一种真菌孢子损伤鉴定的方法
阅读说明：本技术 一种真菌孢子损伤鉴定的方法 (Method for identifying fungal spore damage ) 是由 文刚 曹瑞华 万琪琪 徐向前 黄廷林 王静怡 于 2021-08-16 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种真菌孢子损伤鉴定的方法,该方法包括真菌孢子细胞膜损伤鉴定,还包括真菌孢子DNA损伤鉴定。该方法使用SYBR Green I荧光染料进行两次染色并结合碘化丙啶进行染色,在SYBR Green I染色时加入EDTA；在消毒剂处理后,加入硫代硫酸钠淬灭消毒剂；采用流式细胞仪用于定量分析真菌孢子细胞膜的损伤程度和真菌孢子DNA的损伤程度。本发明的真菌孢子损伤鉴定的方法,除了能够鉴定真菌孢子的细胞膜损伤,还能够鉴定真菌孢子的DNA损伤鉴定,该方法采用了流式细胞仪,能够对真菌孢子损伤进行定量分析,实现了对水源的微生物消毒效果作出精准全面地评价。(The invention provides a method for identifying fungal spore damage, which comprises identifying fungal spore cell membrane damage and also comprises identifying fungal spore DNA damage. The method uses SYBR Green I fluorescent dye to carry out two times of dyeing and combines with propidium iodide to carry out dyeing, and EDTA is added during SYBR Green I dyeing; after the disinfectant treatment, adding sodium thiosulfate to quench the disinfectant; flow cytometry was used to quantify the extent of damage to the fungal spore cell membrane and the extent of damage to the fungal spore DNA. The method for identifying the damage of the fungal spores not only can identify the damage of cell membranes of the fungal spores, but also can identify the DNA damage of the fungal spores.)
技术领域
本发明属于水源处理领域，涉及水源微生物消毒，具体涉及一种真菌孢子损伤鉴定的方法。
背景技术
目前国外关于饮用水中真菌的污染已有大量研究，在不同的国家的不同水源(地表水、地下水、自来水厂、和水箱水)均有报道，饮用水源和供水系统中存在的真菌大多具有致病性、致毒性、致敏性。健康人群接触被真菌污染的饮用水会造成表皮或局部感染，而免疫缺陷患者则有更严重的侵袭性感染的风险。已知由真菌引起的感染可根据初始感染部位分为：念珠菌病、侵袭性真菌病、侵袭性曲霉菌病、甲真菌病、眼部感染等多种感染。除此，真菌污染还会产生环境问题，比如：气味，味道，毒素等。饮用水中味道和气味化合物的日益增多被认为是一个重要的水质问题。
