具有良好的缓释效果。
实施例3：丝素蛋白冻干支架涂层
1.丝素蛋白溶液制备
按照实施例1的方法制备丝素蛋白溶液。
2.浸渍
向1～30％左右的丝素蛋白溶液中加入交联剂如EDC-NHS、戊二醛、HRP和H2O2、京尼平等等中的一种或者多种作为化学交联剂，混合后得到混合溶液，将心血管支架浸渍在混合溶液之中得到初级水溶性丝素蛋白交联涂层。
3.成凝胶
将涂有丝素蛋白和交联剂的支架本体静置，直至成凝胶。
4.水洗
水洗除去未反应的化学交联剂。
5.冻干
将丝素蛋白化学交联心血管支架在约-20℃预冻过夜，冷冻干燥48-72小时。从冻干机移除之后，冷冻干燥的丝素蛋白化学交联涂层成为具有非常一致的、相互连接的细孔结构的泡沫状材料。
6.灭菌
将所制得的丝素蛋白浸渍涂层的心血管支架进行环氧乙烷熏蒸消毒、高温高压灭菌、γ-射线灭菌。
7.后载药
将谷氨酰胺溶于三蒸水中，得到谷氨酰胺溶液，谷氨酰胺溶液浓度为0.2mol/mL。随后，在室温环境下，将上述涂覆有丝素蛋白涂层的支架浸渍到谷氨酰胺溶液中，浸渍时间为30分钟。随后直接无菌条件下内包，开内包后可直接临床使用。最终支架上谷氨酰胺的载药量为1umol/mL。
取适量羊抗猪CD34抗体,溶于0.01mo 1/L PBS(pH 7.4)溶液中,以1:15的比例加入20mmo l/L SPDP溶液，4℃冰箱中反应60min，将反应混合物加入microcon YM 230超滤管中离心洗涤3次(7000转/min,10min/次)以除去剩余的SPDP，在得到的羊抗猪CD34抗体--PDP溶液中加入过量的二硫苏糖醇醋酸溶液(DTT)(PH＝4.5)，置于4C冰箱中反应30min后再次经mirocon YM超滤管离心洗涤3次(具体方法同上)以除去剩余的二硫苏糖醇，最终得到羊抗猪CD34抗体-PDP-SH溶液。用SPDP偶联剂将125I标记的抗猪CD34抗体IgG化学偶联到将上述涂覆有丝素蛋白涂层的支架上，并在多聚物中加入20mmol/L SPDP溶液，4℃冰箱中反应60min后，反应溶液经0.01mmol/LPBS(pH7.4)溶液采用漂浮法洗涤，得到多聚物-PDP支架,将多聚物-PDP支架浸入羊抗猪CD34抗体-PDP-SH溶液中，4C冰箱中反应10h后，再次用漂浮法进行洗涤，最终得到包被抗体的支架。随后直接无菌条件下内包，开内包后可直接临床使用。最终支架上内皮生长因子的载药量为(0.64325±0.1325)μg。
按照实施例1中同样的方法，对制备的支架进行药物释放试验，得到如图5所示的药物释放曲线。从图中可以看出，实施例3的丝素蛋白冻干支架对于药物具有良好的控释作用和缓释效果。
实施例4：丝素蛋白冻干支架涂层
1.丝素蛋白溶液制备
按照实施例1的方法制备脱胶蚕丝。
2.浸渍
将脱胶蚕丝溶于9.3M溴化锂中，得到1％～30的丝素蛋白水溶液，按照丝素蛋白与二缩水甘油醚(BDDE)5：1的比例加入化学交联剂BDDE，再将心血管支架浸渍在混合溶液之中，得到初级水溶性丝素蛋白交联涂层。其中，化学交联剂还可为二缩水甘油醚BDDE、二乙烯基砜、1,2,7,8-二环氧辛烷、1,3-二环氧丁烷和三偏磷酸钠中的一种或两种以上。
3.成凝胶
将涂有丝素蛋白和交联剂的支架本体静置，直至成凝胶。
4.水洗
水洗除去未反应的化学交联剂和溴化锂。
5.冻干
将丝素蛋白化学交联心血管支架在约-20℃预冻过夜，冷冻干燥48-72小时。从冻干机移除之后，冷冻干燥的丝素蛋白化学交联涂层成为具有非常一致的、相互连接的细孔结构的泡沫状材料。
6.灭菌
将所制得的丝素蛋白浸渍涂层的心血管支架进行环氧乙烷熏蒸消毒、高温高压灭菌、γ-射线灭菌。
7.后载药
将谷氨酰胺溶于三蒸水中，得到谷氨酰胺溶液，谷氨酰胺溶液浓度为0.2mol/mL。随后，在室温环境下，将上述涂覆有丝素蛋白涂层的支架浸渍到谷氨酰胺溶液中，浸渍时间为30分钟。随后直接无菌条件下内包，开内包后可直接临床使用。最终支架上谷氨酰胺的载药量为1umol/mL。
