具体实施方式

在下面的详细描述中，参考了形成该描述一部分的附图。在附图中，除非上下文另外指出，否则相似的附图标记通常标识相似的部件。在该详细描述、附图和权利要求中所描述的说明性实施例并不意味着是限制性的。在不脱离本文所提出的主题的精神或范围的情况下，能够利用其他实施例并且能够进行其他改变。容易理解的是，能够以各种不同的配置来布置、替换、组合、分离并设计如本文一般性描述的以及在附图中所示出的本公开的多个方面，所有这些都明确地构想并在此作为本公开的一部分。

本教导总体上涉及用于在流式细胞仪中确定颗粒(诸如细胞)的一个或更多个特征并且在一些实施例中使用那些特征来分选颗粒的方法和系统。在下面讨论的实施例中，该方法采用计算机处理器来实现。除非另有说明，以下用于描述本教导的各种术语在本领域中具有其普遍含义。例如，在本文中所使用的术语“荧光团”与其在本领域中的惯常含义一致，即指代能够响应于激发辐射的照射来发射辐射的荧光化学化合物。

所使用的术语“细胞计量术”和“流式细胞计量术”也与其在本领域中的惯常含义一致。特别地，术语“细胞计量术”能够指代用于识别和/或分选或以其他方式来分析细胞的技术。术语“流式细胞计量术”能够指代其中例如能够通过利用荧光标记物来标记并经由辐射激发来检测荧光标记物，从而识别和/或分选或以其他方式分析存在于流体流中的细胞的细胞计量技术。如本文所使用的术语“大约”和“基本上”表示相对于包含数值的特性而言最大变化为10％或5％。

用于确定颗粒(诸如细胞)的特征并且用于分选颗粒的本发明的教导能够以各种不同的方式来实现。能够通过使用各种系统来获得用于做出分选决定的荧光和/或散射数据。在一些实施例中，通过具有多个射频频移子束的光学束来照射颗粒并且根据本教导来收集和分析来自颗粒的荧光以做出分选决定。下面描述了用于从粒子中引发荧光数据的系统的一些示例，其中可以结合本教导，然后是根据本教导的用于分选颗粒的方法和系统的详细描述。

作为示例，图1示意性地描绘了用于进行细胞计量术的系统10，其中能够并入有用于分选颗粒的本教导。系统10能够以三种操作模式来操作。如下面更详细讨论的，在一种操作模式下，能够利用多个激发频率来同时照射处于研究状态的样本，该多个激发频率中的每个能够例如通过使激光束的中心频率移位来获得。更具体地，多个样本位置能够被激光束同时地照射，该激光束通过将参考激光束(在本文中也称为本机振荡器束)与多个射频频移激光束混合来生成，以使得每个样本位置都被参考光束和射频偏移光束之一来照射，以在该位置处激发所关注的荧光团(如果存在)。在一些实施例中，参考光束本身能够经由激光束的射频频移来生成。因此，样本的每个空间位置都能够用不同的拍频“标签”，该拍频对应于参考光束的频率与射频频移光束之一的频率之间的差。换句话说，由荧光团所发射的荧光辐射将对该拍频进行空间编码。能够检测荧光发射，并且能够分析其频率分量以构建样本的荧光图像。在参考光束和射频频移光束激发之后检测由荧光团所发射的荧光辐射可称为使用射频多路复用激发(FIRE)的荧光成像。

在另一操作模式中，样本可以在一个时间间隔内被多个激发频率的激光束连续照射。在一些这种实施例中，能够通过向接收激光束的声光偏转器(AOD)施加随时间变化的驱动信号来获得激发频率。在许多实施例中，激光束的频率在数百太赫兹(THz)范围内，例如为大约300THz至大约1000THz。施加到AOD的驱动信号通常在射频范围内，例如为大约10MHz至大约250MHz。激光束穿过AOD会生成多个衍射光束，每个衍射光束都对应于不同的衍射级。尽管第零级衍射光束相对于输入激光束的频率未显示频移，但是高阶衍射光束相对于输入激光束的频率却显示了对应于驱动信号的频率或其倍数的频移。在一些实施例中，如果使一级衍射光束存在于处于分析状态的样本中，则将其用作用于激发所关注荧光团的激发束，该第一级衍射光束的频率对应于被驱动信号来移位的输入激光束的频率。随着驱动信号随时间变化，一级衍射光束的频率和角移位也变化，由此以允许在不同位置处以不同激发频率来照射样本。能够收集并分析来自每个照射位置的荧光发射(如果有)，以构建样本的荧光图像。

在又一操作模式中，系统10能够操作为通过单个激发频率来同时地照射样本的多个位置，该单个激发频率能够例如通过将激光束的中心频率移位一个射频来生成。例如，样本的水平范围能够由激光束以单个激发频率来照射。所检测的荧光辐射能够用于分析样本(例如细胞/颗粒)的荧光含量。

因此，系统10的一个优点(以下将讨论其他优点)在于，该系统在获取不同模式下的荧光发射数据时提供了显著的灵活性，而无需使用不同的仪器或无需在不同操作模式之间切换时对系统进行任何机械修改。

在某些实施例中，系统包括一个或更多个光源。在一些情况下，光源是窄带光源，其包括但不限于窄波长LED、激光器或者耦接到一个或更多个光学带通滤波器、衍射光栅、单色器或组合产生窄带照射光的其任何组合的宽带光源。在某些情况下，光源是单波长激光器，诸如单波长二极管激光器(例如，488nm激光器)。在一些实施例中，本主题系统包括单个光源(例如，激光器)。在其他实施例中，本主题系统包括两个或更多个不同的光源，诸如3个或更多个不同的光源，诸如4个或更多个不同的光源，并且包含5个或更多个不同的光源。例如，系统可以包括输出第一波长的第一光源(例如，激光器)和输出第二波长的第二光源。在其他实施例中，系统包括输出第一波长的第一光源、输出第二波长的第二光源和输出第三波长的第三光源。

每个光源的波长可以为300nm至1000nm，诸如为350nm至950nm，诸如为400nm至900nm，并且包含450nm至850nm。在某些实施例中，光源的波长对应于一个或更多个荧光团的吸收最大值(如下所述)。例如，光源所输出的光的波长可以为280-310nm、305-325nm、320-350nm、340-375nm、370-425nm、400-450nm、440-500nm、475-550nm、525-625nm、625-675nm以及650-750nm中的一个或更多个。在某些实施例中，每个光源所输出的光的波长选自348nm、355nm、405nm、407nm、445nm、488nm、640nm和652nm。

系统10包括生成激光束14的激光辐射源12。作为示例，激光束的频率能够为大约1000THz至大约300THz，其对应于为大约300nm至大约1000nm的真空波长。激光束的束直径(例如，当采用高斯激光束时的束腰)能够为例如大约0.1mm至大约10mm。在不失一般性的情况下，在该实施例中，激光器12发射束直径为大约1mm的488nm波长的辐射。