真菌的控制包括物理消毒(紫外线和太阳消毒)和化学消毒(氯、氯胺、二氧化氯、臭氧)。上述六种氧化剂对真菌孢子的消毒效率依次为:UV>O3>二氧化氯>氯>氯胺>太阳能。真菌孢子在消毒过程中形态的改变和胞内内容物的泄漏是其灭活机理。经物理消毒和化学消毒后可观察到真菌孢子皱缩，真菌孢子周围的有少量化合物。二氧化氯、臭氧、PMS/Cl-处理真菌孢子时存在总氮的泄漏和细胞外ATP浓度的增加。此外，真菌孢子在UV-LED/Cl2消毒过程中也会损失其膜完整性和酯酶活性。最后，真菌孢子在消毒过程中经上述几个方面发生不可逆死亡。
流式细胞仪是一种快速、简单、准确的检测方法，流式细胞仪结合荧光染料已广泛应用于微生物活性检测，近年来，流式细胞仪逐渐被应用于水源消毒的评价方法中。但是，流式细胞仪在实际应用过程中，存在以下缺陷：第一，SYBR Green I荧光染料在染色时不够稳定，导致定量分析的结果不准确；第二，目前流式细胞仪主要用于评价微生物细胞经消毒后的膜完整性和酯酶活性，未见有报道使用流式细胞仪用于评价微生物的DNA损伤程度。也就是说，流式细胞仪难以准确、精确和全面地对水源中的微生物消毒效果作出评价。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于，提供一种真菌孢子损伤鉴定的方法，解决现有技术中流式细胞仪难以精准全面地评价水源微生物消毒效果的技术问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案予以实现：
一种真菌孢子损伤鉴定的方法，该方法包括真菌孢子细胞膜损伤鉴定，还包括真菌孢子DNA损伤鉴定；
所述的真菌孢子细胞膜损伤鉴定具体为，使用SYBR Green I荧光染料对真菌孢子进行两次染色，在SYBR Green I染色时加入EDTA，再使用碘化丙啶对真菌孢子进行染色；使用消毒剂处理真菌孢子后，加入硫代硫酸钠淬灭消毒剂；采用流式细胞仪用于定量分析真菌孢子细胞膜的损伤程度；
所述的真菌孢子DNA损伤鉴定具体为，使用SYBR Green I荧光染料对真菌孢子进行两次染色，在SYBR Green I染色时加入EDTA；使用消毒剂处理真菌孢子后，加入硫代硫酸钠淬灭消毒剂；采用流式细胞仪用于定量分析真菌孢子DNA的损伤程度。
本发明还具有如下技术特征：
具体的，所述的真菌具体为青霉或木霉。
具体的，所述的真菌孢子细胞膜损伤鉴定包括步骤一至步骤四；所述的真菌孢子DNA损伤鉴定包括步骤一、步骤二和步骤五；该方法具体包括如下步骤：
步骤一，制备初染孢子悬液：
步骤1.1，制备未染色的孢子悬液：
真菌孢子培养三周后，用灭菌后的磷酸盐缓冲液打在菌落表面，然后轻轻刮取真菌孢子并将真菌孢子悬浮在磷酸盐缓冲液中，得到粗悬液；将粗悬液进行过滤和离心清洗后，得到沉淀A，用磷酸盐缓冲液将沉淀A重悬后得到孢子悬液；
步骤1.2，SYBR Green I初步染色：
在步骤1.1中所述的孢子悬液中加入SYBR Green I荧光染料和EDTA母液，震荡混匀后得到混合物B，所述的EDTA在混合物B中的终浓度为10μM～60μM；将混合物B在37℃的温度下，避光染色20min，得到初染孢子悬液；
步骤二，制备复染孢子悬液：
步骤2.1，真菌孢子离心重悬浮：
将步骤1.2中所述的初染孢子悬液，离心清洗后，得到沉淀C，将沉淀C用磷酸盐缓冲液重悬后得到混合物D；
步骤2.2，设置实验组和对照组，对实验组进行消毒剂处理：
步骤2.2.1，实验组处理：
在步骤2.1中所述的混合物D中加入消毒剂氯胺，所述的消毒剂氯胺在混合物D中的终浓度为3mg/L，在室温静置处理20min～120min后，加入硫代硫酸钠，得到混合物E1；所述的硫代硫酸钠在混合物E1中的终浓度为0.05M；