将血管内皮细胞生长因子(VEGF)溶于水中，得到VEGF水溶液，浓度2000pg/ml。随后，在室温环境下，将上述涂覆有丝素蛋白涂层的支架浸渍到混合溶液中，浸渍时间为30分钟。随后直接无菌条件下内包，开内包后可直接临床使用。最终支架上内皮生长因子的载药量为200ng/mm。
按照实施例1中同样的方法，对制备的支架进行药物释放试验，得到如图6所示的药物释放曲线。从图中可以看出，实施例4的丝素蛋白冻干支架对于药物具有良好的控释作用和缓释效果。
实施例5：丝素蛋白冻干支架涂层
1.按照实施例1或者实施例2的方法制备丝素蛋白溶液、浸渍、冻干和灭菌。
2.后载药
将姜黄素溶于PEG-400中，并加入0.1％没食子酸丙酯作为稳定剂，得到药物母液，将药物母液加入到1～10％丝素蛋白浓度中，向混合液中加入等体积80％PEG400，得涂层母液。将支架本体浸渍于涂层母液中，取出，静置于37℃直至成凝胶。
将生长因子溶于PBS溶液中，得到活性物质母液，将活性物质母液加入到1～10％丝素蛋白浓度中，向混合液中加入等体积80％PEG400，得涂层母液。将支架本体浸渍于涂层母液中，取出，静置于37℃直至成凝胶。
按照实施例1中同样的方法，对实施例1-2，5制备的支架进行药物释放试验，得到如图7所示的药物释放曲线。从图中可以看出，与实施例1-2相比，本实施例采用凝胶载药，对于药物的释放控制作用和释放效果更好。
实施例6：玻尿酸支架涂层
1.浸渍
将玻尿酸溶于9.3M溴化锂中，得到1％～30的玻尿酸水溶液，按照丝素蛋白与BDDE比例5：1的比例加入BDDE，将心血管支架浸渍在混合溶液之中得到初级水溶性玻尿酸交联涂层。
2.成凝胶
将涂有玻尿酸和交联剂的支架本体静置，直至成凝胶。
3.水洗
水洗除去未反应的化学交联剂和溴化锂。
4.冻干
将玻尿酸化学交联心血管支架在约-20℃预冻过夜，冷冻干燥48-72小时。从冻干机移除之后，冷冻干燥的丝素蛋白化学交联涂层成为具有非常一致的、相互连接的细孔结构的泡沫状材料。
5.灭菌
将所制得的玻尿酸浸渍涂层的心血管支架进行环氧乙烷熏蒸消毒、高温高压灭菌、γ-射线灭菌。
6.后载药
将姜黄素溶于PEG-400中，并加入0.1％没食子酸丙酯作为稳定剂，姜黄素溶液浓度为37.5mg/ml。随后，在室温环境下，将上述涂覆有丝素蛋白涂层的支架浸渍到姜黄素溶液中，浸渍时间为30分钟。随后直接无菌条件下内包，开内包后可直接临床使用。最终支架上姜黄素的载药量为1umol/mL。
取适量羊抗猪CD34抗体,溶于0.01mo 1/L PBS(pH 7.4)溶液中,以1:15的比例加入20mmo l/L SPDP溶液，4℃冰箱中反应60min，将反应混合物加入microcon YM 230超滤管中离心洗涤3次(7000转/min,10min/次)以除去剩余的SPDP，在得到的羊抗猪CD34抗体--PDP溶液中加入过量的二硫苏糖醇醋酸溶液(DTT)(PH＝4.5)，置于4C冰箱中反应30min后再次经mirocon YM超滤管离心洗涤3次(具体方法同上)以除去剩余的二硫苏糖醇，最终得到羊抗猪CD34抗体-PDP-SH溶液。用SPDP偶联剂将125I标记的抗猪CD34抗体IgG化学偶联到将上述涂覆有丝素蛋白涂层的支架上，并在多聚物中加入20mmol/L SPDP溶液，4℃冰箱中反应60min后，反应溶液经0.01mmol/LPBS(pH7.4)溶液采用漂浮法洗涤,得到多聚物-PDP支架，将多聚物-PDP支架浸入羊抗猪CD34抗体-PDP-SH溶液中，4C冰箱中反应10h后,再次用漂浮法进行洗涤，最终得到包被抗体的支架。随后直接无菌条件下内包，开内包后可直接临床使用。最终支架上内皮生长因子的载药量为(0.64325±0.1325)μg。