激光束的频率能够基于系统预期的特定应用来选择。具体地，如下面更详细讨论的，激光频率能够适合于例如经由吸收辐射来激发所关注的荧光团的电子跃迁，以使得荧光团发射较低频率的荧光辐射。能够采用多种激光源。这种激光源的一些示例包含但不限于由美国加利福尼亚州圣克拉拉市的Coherent公司销售的Sapphire 488-SF、Genesis MX-488-1000-STM(Coherent公司)、OBIS 405-LX(Coherent公司)、由美国加利福尼亚州萨克拉门托市的Vortran激光技术公司销售的Stadus 405-250，以及美国加利福尼亚州尔湾的理波公司(Newport Corporation)的LOC-660-110。在不影响一般性的情况下，在本实施例中，假定激光束在垂直于其传播方向的平面中具有高斯强度分布。

镜16接收激光辐射束14，并且经由反射来将激光束引导到声光偏转器(AOD)18。在该实施例中，将AOD 18安装在可调节的立柱保持安装件(A)上，这允许AOD绕垂直于束14的传播方向的轴线来旋转。在控制器21的控制下操作的直接数字合成器(DDS)20能够将一个或更多个驱动信号施加到AOD 18。作为示例，在一些实施例中，这些驱动信号能够跨越大约50MHz至大约250MHz的频率范围。例如，施加到AOD的驱动信号可以为大约55MHz至大约255MHz，诸如为大约60MHz至大约200MHz，诸如为大约65MHz至大约175MHz，诸如为大约70MHz至大约150MHz，并且包含大约75MHz至大约125MHz。在一些实施例中，驱动信号可以通过为大约0.1MHz至大约4MHz的频率来彼此分离。例如，驱动信号可以通过为大约0.2MHz至大约3.9MHz频率来彼此分离，诸如为大约0.3MHz至大约3.8MHz，诸如为大约0.4MHz至大约3.7MHz，诸如为大约0.5MHz至大约3.6MHz，并且包含大约1MHz至大约3.5MHz。在该实施例中，电子功率放大器17放大由DDS 20所生成的射频信号以应用于AOD 18。

在其中利用多个激发频率来同时照射样本的操作模式中，RF梳形生成器20将多个RF驱动信号同时施加到AOD 18。作为示例，同时施加的RF驱动信号的数量能够为大约20至大约200。激光束与驱动信号的相互作用导致生成多个角度分离的激光束，每个激光束具有对应于驱动信号之一相对于由激光器12产生的激光束的频率的频移。不受任何特定理论的限制，在AOD中，压电换能器能够在晶体(例如，石英晶体)中生成射频声子，并且通过这种射频声子的激光束的光学声子的散射能够导致生成频移激光束。这些频移束22中之一在本文中称为“本机振荡器”(LO)波束，并且其余的频移束24在本文中称为“RF梳形束”。频移束的角间距能够为例如大约1毫弧度至大约100毫弧度。例如，频移束的角间距可以为2毫弧度至大约95毫弧度，诸如为3毫弧度至大约90毫弧度，诸如为4毫弧度至大约85毫弧度，诸如为5毫弧度至大约80毫弧度，并且包含10毫弧度至大约75毫弧度。

LO和RF梳形束穿过透镜26，该透镜在该实施例中是具有约50mm焦距的凸透镜。在穿过透镜26之后，LO激光束被镜28拦截，该镜将LO束重定向到不同的方向(在该实施例中是与LO束的原始传播方向基本正交的方向)。镜28相对于RF梳形束来定位为使得这些束错过镜28并且传播到透镜30(该透镜在该实施例中具有200mm的焦距)。以这种方式，将LO束和RF梳形束沿着不同的传播方向来引导。以上面所公开的方式使用反射镜28允许利用单个AOD来生成LO束和RF梳形束，并且以下面讨论的方式将它们组合以生成用于照射样本的激发束。使用单个AOD而非多个AOD(例如，两个AOD，一个用于生成LO束并且另一个用于生成RF梳形束)，简化了系统的设计，并且还允许以多种不同的操作模式来高效使用该系统，如下面更详细讨论的。

在一些实施例中，在与RF梳形束重新组合之前，修改了LO束的束轮廓。例如，可以在空间维度、束形状、强度、束的空间分布或它们的任意组合中来调整(增加或减小)LO束的束轮廓。在某些实施例中，LO束的束轮廓的空间维度被修改。例如，可以将束轮廓调整为在一个或更多个维度上(诸如沿着与流束的纵向轴线正交的轴线)伸长束轮廓。在根据这些实施例的一个示例中，束轮廓的空间维度(例如，在一个或更多个维度上)可以增加1％或更多，诸如2％或更多，诸如3％或更多，诸如5％或更多，诸如10％或更多，诸如25％或更多，诸如50％或更多，诸如75％或更多，诸如90％或更多，诸如1.5倍或更多，诸如2倍或更多，诸如3倍或更多，并且包括5倍或更多。在根据这些实施例的另一示例中，束轮廓的空间维度(例如，在一个或更多个维度上)可以减小1％或更多，诸如2％或更多，诸如3％或更多，诸如5％或更多，诸如10％或更多，诸如25％或更多，诸如50％或更多，诸如75％或更多，诸如90％或更多，诸如1.5倍或更多，诸如2倍或更多，诸如3倍或更多，并且包括5倍或更多。

在其他实施例中，LO束的束形状被修改。例如，束形状可以被修改为在一个或更多个维度上伸长束轮廓。在某些情况下，LO束的束形状在垂直于LO束的传播方向的平面中伸长。在某些实施例中，LO束轮廓的形状从圆形束轮廓改变成椭圆形束轮廓，该椭圆形束轮廓在与流的纵向轴线正交的轴线上伸长。在其他实施例中，LO束轮廓的形状从圆形束轮廓改变成矩形束轮廓，该矩形束轮廓在与流的纵向轴线正交的轴线上具有长维度。在另外的其他实施例中，LO束的强度被修改。例如，LO束的强度可以增加诸如1％或更多，诸如2％或更多，诸如3％或更多，诸如5％或更多，诸如10％或更多，诸如25％或更多，诸如50％或更多，诸如75％或更多，诸如90％或更多，诸如1.5倍或更多，诸如2倍或更多，诸如3倍或更多，并且包含5倍或更多。在某些实施例中，将LO束的强度修改为匹配RF梳形束的强度。例如，LO束的强度可以与RF梳形束的强度相差10％或以下，诸如9％或以下，诸如8％或以下，诸如7％或以下，诸如6％或以下，诸如5％或以下，诸如4％或以下，诸如3％或以下，诸如2％或以下，诸如1％或以下，诸如0.01％或以下，并且包含LO束的强度与RF梳形束的强度相差0.001％或以下。在某些情况下，LO束和RF梳形束的强度是相同的。

在其他实施例中，束轮廓的空间分布也可以被修改。例如，可以将LO束修改为使得LO束的强度在一个或更多个维度上不再是高斯分布。例如，可以将LO束修改为沿着与流的纵向轴线平行的第一轴线具有高斯分布，并且沿着与流的纵向轴线正交的第二轴线具有非高斯分布。

可以采用任何光束整形协议来修改LO束的束轮廓，其包括但不限于折射和衍射光束整形协议。在一些实施例中，LO束被顶帽式光束整形器修改。

在该实施例中，LO束传播到另一凸透镜32(该凸透镜在该实施例中具有大约200mm的焦距)。透镜26和透镜32的组合放大并准直LO束，以便适当地填充顶帽式光束整形器34的后孔。更具体地，LO束22穿过透镜32并被镜33和35反射到顶帽式光束整形器34。