步骤2.2.2，对照组处理：
将步骤2.1中所述的混合物D，在室温静置20min～120min后，加入硫代硫酸钠，得到混合物E0；所述的硫代硫酸钠在混合物E0中的终浓度为0.05M；
步骤2.3，SYBR Green I二次染色：
在步骤2.2中所述的混合物E1和混合物E0中，分别加入SYBR Green I荧光染料和EDTA母液，震荡混匀后分别得到混合物F1和混合物F0，所述的EDTA在混合物F1和混合物F0中的终浓度均为10μM～60μM；将混合物F1和混合物F0在37℃的温度下，避光染色20min后，得到实验组复染孢子悬液和对照组复染孢子悬液；
步骤三，制备碘化丙啶染色孢子悬液：
在步骤2.3中所述的实验组复染孢子悬液和对照组复染孢子悬液中，分别加入碘化丙啶染液，震荡混匀后分别得到混合物G1和混合物G0，所述的碘化丙啶在混合物G1和混合物G0中的终浓度均为6μM；将混合物G1和混合物G0在37℃的温度下，避光染色20min，得到实验组碘化丙啶染色孢子悬液和对照组碘化丙啶染色孢子悬液；
步骤四，定量分析真菌孢子细胞膜损伤：
采用流式细胞仪，对步骤三所述的实验组碘化丙啶染色孢子悬液和对照组碘化丙啶染色孢子悬液分别进行检测；流式细胞仪的设定参数具体为：发射波长488nm，激发波长630nm，进样体积为20μL，进样速度为33μL/min，进样总颗粒小于500个/s；检测完成后，经过数据处理获得真菌孢子细胞膜损伤率；
步骤五，定量分析真菌孢子DNA损伤：
采用流式细胞仪，对步骤2.3中所述的实验组复染孢子悬液和对照组复染孢子悬液分别进行检测；流式细胞仪的设定参数具体为：发射波长488nm，激发波长570nm，进样体积为20μL，进样速度为33μL/min，进样总颗粒小于500个/s；检测完成后，经过数据处理得到真菌孢子DNA损伤率。
具体的，步骤1.2中，所述的EDTA在混合物B中的终浓度为30μM；步骤2.3中，所述的EDTA在混合物F1和混合物F0中的终浓度均为30μM。
具体的，步骤1.2中，所述的SYBR Green I荧光染料的加入量为，每500μL孢子悬液中加入10μL SYBR Green I荧光染料；步骤2.3中，所述的SYBR GreenI荧光染料的加入量为，每500μL混合物E1和混合物E0中加入10μL SYBRGreen I荧光染料。
具体的，步骤2.2中，所述的室温静置处理和室温静置的时间均为120min。
具体的，步骤1.1中，所述的离心清洗的具体步骤为：在8000r/min的转速下离心10min，弃去上清，在沉淀中加入磷酸盐缓冲液吹打重悬；重复上述步骤1～2次；
步骤2.1中，所述的离心清洗的具体步骤为：在12000r/min的转速下离心10min，弃去上清，在沉淀中加入磷酸盐缓冲液吹打重悬；重复上述步骤1～2次。
本发明与现有技术相比，具有如下技术效果：
(Ⅰ)本发明的真菌孢子损伤鉴定的方法，除了能够鉴定真菌孢子的细胞膜损伤，还能够鉴定真菌孢子的DNA损伤鉴定，该方法采用了流式细胞仪，能够对真菌孢子损伤进行定量分析，实现了对水源的微生物消毒效果作出精准全面地评价。
(Ⅱ)本发明的真菌孢子损伤鉴定的方法中，采用SYBR Green I荧光染料进行两次染色，消除了由于荧光染料量减少对细胞染色带来的不利影响；在SYBR Green I染色时加入EDTA，提高了染色的稳定性和染色效果；在消毒剂处理后加入硫代硫酸钠淬灭消毒剂，避免了残余消毒剂对细胞染色带来的不利影响，提高了定量分析的准确性和精确性。