按照实施例1中同样的方法，对实施例6制备的支架进行药物释放试验，得到如图8所示的药物释放曲线。从图中可以看出，本实施例的玻尿酸支架对于药物具有良好的释放控制作用和释放效果。
采用胶原、藻酸盐、壳聚糖、明胶、白蛋白，及它们的衍生物中的一种或多种作为涂层材料时，也会得到类似的结果和结论。
实施例7：丝素蛋白/玻尿酸冻干支架涂层
1.丝素蛋白溶液制备
按照实施例1的方法制备脱胶蚕丝。
2.浸渍
将脱胶蚕丝和玻尿酸溶于9.3M溴化锂中，得到1％～30的丝素蛋白和玻尿酸水溶液，按照丝素蛋白和玻尿酸与BDDE比例5：1的比例加入BDDE，将心血管支架浸渍在混合溶液之中得到初级水溶性丝素蛋白和玻尿酸交联涂层。
3.成凝胶
将涂有丝素蛋白和玻尿酸和交联剂的支架本体静置，直至成凝胶。
4.水洗
水洗除去未反应的化学交联剂和溴化锂。
5.冻干
将丝素蛋白化学交联心血管支架在约-20℃预冻过夜，冷冻干燥48-72小时。从冻干机移除之后，冷冻干燥的丝素蛋白和玻尿酸化学交联涂层成为具有非常一致的、相互连接的细孔结构的泡沫状材料。
6.灭菌
将所制得的丝素蛋白和玻尿酸浸渍涂层的心血管支架进行环氧乙烷熏蒸消毒、高温高压灭菌、γ-射线灭菌。
7.后载药
将谷氨酰胺溶于三蒸水中，得到谷氨酰胺溶液，谷氨酰胺溶液浓度为0.2mol/mL。随后，在室温环境下，将上述涂覆有丝素蛋白涂层的支架浸渍到谷氨酰胺溶液中，浸渍时间为30分钟。随后直接无菌条件下内包，开内包后可直接临床使用。最终支架上谷氨酰胺的载药量为1umol/mL。
将血管内皮细胞生长因子(VEGF)溶于水中，得到VEGF水溶液，浓度2000pg/ml。随后，在室温环境下，将上述涂覆有丝素蛋白涂层的支架浸渍到混合溶液中，浸渍时间为30分钟。随后直接无菌条件下内包，开内包后可直接临床使用。最终支架上内皮生长因子的载药量为200ng/mm。
按照实施例1中同样的方法，对实施例7制备的支架进行药物释放试验，得到如图9所示的药物释放曲线。从图中可以看出，本实施例的丝素蛋白/玻尿酸冻干支架对于药物具有良好的释放控制作用和缓释效果。
采用玻尿酸、胶原、藻酸盐、壳聚糖、丝素蛋白、明胶、白蛋白，及它们的衍生物中的一种或多种之间各种组合作为涂层材料时，也会得到类似的结果和结论。
动物实验
遵照有关规定进行实验，选取健康杂种犬12只，体重15～20Kg。丝素蛋白涂层的血管支架涂层。约8cm长(按照国家食品药品监督管理局YY0500-2004，IS07198测试标准：植入血管长度＝血管直径×10)，直接植入犬腹主动脉而毋需自体血预凝操作。
各样品的标号如表3所示，其中标号1为实施例1制备的丝素蛋白冻干支架，使用的丝素蛋白溶液浓度为1％w/v，标号2为实施例2制备的丝素蛋白冻干支架，使用的丝素蛋白溶液浓度为1％w/v，标号16为未涂层对照组，采用自体血预凝。其他各标号的含义以此类推。
表3
标号
1
2
3
4
5
6
7
1％w/v
实施例1
实施例2
实施例3
实施例4
实施例5
实施例6
实施例7
标号
8
9
10
11
12
13
14
3％w/v
实施例1
实施例2
实施例3
实施例4
实施例5
实施例6
实施例7
标号
15
6％w/v
实施例5
标号
16
未涂层
对照组
在植入的第1、7、15和30天，分别测试各实验组的药物的缓释效果，结果如表4所示。
表4
结果显示，丝素蛋白化学交联涂层的人工血管术中无明显出血，且仅有少量炎症反应，经测量，涂层上所负载的药物与血管内皮细胞生长因子(VEGF)有效释放时间超过7天。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
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