顶帽式光束整形器34将高斯LO束的相位前沿整形为使得能够形成顶帽强度轮廓。更具体地，离开顶帽式光束整形器的LO激光束22'被分束器44反射，并且被透镜46(该透镜在此实施例中具有100mm的焦距)聚焦到中间像平面48上。中间像平面48上的激光束在垂直于束的传播方向的平面中沿着水平方向具有顶帽强度轮廓。类似于AOD 18，在该实施例中，将分束器44安装在可调整的立柱保持安装件(B)上。在该实施例中，顶帽式光束整形器生成顶帽束轮廓，其中辐射的偏振沿着束的顶帽方向(在该实施例中为沿着水平方向)是基本均匀的。

能够采用各种顶帽式光束整形器。作为示例，衍射光学元件或具有非球面表面的折射光学元件能够用于产生具有适当空间相位前沿的束，这些束在被透镜聚焦后将在透镜的焦平面处产生顶帽轮廓图样。对于这样的顶帽式光束整形器而言存在多种形状因子，并且在本教导的各种实施例中，该方法的多种实现方式可用于在样本处创建适当的LO束形状。例如，标题为“将激光束转换为准直平顶束的折射光学系统”的美国专利6,295,168和标题为“矩形平顶束整形器”的美国专利7,400,457，这两者的全部内容均通过引用并入本文，其公开了能够在根据本教导的一些实施例的系统中用作平顶束整形器的束整形系统。能够采用的市售顶帽式光束整形器的示例包含，例如，由加拿大拉钦的Osela公司销售的DTH-1D-0.46deg-4mm。

如以下更详细讨论的，使用束整形器沿着水平方向拉伸LO束提供了许多优点。例如，它能够确保LO束和RF梳形束的组合以基本上相似的照射强度来照射多个样本位置，以便在整个样本位置中都匹配LO和RF梳形束的强度，由此创建具有高调制深度的荧光信号的强度幅度调制。在缺乏这种强度匹配的情况下，成像系统可能具有小的视野并且可能没有利用驱动AOD的所有频率(像素)。由于荧光信号的调制深度在系统重建样本荧光图像的能力中起着重要作用，因此在所有像素处激发拍频的均匀高调制深度对于系统的操作而言是特别有利的。此外，能够通过控制直接数字合成器的输出(例如，通过采用控制器21)来调整施加到AOD以生成RF梳形束的电子信号的幅度，以便均衡RF梳形束以使得它们的强度等于在RF梳形束和LO束重叠的所有空间位置上的LO束的强度。该特征提供的优点在于，其确保了荧光辐射的强度幅度调制的高调制深度。

再次参照图1，RF梳形束24经由透镜26和30的组合来成像到中间像平面38上。更具体地，RF梳形束24穿过透镜26并且错过镜28以到达透镜30，这将RF梳形束24经由镜40和42来引导到中间像平面38。

图2示意性地描绘了示例性数量的RF梳形束在中间像平面38中的分布(在不失一般性的情况下，出于说明目的，将RF梳形束的数量选定为6(标记为RF1、RF2、RF3、RF4、RF5、RF6)，但也能够采用其他数字)。如图2中所示，在中间像平面38中，RF梳形束24沿着水平方向彼此在空间上分离。在其他实施例中，RF梳形束24的两个或更多个可以部分地重叠。因此，透镜26和30的组合将在角度上分离的RF梳形束转换成跨越水平范围的一组在空间上分离的束。

再次参照图1，如上讨论的，分束器44接收离开顶帽式光束整形器34的激光束22'，并将该束反射到透镜46，该透镜将束聚焦在中间像平面48上，LO束在该中间像平面上呈现出顶帽束轮廓。分束器还从中间像平面38接收RF梳形束24，并且允许RF梳形束从中穿过。透镜46将RF梳形束24聚焦在中间像平面48上，来与具有顶帽束轮廓的LO束组合以生成组合束49。

作为示例，图3示意性地描绘了组合束49在垂直于其传播轴线的平面中的一个示例性轮廓。组合束的强度轮廓是将顶帽LO束(由正方形示意性示出)的强度轮廓与RF梳形束24(分别由圆形之一示意性示出)的强度轮廓相叠加来生成的。如下面更详细地讨论的，LO束和RF梳形束的这种叠加沿着水平范围提供了多个拍频，每个拍频都对应于沿着该水平范围的一个空间位置。在照射样本的水平范围时，从样本位置发射的荧光辐射经由振幅调制来编码与照射该位置的辐射相关联的拍频。

再次参照图1，凸透镜50(在该实施例中为200mm透镜)和物镜52(在该实施例中安装在可调整的立柱保持安装件C上)形成望远镜，以用于将中间平面48处的像中继到流过流通池54的样本上。在该实施例中，镜56将组合束49反射到透镜50，并且二向色镜58在组合光束穿过透镜50后将该组合光束朝向物镜52反射。

如图4中示意性地示出的，组合束49同时照射流过流通池54的样本62的多个空间位置60。因此，每个位置60都被RF梳形束之一与顶帽形LO激光束的一部分的重叠来照射。在这些空间位置处，辐射将激发样本中所关注的荧光团(如果存在)。更具体地，在该实施例中，LO束和RF梳形束在多个样本位置60处例如经由引起其电子跃迁到激发电子态，来同时地激发荧光团。

在一些实施例中，样本能够包括其中夹带多个细胞的流动流体。在一些情况下，能够利用一种或更多种荧光标记物(荧光团)来标记细胞。荧光标记物的一些示例包括但不限于荧光蛋白(例如，GFP、YFP、RFP)、利用荧光团(例如，异硫氰酸荧光素)(FITC)来标记的抗体、藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白(APC)、核酸染色剂(例如，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、SYTO16、碘化丙啶(PI)、细胞膜染色剂(例如，FMI-43)和细胞功能染料(例如，Fluo-4、Indo-1)。在其他情况下，存在于细胞中的内源性荧光团能够用于引发来自细胞的荧光辐射。如下面更详细地讨论的，这种外源性或内源性荧光团响应于照射辐射从而经受电子激发并且发射荧光辐射(其频率通常低于激发频率)，该荧光辐射被收集并分析。

作为说明并且不限于任何特定理论，图5示出了假想的能级，该能级对应于荧光团的基态电子态A以及两个电子激发的电子态B和C。能够经由吸收辐射能来将荧光团从其基态电子态(A)激发到激发电子态(B)。然后，荧光团能够例如经由由荧光团的振动模式来介导的无辐射跃迁，从而驰豫成较低的激发态B。荧光团还能够经由光学跃迁来从较低电子态C弛豫到基态，由此发射频率小于激发频率的荧光辐射。应当理解，提供该假想示例仅是出于说明目的，并且不指示能够发射荧光辐射的唯一机制。