(Ⅲ)本发明的真菌孢子损伤鉴定的方法，采用流式细胞仪并结合了SYBRGreen I活性检测技术，能够快速、准确和高效地定量鉴定饮用水中丝状真菌孢子的细胞膜损伤和DNA损伤，从而满足饮用水中丝状真菌污染控制指标的需求。
附图说明
图1为真菌孢子损伤鉴定的方法的流程示意图。
图2为消毒剂对真菌孢子DNA影响的荧光响应曲线图，其中Ⅰ代表实验组，Ⅱ代表对照组。
图3为消毒剂与SYBR Green I荧光染料相互作用的荧光响应曲线图，其中Ⅰ代表实验组，Ⅱ代表对照组。
图4为实施例1的膜完整性细胞散点图，其中A代表对照组，B代表实验组。
图5为实施例2的膜完整性细胞散点图，其中A代表对照组，B代表实验组。
图6为实施例3的荧光响应曲线图，其中Ⅰ代表实验组，Ⅱ代表对照组。
图7为实施例3的流式散点图，其中A代表对照组，B代表实验组。
图8为实施例4的荧光响应曲线图，其中Ⅰ代表实验组，Ⅱ代表对照组。
图9为实施例4的流式散点图，其中A代表对照组，B代表实验组。
图10为对比例1的荧光响应曲线图，其中Ⅰ代表实验组，Ⅱ代表对照组。
图11为对比例1的流式散点图，其中A代表对照组，B代表实验组。
图12对比例2的荧光响应曲线图，其中Ⅰ代表对照组，Ⅱ代表实验组。
图13为对比例2的流式散点图，其中A代表对照组，B代表实验组。
以下结合实施例对本发明的具体内容作进一步详细解释说明。
具体实施方式
现有研究中，已有文献对镰刀菌孢子经金属加工液和氯基消毒剂处理后的存活能力进行了评估，研究结果表明，使用5％和10％金属加工液处理水源中的微生物，能够使得微生物活性孢子降低到原有水平的76％和23％；使用3mg/L氯基消毒剂处理2h后，真菌孢子的侧向散射(Side Scatter，SSC)值下降了59.96％，同时，完整细胞、酯酶阳性细胞和高活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)水平细胞分别为下降了20％、60％和35％。综上所述，真菌孢子在消毒过程中存在皱缩现象，会丧失膜完整性和酯酶活性，胞内活性氧增高，从而导致细胞死亡。然而，现有研究中鲜有文献报道消毒剂会对真菌孢子的DNA造成损伤，在我们之前的研究中，SYBR Green I染色的真菌孢子在消毒后FL1-A强度下降，可以初步推断FL1-A强度的下降与DNA损伤有关。
本发明中，我们对消毒剂对真菌孢子的DNA的作用进行了进一步探究，具体研究方法如下：
一、探究消毒剂对真菌孢子DNA的影响，具体方法如下：
步骤一，制备初染孢子悬液：
步骤1.1，制备未染色的孢子悬液：
真菌孢子培养三周后，用灭菌后的磷酸盐缓冲液打在菌落表面，然后轻轻刮取真菌孢子并将真菌孢子悬浮在磷酸盐缓冲液中，得到粗悬液；将粗悬液进行过滤和离心清洗后，得到沉淀A，用磷酸盐缓冲液将沉淀A重悬后得到孢子悬液。
步骤1.2，SYBR Green I初步染色：
在步骤1.1的孢子悬液中加入SYBR Green I荧光染料和EDTA母液，震荡混匀后得到混合物B，所述的EDTA在混合物B中的终浓度为30μM；将混合物B在37℃的温度下，避光染色20min，得到初染孢子悬液。
步骤二，设置实验组和对照组，对实验组进行消毒剂处理：
步骤2.1，实验组处理：
在步骤1.2的混合物D中加入终浓度为3mg/L的氯胺，在室温静置处理120min后，加入终浓度为0.05M的硫代硫酸钠，得到混合物E1。
步骤2.2，对照组处理：
将步骤1.2的混合物D在室温静置120min后，加入终浓度为0.1M的硫代硫酸钠，得到混合物E0。
步骤三，流式细胞仪检测：