在许多情况下，荧光团能够吸收从基态激发到电子激发态的一定频率范围内的电磁辐射。作为说明，图6示出了与图5相结合讨论的假想荧光团的吸收曲线。在根据本教导的实施例的一个实现方式中，能够将LO频率选定为与对应于所关注荧光团的峰值吸收的频率相同。射频频移光束能够具有与由其各自拍频的峰值吸收分离的频率。通常，这些频率分离与荧光团的吸收带宽相比是小的，从而避免了激发频率的任何降低。作为示例并且仅作为说明，虚线A和B示意性地描绘了LO束和RF梳形束之一的频率(为了便于描述，未按比例绘制附图)。LO激光束和所描绘RF梳形束之一这两者同时地照射样本的空间位置，这导致荧光辐射在与LO梳形束频率与RF梳形束频率之间的差相对应的拍频处表现出幅度调制。

再次作为说明并且不限于任何特定理论，经由LO束和RF梳形束之一的同时照射来施加到荧光团的电场能够在数学上定义为：

其中E_com表示组合束的电场，

E_RF表示与RF梳形束之一相关联的电场的幅度，

E_LO表示与LO束相关联的电场的幅度，

表示由激光器12所生成的激光束的频率，

表示与RF梳形束相关联的频移，以及

cow表示与LO束相关联的频移。

响应于LO束和RF梳形束的电场的叠加来发射的荧光辐射的强度，将在对应于(ω_RF-ω_LO)的拍频处表现出调制。因此，从由LO束和RF梳形束之一的叠加来照射的样本中的每个空间位置所发出的荧光辐射，在与LO束相关联的射频偏移和与照射该空间位置的RF梳形束相关联的射频偏移之间的差相对应的拍频处表现出调制。

由于荧光发射过程需要有限的时间(对于常见的有机荧光团通常为1-10纳秒)，因此如果激发拍频太高，则发射的荧光将不会表现出高调制深度。因此，在许多实施例中，将激发拍频选定为远小于1/τ_f，其中τ_f是荧光团的特征荧光寿命。在一些情况下，激发拍频可以比1/τ_f小1％或更多，诸如2％或更多，诸如3％或更多，诸如5％或更多，诸如10％或更多，诸如25％或更多，诸如50％或更多，诸如75％或更多，诸如90％或更多，诸如1.5倍或更多，诸如2倍或更多，诸如3倍或更多，并且包含5倍或更多。例如，激发拍频可以比1/τ_f小0.01MHz或更多，诸如0.05MHz或更多，诸如0.1MHz或更多，诸如0.5MHz或更多，诸如1MHz或更多，诸如5MHz或更多，诸如10MHz或更多，诸如25MHz或更多，诸如50MHz或更多，诸如100MHz或更多，诸如250MHz或更多，诸如500MHz或更多，并且包含750MHz或更多。在一些实施例中，将光电检测器配置为检测来自被辐照的样本的光(例如，诸如荧光之类的发光)。在一些实施例中，光电检测器可以包括一个或更多个检测器，诸如2个或更多个检测器，诸如3个或更多个检测器，诸如4个或更多个检测器，诸如5个或更多个检测器，诸如6个或更多个检测器，诸如7个或更多个检测器，并且包括8个或更多个检测器。可以采用任何光检测协议，其包括但不限于有源像素传感器(APS)，象限光电二极管、图像传感器、电荷耦合器件(CCD)、增强电荷耦合器件(ICCD)、发光二极管、光子计数器、辐射热计、热释电检测器、光敏电阻、光伏电池、光电二极管、光电倍增管、光电晶体管、量子点光电导体或光电二极管及其组合，以及其他光电检测器。在一些实施例中，将所关注的光电检测器配置为检测350nm至1200nm的光，诸如450nm至1150nm，诸如500nm至1100nm，诸如550nm至1050nm，诸如500nm至1000nm，并且包含400nm至800nm。在某些实施例中，将光电检测器配置为检测在发光的最大发射处的光，该最大发射处诸如为395nm、421nm、445nm、448nm、452nm、478nm、480nm、485nm、491nm、496nm、500nm、510nm、515nm、519nm、520nm、563nm、570nm、578nm、602nm、612nm、650nm、661nm、667nm、668nm、678nm、695nm、702nm、711nm、719nm、737nm、785nm、786nm或805nm。

在一些实施例中，能够以各种不同的方式，例如沿着垂直于激发束传播方向的光学路径，来收集由样本发射的荧光辐射。在其他实施例中，在外延方向上检测荧光辐射。在被组合束49激发之后检测由一个或更个荧光团发射的荧光辐射可被称为使用射频多路复用激发(FIRE)的荧光成像。

再次参照图1，在该实施例中，由存在于被照射样本中的一个或更多个荧光团发射的荧光辐射穿过物镜52，并透射穿过二向色镜58到达光电检测器64。更具体地，在该实施例中，透镜65将透射通过二向色镜58传输的荧光辐射聚焦到狭缝孔66上。透射通过狭缝的荧光辐射穿过荧光发射滤波器68到达光电检测器64。设置在光电检测器前面的狭缝孔66(或在下文讨论的其他实施例中为光学滤波器)基本上允许从样本的特定平面发射的荧光辐射通过，同时拒绝平面外的荧光发射。此外，荧光发射滤波器68(例如，带通滤波器)允许荧光辐射通向光电检测器64，同时基本上阻止其他频率的辐射通过。

光电检测器64具有足够的RF带宽，以检测和传输来自整个拍频范围的信号。合适的光电检测器的一些示例包括但不限于光电倍增管、雪崩光电二极管、PIN光电二极管和混合光电检测器等。作为示例，在一些实施例中，能够采用由Hamamatsu Corporation销售的光电倍增管(例如，R3896、R10699、H11462)。响应于对接收到的荧光辐射的检测，光电检测器生成信号(例如，在该实施例中为模拟信号)。

作为另一示例并且参照图7A，由样本响应于LO束和空间分离的RF梳形束的同时照射来发射的荧光辐射穿过物镜52和二向色镜58，以经由透镜100耦合到从近端102a延伸到远端102b的多模光纤102上。更具体地，光纤102的近端102a定位在透镜100的焦平面附近以便接收荧光辐射。耦合到光纤的远端102b的外耦合透镜104使离开光纤的辐射准直。

在许多情况下，照射样本的激发辐射激发了能够具有足够宽辐射吸收光谱的多个荧光团(例如，有机荧光团)，以使得激发频率落入样本中多个荧光团的吸收光谱之内。然后每个荧光团将发射不同频率的荧光辐射。在不失一般性的情况下并且出于说明目的，在该实施例中，检测系统包含四个光电倍增管106、108、110和112，其中的每个都接收准直辐射的一部分，该准直辐射对应于在被照射样本中被激发辐射激发的四个荧光团之一所发射的荧光辐射。更具体地，二向色镜114将由荧光团之一以第一频率发射的荧光辐射反射到光电倍增管106，同时允许其他频率的荧光辐射通过。另一二向色镜116将不同荧光团以不同的第二频率发射的荧光辐射反射到光电倍增管108，同时允许包含由又一荧光团以第三频率发射的荧光辐射的其余辐射到达第三二向色镜118，其将该荧光辐射反射到光电倍增管110。二向色镜118允许包含由第四荧光团以第四辐射频率发射的荧光辐射的其余辐射通过以到达光电倍增管112。

分别以四个荧光频率之一为中心的多个带通滤波器120、122、124和126分别放置在光电倍增管106、108、110和112的前面。以下文讨论的方式来分析由光电倍增管中的每个检测到的信号，以生成各自荧光频率处的荧光图像。在一些实施例中，能够使用单个光电检测器(例如，单个光电倍增管)，而非使用多个光电检测器，来检测荧光辐射(例如，对应于来自单个荧光团的发射的荧光频率)。

在一些实施例中，当样本流过流通池时，样本的不同水平行被照射，并且与每个水平行相关联的荧光辐射被一个或更多个光电检测器(诸如光电倍增器106、108、110和112)检测。

图7B示意性地描绘了与以上结合图7A讨论的检测系统类似的检测系统，不同之处在于该检测系统不是使用光纤，包含来自穿过二向色镜58的多个荧光团的荧光发射的荧光辐射在自由空间中传播到达光电倍增管106、108和112。更具体地，透镜100将荧光辐射聚焦到设置在透镜100与104之间的孔126上，其中该孔能够拒绝散焦辐射。透镜104使穿过孔的辐射准直，其中准直后的辐射以以上结合图7A讨论的方式分布在光电倍增管之间。

在一些实施例中，能够将系统10配置为使用激发辐射来提供(在缺乏样本的流通池的)样本的暗场图像和明场图像。作为示例，图7C示意性地描绘了系统10的一个实施例，该系统包括分别用于检测样本的暗场图像和明场图像的两个检测臂200和202。

更具体地，将检测臂200定位成垂直于激发辐射的传播，以便接收由流过流通池的样本来散射的一部分激发辐射。检测臂200包括两个透镜204和206，其将由样本散射的激发辐射的至少一部分共同引导到由透镜204来对向到光电倍增管208上的立体角。更具体地，透镜204使接收到的散射辐射准直，并且透镜206将准直后的散射辐射聚焦到光电倍增管208上。在此实施例中，将适当的带通滤波器210设置在光电倍增管208的前面，以允许具有所期望频率的辐射通过并到达光电倍增管208，同时阻止不想要的频率处的辐射。光电倍增管208的输出能够以本领域已知的方式来处理，例如，通过诸如下文讨论的分析模块来生成暗场图像。

检测臂202继而包括两个透镜212和214，其中透镜212在向前方向上(基本上沿着进入流通池54的激发辐射的传播方向)使离开流通池的激发辐射准直，并且透镜214将准直后的辐射聚焦到光电检测器216上。设置在光电检测器前面的适当的滤波器218(例如，带通滤波器)允许在将激发频率传输到光电检测器216的同时基本上阻止其他辐射频率。能够以本领域中已知的方式来处理光电检测器216的输出，以生成流通池的明场图像。

因此，检测臂200检测被流过流通池的流体所散射的激发辐射，并且检测臂202检测传输穿过流通池的激发辐射。当没有流体流过流通池时，由光电倍增管208检测到的信号较低，并且由光电检测器216检测到的信号较高，这是因为穿过流通池的激发辐射很少发生散射，并且因此大百分比的激发辐射，并在某些情况下为所有的激发辐射都传输通过流通池。相反地，流体样本流过流通池能够导致由光电倍增管208生成的信号由于样本对一部分激发辐射的散射从而增加，并且由光电检测器216生成的信号因为传输通过流通池的激发辐射水平从而减小。

作为另一示例并参照图7D，在根据本教导的系统的一个实施例中，在基本正交于激发辐射传播方向的方向上相对于流通池54来定位的检测臂220a，包括用于检测由样本中多个荧光团发射的荧光辐射和由样本散射的激发辐射的光电检测器。更具体地，检测臂220包括透镜222和224，该透镜将荧光辐射以及散射后的激发辐射引导到拒绝未聚焦辐射的孔226上。透镜228使穿过孔的辐射准直。二向色镜230将激发频率处的辐射的一部分反射到光电倍增管232上，以用于检测暗场图像，同时允许荧光辐射穿过。设置在光电倍增管232前面的适当的滤波器232a(例如，带通滤波器)允许激发频率处的辐射通过并到达光电倍增管232，同时阻挡不想要的辐射频率。另一二向色镜234将由荧光团以第一频率发射的荧光辐射反射到光电倍增管236上，同时允许由其他荧光团以其他频率发射的荧光辐射穿过。另一二向色镜238将由另一荧光团以第二频率发射的荧光辐射反射到光电倍增管240上，同时允许由又一荧光团以第三频率发射的荧光辐射穿过，其中该又一荧光团的荧光辐射被光电倍增管242检测。类似于先前的实施例，多个滤波器236a、240a和242a分别设置在光电倍增管236、240和242的前面，以允许传输所期望频率的辐射，同时基本上阻止不想要的辐射频率。

继续参照图7D，根据本教导的系统的这种实现方式还包括另一检测臂220b，该另一检测臂用于例如以结合图7C讨论的方式来生成明场图像。更具体地，检测臂202包括两个透镜212和214，其将光聚焦到光电检测器216上以用于生成激发辐射的明场图像。将滤波器218(例如，带通滤波器)放置在光电检测器216的前面，以允许激发辐射通过并到达检测器，同时拒绝不想要的辐射频率。

再次参照图1以及图8，在该实施例中，跨阻放大器70能够耦合到光电检测器64(或结合图7A-7D讨论的光电检测器中的每个)的输出，以放大由光电检测器所生成的信号。数据分析单元72(在本文中也称为分析模块或分析器)接收放大后的信号并分析该信号以生成样本的荧光图像。数据分析单元72能够以硬件、固件和/或软件来实现。作为示例，用于分析检测到的荧光数据的方法能够存储在分析模块的只读存储器(ROM)单元中，以在处理器的控制下被访问以分析接收到的荧光信号。

如下面更详细地讨论的，该分析方法确定了随时间变化的光电检测器的输出中的频率分量，并且基于那些频率分量来构建样本的荧光图像。能够采用多种方法来确定光电检测器的输出的频率内容。这样的合适方法的一些示例包含但不限于傅立叶变换、锁定检测、滤波、I/Q解调、零差检测和外差检测。

作为示例，图9A和9B示出了能够由分析模块72执行以生成样本的荧光图像的示例性分析。在块(1)处，将模拟放大信号进行数字化以生成数字化荧光数据。在块(2)处，选定数字化数据的适当部分(长度)以用于分析。例如，能够选择与样本的被照射行(在本文中也称为帧)相对应的荧光数据以用于分析。替代地，能够选定数据帧的一部分以用于分析。

在块(3)处，执行所选定数据的傅立叶变换。作为示例，在一些实施例中，执行数据的快速傅立叶变换(FFT)以确定数据的频率分量。在一些这样的实施例中，FFT的窗口能够对应于为数据采集所选择的频率。例如，对于256MHz的采样率，256个样本能够产生彼此相隔1MHz的频率窗口，例如从DC到128MHz。FFT分析提供与拍频对应的频率，在该拍频处发射的荧光发射表现出幅度调制。

继续参照图9A和9B，在该实施例中，在块(4)处，通过获得该频率分量的实部和虚部的平方和的平方根来计算存在于FFT数据中的每个频率分量的幅度的量度。由于每个频率分量对应于用于从样本的特定位置引发荧光辐射的拍频之一，因此该频率分量的幅度的量度能够为沿着样本的水平行与该频率分量相关联的位置来提供像素值。以这种方式，能够确定样本的水平行的图像的像素值。当样本在竖直方向上流过流通池时，对于针对样本的每个水平行所获得的荧光数据而言能够重复以上块。像素值能够用于构建荧光图像(块5)。