采用流式细胞仪，对步骤二中的混合物E1和混合物E0进行检测；流式细胞仪的设定参数具体为：发射波长488nm，激发波长570nm，进样体积为20μL，进样速度为33μL/min，进样总颗粒小于500个/s。实验组混合物E1的检测结果如图2中的Ⅰ所示，对照组混合物E0的检测结果如图2中的Ⅱ所示。
由图2可知，实验组较对照组，峰值向左偏移，即消毒剂处理后，真菌孢子的荧光响应值明显降低。消毒剂处理后，真菌孢子的荧光响应值降低的原因可能有两个：一是消毒剂与SYBR Green I荧光染料相互作用，导致体系中的SYBR Green I荧光染料量减少，从而导致荧光响应值降低；二是消毒剂与真菌孢子DNA相互作用，导致SYBR Green I荧光染料的DNA结合位点减少，从而导致荧光响应值降低。为验证上述猜想，本发明进行了如下进一步研究。
二、探究消毒剂与SYBR Green I荧光染料的相互作用，具体方法如下：
步骤一，制备未染色的孢子悬液，同上述步骤1.1。
步骤二，消毒剂与SYBR Green I互作，设置实验组和对照组：
步骤2.1，实验组处理：
将消毒剂氯胺(终浓度为3mg/L)与SYBR Green I荧光染料震荡混合后，在37℃的温度下避光反应20min，再加入硫代硫酸钠，得到混合物，将该混合物与步骤一中的孢子悬液混合，得到实验组孢子悬液。
步骤2.2，对照组处理：
将SYBR Green I荧光染料在37℃的温度下避光反应20min，再加入硫代硫酸钠，得到混合物，将该混合物与步骤一中的孢子悬液混合，得到对照组孢子悬液。
步骤三，流式细胞仪检测：
采用流式细胞仪，对步骤二中的实验组孢子悬液和对照组孢子悬液进行检测；流式细胞仪的设定参数同上述步骤三。实验组的结果如图3中的Ⅰ所示，对照组的结果如图3中的Ⅱ所示。
由图3可知，实验组较对照组，峰值向左偏移，即消毒剂氯胺与SYBR GreenI荧光染料确实存在相互作用；实验组的荧光响应值为98111.52，对照组的荧光响应值为116282.01，在消毒剂的作用下，荧光响应值降低了15.6％。由上述分可知，荧光响应值降低的主要原因为消毒剂与真菌孢子DNA相互作用，次要原因为消毒剂与SYBR Green I荧光染料相互作用，其中次要原因大概会造成15％左右的高估误差。
通过上述研究可得出如下结论：消毒剂与真菌孢子DNA之间存在相互作用，因此，采用流式细胞仪进行真菌孢子DNA损伤鉴定，有着充分的理论基础。另外，由于消毒剂与SYBR Green I荧光染料之间也存在相互作用，因此，为了使定量分析的结果更加精准，需要尽量消除细胞内残余消毒剂带来的影响。
根据上述结论，本发明提供了一种真菌孢子损伤鉴定的方法，如图1所示。该方法包括真菌孢子细胞膜损伤鉴定和真菌孢子DNA损伤鉴定，具体为：使用SYBR Green I荧光染料，对真菌孢子进行两次染色，在SYBR Green I染色时加入EDTA，保证染色更为稳定；再使用碘化丙啶对真菌孢子进行染色；在消毒剂处理真菌孢子后，加入硫代硫酸钠，以消除消毒剂带来的不利影响；采用流式细胞仪，实现定量分析真菌孢子细胞膜的损伤程度和真菌孢子DNA的损伤程度。
本发明中：
DRBC培养基的货号HB0290，购自青岛海博公司，用于培养真菌孢子。
EDTA母液的浓度1.5mmol/L，pH值为8.0，EDTA是乙二胺四乙酸二钠，用氢氧化钠调节pH。
碘化丙啶染液为，在100mL DMSO中加入0.016g碘化丙啶，碘化丙啶的终浓度为0.3mM。
磷酸盐缓冲液为，10mmol/L磷酸氢二钠和10mmol/L磷酸二氢钾，pH值为7.2。
SYBR Green I荧光染料的货号S7567，购自赛默飞世尔(ThermoFisherScientific)中国公司，品牌为Invitrogen。