如上所述，能够使用本领域中已知的技术并且根据本教导，以硬件、固件和/或软件来实现分析模块72。作为示例，图10示意性地描绘了分析器72的一个示例性实现方式，其包括模数转换器1002，该模数转换器用于从放大器70接收放大后的荧光信号并且将该信号进行数字化以生成数字化的荧光数据。分析模块还包括中心处理单元(CPU)1004，该中心处理单元用于控制分析模块的操作并且包括执行计算和逻辑操作。分析模块还包含ROM(只读存储器)1006、RAM(随机存取存储器)1008和永久存储器1010。通信总线1012有助于分析模块的各个部件之间的通信，包含有助于CPU 1004与其他组件之间的通信。存储器模块能够用于存储用于分析荧光数据和分析结果的指令。作为示例，在一些实施例中，用于数据分析的指令，例如用于执行结合图9A和9B讨论的上述块的指令，能够存储在ROM 1006中。CPU能够采用存储在ROM 78中的指令来在存储在RAM 1008中的数字化荧光数据上操作，以生成样本的荧光图像(例如，一维或二维图像)。CPU能够实现将荧光图像存储在永久存储器1010中(例如，在数据库中)。如图10中示意性地示出，分析模块能够可选地包括图形处理单元(GPU)1004’，该图形处理单元用于从接收到的数据(例如，荧光数据)中执行像素强度和其他量的计算。

在一些实施例中，能够使用锁定检测技术来实现对由光电检测器生成的输出信号的频率解调。作为示例，参照图11A和11B，在一个这样的实施例中，将放大后的荧光信号数字化(块1)，并且生成数字化荧光信号的多个副本(块2)，其中数字化副本的数量(N)对应于与RF梳形束相关联的频率的数量。将信号的每个数字化副本与其频率对应于拍频的正弦波和余弦波相乘以生成多个中间信号(块2)，该拍频等于RF梳形束之一的频率和LO束的频率之差。每个中间信号都穿过低通滤波器(块3)，该滤波器的带宽等于RF梳形频率之间的频率间隔的一半。

对于与RF梳形频率之一对应的每个拍频而言(换句话说，对于与被照射样本的空间位置相对应的每个频率而言)，获得了对应于该频率的两个滤波后中间信号的平方和的平方根，以作为与由具有该频率的LO束和RF梳形束来照射的样本位置对应的图像像素的幅度的量度(块4)。在一些实施例中，能够以以上讨论的方式来处理对应于相同拍频(即，对应于相同样本位置)的多个荧光数据信号，并且能够对像素值求平均以便获得平均像素值。

当样本在竖直方向上流过流通池时，对于针对样本的每个水平行所获得的荧光数据而言能够重复以上块。像素值能够用于构建荧光图像(块5)。

以上锁定检测方法能够在软件、固件和/或硬件中实现。作为示例，在一个实施例中，以上锁定检测方法能够使用现场可编程门阵列(FPGA)来实现，特别是在如果使用了六个以上的频率的情况下。在一些实施例中，能够采用多频锁定放大器，诸如由瑞士苏黎世的Zurich Instruments销售的HF2L-MF多频放大器。

作为另外的示例，在一些实施例中，能够通过采用基于带通滤波器的图像解调技术来实现对所检测到荧光信号的频率解调。通过参照图12A和12B，在这种频率解调方法的一个实施例中，将由光电检测器64和放大器70所提供的荧光信号进行数字化(块1)，并且生成了数字化信号的多个副本(块2)，其中数字化副本的数量(N)对应于与RF梳形束相关联的频率的数量。通过使该信号穿过带通滤波器来对数字化荧光信号的每个副本进行滤波，该带通滤波器的中心是与RF梳形束之一相关联的拍频(即，与样本的特定位置相关联的拍频)(块3)。更具体地，每个带通滤波器都以N个拍频之一为中心，并且具有等于相邻拍频之间的频率间隔的一半的带宽。

采用在每个拍频处的包络检测器针对每个水平线来估计与该频率相对应的每个像素的幅度(块4)。在一些情况下，通过处理对应于与该像素相关联的样本位置的多个荧光信号来获得的与像素相对应的多个像素值进行平均以获得平均像素值。当样本在竖直方向上流过流通池时，对于针对样本的每个水平行所获得的荧光数据而言能够重复以上块。该像素值能够用于构建样本的一维或二维荧光图像(块5)。

分析模块还可以配置为接收并处理明场和暗场图像数据。例如，参照图7C和图8，分析模块72还可以配置为从光电检测器208和218接收暗场和明场图像数据以生成暗场和明场图像。例如，参照图10，用于例如以本领域已知的方式来生成暗场和明场图像的指令能够存储在永久存储器82中。处理器76能够采用这些指令来处理接收到的暗场和明场图像数据以生成图像。分析模块还可以配置为通过叠加例如荧光图像以及明场和暗场图像中之一或这二者来生成合成图像。

由根据本教导的系统(诸如，以上系统10)来生成的荧光图像以及明场和暗场图像能够用于各种不同方式。例如，能够对荧光图像进行积分以产生与常规流式细胞仪所产生的数据相当的值。还能够分析荧光图像以确定产生该图像的荧光探针的位置(例如，能够确定探针是否是细胞核、细胞质、定位于细胞器还是在细胞膜外部)。此外，在一些应用中，通过检测全部来自相同细胞的不同荧光带来获得的多个荧光图像，能够用于确定细胞内多个荧光探针的共定位程度。附加地，可以使用多色荧光、明场和暗场图像来分析细胞形态、细胞信号传导、内在化、细胞间相互作用、细胞死亡、细胞周期和斑点计数(例如，FISH)等。

如上所述，系统10能够以至少三种不同的模式来操作。在以上讨论的一个模式中，LO束和多个RF梳形束同时地照射样本的一部分(例如，沿着水平范围设置的位置)，并且检测并分析从被照射位置发射的荧光辐射以便构建样本的荧光图像。在另一操作模式中，将含有驱动信号的频率斜坡施加到AOD而非将多个RF驱动信号同时地施加到AOD，以使得激光束的频率从起始频率(f₁)开始随时间变化到最终频率(f₂)。对于频率斜坡中的每个驱动频率而言，激光束的频率都会被该驱动频率移位，并且样本会被频移后的激光束照射，以从样本中发出荧光辐射。换句话说，在该模式下，系统被操作以通过在时间间隔内以多个频率连续照射样本来从样本获得荧光辐射，这些频率偏离中心激光频率。由AOD生成的频移伴随有角偏转，以使得使用相同的光学路径就能够在整个样本上高速地扫描束。

更具体地，在该操作模式中，RF频率合成器10用于将施加到AOD 18的驱动信号从起始频率(f₁)到结束频率(f₂)倾斜。作为示例，驱动信号倾斜的频率范围能够为大约50MHz至大约250MHz。在一些实施例中，驱动信号从大约100MHz倾斜至大约150MHz。在该实施例中，驱动频率随着时间连续变化，例如以实现高速。在其他实施例中，驱动频率能够从起始频率(f₁)到结束频率(f₂)以离散步长变化。

将驱动频率选择为使得频移后的束将错过镜28并且沿着由透镜26、透镜30、镜40/42、分束器44、透镜46、镜56、透镜50、镜58和物镜52所限定的光学路径来传播，以照射流经样本架的样本的一部分。斜坡速率优选为足够快，以便改善并优选地防止当样本流过束时基于发射的荧光辐射从而在荧光图像的竖直方向上产生任何模糊。例如，能够通过将斜率与样本的流速相匹配来实现此目的。样本处的激光光斑尺寸能够用于估计合适的速率。作为示例，对于1微米的激光光斑，对于每秒0.1米的样本流速，在1线上的扫描时间应当为10微秒或更短，以避免图像模糊。

以以上讨论的方式来收集并检测响应于由激发辐射导致的照射从而从样本发射的荧光辐射。具体地，参照图8，由光检测器64来检测荧光辐射。检测到的荧光被放大器70放大，并且放大后的信号被分析模块72分析以重建样本的荧光图像。图像的重建是通过将水平像素位置分配给扫描周期内从起始频率(f₁)到结束频率(f₂)的特定时间来执行的。与在上述操作模式下分析频率分量的幅度以获得像素值相反，在该操作模式下使用的解调方法仅使用检测到的荧光信号的时域值来将值分配给图像的像素。当样本在竖直方向上流动时能够重复该过程，以便获得样本的二维荧光图像。

由样本发射的荧光辐射(如果有)被光电检测器64收集。参照图8，检测到的荧光辐射被放大器70放大。分析模块72接收放大后的信号。在此操作模式下，分析模块分析荧光信号以确定样本(例如，细胞/颗粒)的荧光含量。由于在此操作模式下仅存在激发样本的一个束，因此不会响应于激发样本来生成拍频。因此，在荧光信号的频域中不存在图像信息。相反，检测到的荧光信号具有在时域中编码的图像信息。在该操作模式下，能够使用检测到的荧光信号的时间值作为水平像素坐标并且将荧光信号的数字化电压值作为像素值(亮度)，来数字化地重建图像。施加到AOD的驱动频率的每次扫描都会产生图像的一个水平线(行)。当样本流过照射区域(点)时，经由连续扫描来实现图像重建。

在又一操作模式中，系统10能够操作为通过单个激发频率来同时地照射样本的多个位置，该单个激发频率能够例如通过将激光束的中心频率移位一个射频来生成。更具体地，再次参照图1，在这种操作模式下，能够将单个驱动射频施加到AOD 18，以生成其频率相对于进入AOD 18的激光束而言发生移位的激光束。此外，经频移的激光束相对于进入AOD的激光束表现出角度移位，以使得射频激光束被镜28拦截，并且使其经由透镜32和镜33和35来被镜28反射到顶帽式光束整形器34。离开顶帽式光束整形器的光束被分束器44反射，并且被透镜46聚焦到中间像平面48上。在该平面中，如图13A中示意性所示，激光束1300示出了沿着水平方向的拉伸轮廓。

水平拉伸的激光束被镜56反射到凸透镜50。在穿过透镜50之后，激光束被镜58反射到物镜52。如上讨论的，凸透镜50和物镜52形成望远镜，以用于将来自中间像平面48的顶帽轮廓激光束中继到流过流通池54的样本上。

水平拉伸的激光束照射样本的水平范围，以沿着该水平范围激发所关注的荧光团(如果存在于样本中)。因此，在该操作模式下，与其中以不同的激发频率来照射样本的多个水平位置的第一操作模式不同，以相同的激发频率来照射样本的多个水平位置。该操作模式不能使用户获得所流过的细胞或颗粒的图像。然而，在此操作模式下，与其他两个操作模式相比，通常能够将更高的光学功率施加到样本，这在如果不需要图像的情况下对于获得更高信噪比数据而言可能很有用。通过仅更改驱动声光偏转器的电子信号即可访问此操作模式，而无需对系统进行任何机械改变。

因此，系统10能够以三种不同的操作模式进行操作以引发来自样本的荧光辐射。

在一些实施例中，能够例如通过将射频频移光束和本机振荡器束中每个的拍频相位与所检测到的荧光信号中相应射频分量的相位进行比较来在样本的每个空间位置处执行该荧光寿命测量。作为示例，图13B示出了系统10’，其是以上讨论系统10的修改版本，该系统允许进行这样的荧光寿命测量(为了简洁起见，在该图中未描绘出图1中所示的某些部件)。具体地，入射在分束器44上的RF梳形束的一部分被分束器反射到会聚透镜400上(作为说明，在该实施例中，透镜400具有200mm的焦距，但也能够使用其他焦距)。透镜400将RF梳形束的该部分聚焦到检测激发束的光电二极管402上。光电二极管402的输出能够被分析模块72接收(参见图8)。分析模块能够例如使用以上讨论的解调技术之一，来提供激发束的频率解复用，并确定激发束中每个射频分量的相位。对于检测到的荧光信号中的每个射频分量而言，这能够提供参考相位，该参考相位能够与该射频分量的相位进行比较。例如，能够采用激励信号的FFT的实部和虚部或者锁定型解调的I分量和Q分量。替代地，用于检测样本/流通池的明场图像的检测器的输出能够用于获得参考相位，该参考相位能够与荧光拍频的相位进行比较。

更具体地，分析模块72能够例如以以上讨论的方式来提供所检测到荧光信号的频率解复用。如本领域技术人员将理解的，对于荧光信号中的每个拍频而言，能够将射频分量的相位与激发束的相应参考相位进行比较，以获得空间分辨荧光寿命测量和荧光寿命图像。

在某些实施例中，本主题系统包括采用上述光学配置的流式细胞仪系统，以用于检测流中由样本发射的光。在某些实施例中，本主题系统是流式细胞仪系统，其包括以下美国专利中所描述的流式细胞仪中的一个或多个部件：3,960,449；4,347,935；4,667,830；4,704,891；4,770,992；5,030,002；5,040,890；5,047,321；5,245,318；5,317,162；5,464,581；5,483,469；5,602,039；5,620,842；5,627,040；5,643,796；5,700,692；6,372,506；6,809,804；6,813,017；6,821,740；7,129,505；7,201,875；7,544,326；8,140,300；8,233,146；8,753,573；8,975,595；9,092,034；9,095,494；以及9,097,640，它们的全部公开内容通过引用来并入本文。

如以上讨论的，在一些实施例中，将本主题系统配置为用于对作为流来流动的样本中(诸如在流式细胞仪的流中)的颗粒(例如，细胞)进行成像。流中的颗粒的流速可以为0.00001m/s或以上，诸如为0.00005m/s或以上，诸如为0.0001m/s或以上，诸如为0.0005m/s或以上，诸如为0.001m/s或以上，诸如为0.005m/s或以上，诸如为0.01m/s或以上，诸如为0.05m/s或以上，诸如为0.1m/s或以上，诸如为0.5m/s或以上，诸如为1m/s或以上，诸如为2m/s或以上，诸如为3m/s或以上，诸如为4m/s或以上，诸如为5m/s或以上，诸如为6m/s或以上，诸如为7m/s或以上，诸如为8m/s或以上，诸如为9m/s或以上，诸如为10m/s或以上，诸如为15m/s或以上，并且包含为25m/s或以上。例如，根据流(例如，流喷嘴孔口)的尺寸，流在本主题系统中的流速可以为0.001μL/min或以上，诸如为0.005μL/min或以上，诸如为0.01μL/min或以上，诸如为0.05μL/min或以上，诸如为0.1μL/min或以上，诸如为0.5μL/min或以上，诸如为1μL/min或以上，诸如为5μL/min或以上，诸如为10μL/min或以上，诸如为25μL/min或以上，诸如为50μL/min或以上，诸如为100μL/min或以上，诸如为250μL/min或以上，并且包括为500μL/min或以上。