流式细胞仪的型号Accuri C6，购自美国贝克顿-迪金森(Becton Dickinson)公司。
荧光响应值指的是荧光响应曲线最高峰处所对应的横坐标的数值，即荧光响应曲线的峰值。
圈门细胞浓度指的是流式散点图中位于圈门内的孢子的细胞浓度，设定圈门区域的方式采取本领域中常规的圈门设置方式。
遵从上述技术方案，以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。
实施例1：
本实施例提供一种真菌孢子损伤鉴定的方法，该方法包括真菌孢子细胞膜损伤鉴定。该方法的具体包括如下步骤：
本实施例中，真菌孢子具体为木霉(Trichoderma)孢子。
步骤一，制备初染孢子悬液：
步骤1.1，制备未染色的孢子悬液：
真菌孢子培养三周后，用灭菌后的磷酸盐缓冲液打在菌落表面，然后轻轻刮取真菌孢子并将真菌孢子悬浮在磷酸盐缓冲液中，得到粗悬液；采用三层无菌擦镜纸将粗悬液进行过滤，过滤后在8000r/min的转速下离心10min，弃去上清，在沉淀中加入磷酸盐缓冲液吹打重悬，重复上述离心清洗两次，得到沉淀A，用磷酸盐缓冲液将沉淀A重悬后得到孢子悬液。
本实施例中，用于培养真菌孢子的培养基为DRBC培养基；孢子悬液的浓度控制在n×107CFU/mL，其中n的取值范围在0～10之间，浓度控制的具体方法采用血球计数板计数法。
步骤1.2，SYBR Green I初步染色：
在步骤1.1的500μL孢子悬液中加入10μL SYBR Green I荧光染料和EDTA母液，震荡混匀后得到混合物B，EDTA在混合物B中的终浓度为30μM；将混合物B在37℃的温度下，避光染色20min，得到初染孢子悬液。
步骤二，制备复染孢子悬液：
步骤2.1，真菌孢子离心重悬浮：
将步骤1.2的初染孢子悬液，在12000r/min的转速下离心10min，弃去上清，在沉淀中加入磷酸盐缓冲液吹打重悬，重复上述离心清洗两次，得到沉淀C，将沉淀C用磷酸盐缓冲液重悬后得到混合物D。
本实施例中，离心清洗的目的是洗去初染孢子悬液中多余的SYBR Green I荧光染料，避免SYBR Green I荧光染料与后续加入的消毒剂反应。
步骤2.2，设置实验组和对照组，对实验组进行消毒剂处理：
步骤2.2.1，实验组处理：
在步骤2.1的混合物D中加入终浓度为3mg/L的氯胺，在室温静置处理120min后，加入终浓度为0.05M的硫代硫酸钠，得到混合物E1。
步骤2.2.2，对照组处理：
将步骤2.1的混合物D在室温静置120min后，加入终浓度为0.05M的硫代硫酸钠，得到混合物E0。
本实施例中，实验组处理加入硫代硫酸钠的目的是中和真菌孢子细胞中的残余氯胺，避免残余氯胺与二次染色时加入的SYBR Green I荧光染料进行结合，使得最终的结果更为精确。
步骤2.3，SYBR Green I二次染色：
在步骤2.2中的500μL混合物E1和500μL混合物E0中，分别加入10μL的SYBR GreenI荧光染料和EDTA母液，震荡混匀后分别得到混合物F1和混合物F0，EDTA在混合物F1和混合物F0中的终浓度均为30μM；将混合物F1和混合物F0在37℃的温度下，避光染色20min后，得到实验组复染孢子悬液和对照组复染孢子悬液。
步骤三，制备碘化丙啶染色孢子悬液：
在步骤2.3中的500μL实验组复染孢子悬液和500μL对照组复染孢子悬液中，分别加入10μL的碘化丙啶染液，震荡混匀后分别得到混合物G1和混合物G0，碘化丙啶在混合物G1和混合物G0中的终浓度均为6μM；将混合物G1和混合物G0在37℃的温度下，避光染色20min，得到实验组碘化丙啶染色孢子悬液和对照组碘化丙啶染色孢子悬液。
步骤四，定量分析真菌孢子细胞膜损伤：
采用流式细胞仪，对步骤三实验组碘化丙啶染色孢子悬液和对照组碘化丙啶染色孢子悬液分别进行检测；流式细胞仪的设定参数具体为：发射波长488nm，激发波长630nm，进样体积为20μL，进样速度为33μL/min，进样总颗粒小于500个/s，FL1通道的检测阈值设定为600。检测完成后，结果如图4所示，其中，实验组碘化丙啶染色孢子悬液的检测结果如图4B所示，对照组碘化丙啶染色孢子悬液的检测结果如图4A所示。
本实施例中，真菌孢子细胞膜损伤率＝实验组膜受损孢子占比值/对照组膜完整孢子占比值；由图4可知，对照组膜膜完整孢子占比值为99.5％，实验组膜受损孢子占比值为40.4％，通过计算可得真菌孢子细胞膜损伤率为40.6％。
实施例2：
本实施例提供一种真菌孢子损伤鉴定的方法，该方法包括真菌孢子细胞膜损伤鉴定。该方法的具体步骤与实施例1基本相同，区别在于，真菌孢子具体为青霉(Penicillium)孢子。
检测完成后，结果如图5所示，其中，实验组碘化丙啶染色孢子悬液的检测结果如图5B所示，对照组碘化丙啶染色孢子悬液的检测结果如图5A所示。
本实施例中，真菌孢子细胞膜损伤率＝实验组膜受损孢子占比值/对照组膜完整孢子占比值；由图5可知，对照组膜膜完整孢子占比值为98.5％，实验组膜受损孢子占比值为48.1％，通过计算可得真菌孢子细胞膜损伤率为48.8％。
实施例3：
本实施例提供一种真菌孢子损伤鉴定的方法，该方法包括真菌孢子DNA损伤鉴定。该方法具体包括如下步骤：
本实施例中，真菌孢子具体为木霉(Trichoderma)孢子。
本实施例中，步骤一与实施例1的步骤一完全相同，步骤二与实施例1的步骤二完全相同。
本实施例不进行步骤三和步骤四。
步骤五，定量分析真菌孢子DNA损伤：
采用流式细胞仪，对步骤2.3的实验组复染孢子悬液和对照组复染孢子悬液分别进行检测；流式细胞仪的设定参数具体为：发射波长488nm，激发波长570nm，进样体积为20μL，进样速度为33μL/min，样总颗粒小于500个/s；检测完成后，结果如图6和图7所示，其中，实验组复染孢子悬液的检测结果如图6中Ⅰ的和图7B所示，对照组复染孢子悬液的检测结果如图6中Ⅱ的和图7A所示。
本实施例中，真菌孢子DNA损伤率的计算可采取两种方式：
方式1，真菌孢子DNA损伤率＝实验组荧光响应值/对照组荧光响应值。
方式2，真菌孢子DNA损伤率＝实验组圈门细胞浓度/对照组圈门细胞浓度。
由图6可知，实验组荧光响应值为138993，对照组荧光响应值390798，根据方式1计算，真菌孢子DNA损伤率为64.43％；由图7可知，实验组圈门细胞浓度为1.48×105cells/mL，对照组圈门细胞浓度3.82×105cells/mL，根据方式2计算，真菌孢子DNA损伤率为61.01％。
实施例4：
本实施例提供一种真菌孢子损伤鉴定的方法，该方法包括真菌孢子DNA损伤鉴定。该方法的具体步骤与实施例3基本相同，区别在于，真菌孢子具体为青霉(Penicillium)孢子。
检测完成后，结果如图8和图9所示，其中，实验组复染孢子悬液的检测结果如图8中Ⅰ的和图9B所示，对照组复染孢子悬液的检测结果如图6中Ⅱ的和图9A所示。
本实施例中，真菌孢子DNA损伤率的计算方式与实施例3完全相同。
由图8可知，实验组荧光响应值为85487，对照组荧光响应值408069，根据方式1计算，真菌孢子DNA损伤率为79.1％；由图9可知，实验组圈门细胞浓度为1.70×105cells/mL，对照组圈门细胞浓度2.74×105cells/mL，根据方式2计算，真菌孢子DNA损伤率为76.9％。
对比例1：
本对比例提供一种真菌孢子损伤鉴定的方法，该方法包括真菌孢子DNA损伤鉴定。该方法具体包括如下步骤：
本对比例中，真菌孢子具体为青霉(Penicillium)孢子。
本对比例中，步骤一与实施例4的步骤一完全相同。
本对比例中，步骤二与实施例4的步骤二基本相同，区别在于，不进行步骤2.3。
本对比例中，步骤五与实施例4的步骤五基本相同，区别在于，对步骤2.2的实验组混合物E1和对照组混合物E0进行检测。
检测完成后，结果如图10和图11所示，其中，实验组复染孢子悬液的检测结果如图10中Ⅰ的和图11B所示，对照组复染孢子悬液的检测结果如图10中Ⅱ的和图11A所示。
本对比例中，真菌孢子DNA损伤率的计算方式与实施例4完全相同。
由图10可知，实验组荧光响应值为15556，对照组荧光响应值161489，根据方式1计算，真菌孢子DNA损伤率为90.3％；由图11可知，实验组圈门细胞浓度为0.13×105cells/mL，对照组圈门细胞浓度2.66×105cells/mL，根据方式2计算，真菌孢子DNA损伤率为95.1％。
对比例2：
本对比例提供一种真菌孢子损伤鉴定的方法，该方法包括真菌孢子DNA损伤鉴定。该方法具体包括如下步骤：
本对比例中，真菌孢子具体为青霉(Penicillium)孢子。
本对比例中，步骤1.1与实施例4的步骤1.1完全相同。
本对比例中，步骤1.2为，SYBR Green I初步染色，设置实验组和对照组：
步骤1.2.1，实验组处理：
在步骤1.1的500μL孢子悬液中加入SYBR Green I荧光染料和EDTA母液，震荡混匀后得到混合物B1，EDTA在混合物B中的终浓度为30μM；将混合物B在37℃的温度下，避光染色20min，得到实验组初染孢子悬液。
步骤1.2.2，对照组处理：
在步骤1.1的500μL孢子悬液中加入SYBR Green I荧光染料，震荡混匀后得到混合物B0，将混合物B0在37℃的温度下，避光染色20min，得到对照组初染孢子悬液。
本对比例中，不进行步骤二。
本对比例中，步骤五与实施例4的步骤五基本相同，区别在于，对步骤1.2的实验组初染孢子悬液和对照组初染孢子悬液进行检测。
检测完成后，结果如图12和图13所示，其中，实验组初染孢子悬液的检测结果如图12中Ⅱ的和图13B所示，对照组初染孢子悬液的检测结果如图12中的Ⅰ和图13A所示。
由图12可知，实验组荧光响应值大于对照组荧光响应值，由图13可知，实验组圈门细胞浓度明显大于对照组圈门细胞浓度；荧光响应值越高，圈门细胞浓度越大，即被染上色的荧光细胞越多。由上述分析可知，在SYBR Green I染色时加入EDTA，能够提高染色的稳定性和染色效果。
由上述实施例4和对比例1可知：
根据方式1计算，实施例4的真菌孢子DNA损伤率为79.1％；对比例1的真菌孢子DNA损伤率为90.3％，根据方式2计算，实施例4的真菌孢子DNA损伤率为76.9％，对比例1的真菌孢子DNA损伤率为95.1％。
由上述分析可知，根据方式1计算，实施例4和对比例1真菌孢子DNA损伤率相差11.2％，根据方式1计算，实施例4和对比例1真菌孢子DNA损伤率相差18.2％；结合本发明中的研究结果可知，这部分偏差是由于消毒剂与SYBRGreen I荧光染料之间的相互作用，而导致SYBR Green I荧光染料量减少，进而使得染色效果下降。本发明使用SYBR Green I荧光染料进行两次染色，在一定程度上消除了由于SYBR Green I荧光染料减少对染色效果带来的不利影响。
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