在一些方面，公开了用于提供对颗粒(例如，细胞)一个或更多个特征的估计的方法和系统。作为示例，图14A显示了流程图，该流程图描述了根据本教导一个实施例的一种用于确定颗粒的一个或更多个特性的示例性方法。当颗粒流过流式细胞仪系统时，利用射频调制光学束来照射该颗粒，以便引发来自该颗粒的至少一个辐射响应(块1)。作为示例，射频调制光学束能够包括至少两个子束，该至少两个子束的光学频率彼此移位一个射频。在一些实施例中，射频频移能够为大约10MHz至大约250MHz。例如，该射频频移能够为大约55MHz至大约225MHz，诸如为大约60MHz至大约200MHz，诸如为大约65MHz至大约175MHz，诸如为大约70MHz至大约150MHz，并且包含为大约75MHz至大约125MHz。作为示例，在一些实施例中，能够通过将激光束引入到声光偏转器(AOD)并以一个或更多个射频来向AOD施加一个或更多个驱动信号，从而生成射频调制光学束，以便生成多个角度分离的子束，这些子束的光学频率例如以以上讨论的方式通过所述射频来相对于彼此发生移位。

在一些实施例中，响应于由射频调制光学束对颗粒的照射来从颗粒引发的辐射响应，能够是荧光辐射和/或散射辐射中的任一个。

继续参照图14A的流程图，能够检测从颗粒发出的辐射响应(块2)，并且能够生成与辐射响应相关联的时间波形数据(块3)。各种辐射检测形式和检测器(诸如以上讨论的那些)能够用于检测所引发的辐射响应。在一些实施例中，所生成的波形能够是荧光波形数据和/或散射波形数据。该波形数据能够被处理以获得颗粒的至少一个特征的估计。在许多实施例中，能够在不基于波形数据来生成颗粒图像的情况下，执行对波形数据的这种处理以获得颗粒的至少一个特性的估计。在一些实施例中，该处理包括分析调制时间波形数据的一个或更多个拍频，以获得对颗粒的至少一个特征的估计。在一些实施例中，该处理足够快地执行，以使得与获得对颗粒的至少一个特征的估计相关联的等待时间小于大约100微秒。

在一些实施例中，以上方法能够用于获得对颗粒的维度尺寸、沿着两个不同维度的颗粒尺寸之比、由与颗粒相关联的两个或更多个标记物来发射的荧光辐射的共定位、或辐射响应的精确度(例如，由颗粒发射的荧光辐射的精确度)等等中任一个的估计。

以上方法能够用于获得对各种不同颗粒的一个或更多个特征的估计。作为示例，颗粒能够是细胞、小型生物(例如，秀丽隐杆线虫)、念珠、微米颗粒、纳米颗粒、病毒颗粒、细菌、外来体或药物产品中的任一种。

图14B示意性地描绘了根据一个实施例的系统1400，该系统用于估计诸如细胞的颗粒的至少一个特征。示例性系统1400包括照射系统1402，该照射系统用于利用射频调制的光学激光束来照射流过流式细胞仪系统中的流通池的一个或多个颗粒。检测器1404能够响应于其照射来检测颗粒的辐射响应(例如，荧光辐射和/或散射辐射)，并生成指示该辐射响应的一个或更多个信号。分析器1406能够从检测器接收一个或更多个信号，并生成时间波形数据并对该波形数据进行操作，以便导出对颗粒的一个或更多个特征的估计。

分析器1406能够采用各种不同的方法来分析波形数据以获得对诸如细胞的颗粒的一个或更多个特征的估计。作为示例，在一些实施例中，能够利用至少两个荧光标记物来对颗粒染色，其中将每个标记都配置为响应于通过射频调制的光学辐射所进行的照射来发射荧光辐射。能够检测荧光辐射并将其数字化以生成分别与标记之一相对应的荧光波形。分析器能够对荧光波形进行操作以获得从标记发出的荧光辐射的共定位的量度。具体地，分析器能够将高通滤波器或带通滤波器施加到波形的至少一个，以生成至少一个滤波后的波形，然后对这些波形进行逐点乘法以生成结果乘法波形，对该乘法波形进行积分以获得积分值，并且将该积分值与预定义的阈值进行比较以获得共定位的量度。作为另一示例，在一些实施例中，能够获得在流式细胞仪系统中沿着垂直或平行于颗粒流动方向的方向来进行对颗粒尺寸的估计。例如，在一些这样的实施例中，能够通过将与响应于射频调制光学束的照射来由颗粒发射的荧光辐射相对应的荧光波形进行平方、向该平方波形施加带通滤波器、对滤波后的波形进行积分、并将积分值与预定义的阈值进行比较，从而获得在垂直于颗粒流动方向的方向上的对颗粒尺寸的估计。此外，在一些实施例中，分析器能够使用散射数据来获得在平行于颗粒流动方向的方向上的对颗粒尺寸的估计。

如以下讨论的，流过流式细胞仪系统的颗粒的一个或更多个估计的特征能够用于达成针对该颗粒的分选决定，即是否对该颗粒进行分选。在使用流过流式细胞仪的细胞的特征估计来进行关于这些细胞的分选决定的背景下，下文讨论了能够用于对波形数据进行操作以获得颗粒至少一个特征的估计的处理方法的一些示例。应当理解，这样的处理方法能够用于获得除细胞以外的颗粒的特征的估计，并且所估计的特性还可以不用于分选目的。

在相关方面，公开了基于颗粒的一个或更多个特征来自动选通(例如，计算机辅助选通)流过流式细胞仪的颗粒(例如，细胞)群体的方法。作为示例，这样的方法能够基于颗粒的尺寸处于预定范围内，来对流过流式细胞仪的多个颗粒的子组进行选通。例如，参照图14C的流程图，这种方法能够包括将含有多个颗粒的样本引入到流式细胞仪中(块1)，并且从一个或更多个流式细胞仪测量结果中获得针对多个颗粒的至少一个颗粒特征的估计(块2)。获得至少一个颗粒特征能够包括：当颗粒流过流式细胞仪时，利用具有彼此移位一个射频的至少两个光学频率的辐射来照射该颗粒，以引发来自颗粒的辐射响应；检测来自颗粒的辐射响应以生成与该响应相关联的时间波形数据，以及通过分析对所述时间波形数据进行调制的一个或更多个拍频，来处理所述时间波形数据以获得所述至少一个颗粒特征的值。该方法可以进一步包括经由计算机处理器来识别指示一个或更多个颗粒具有处于预定义范围内的颗粒特征的值的选通。作为示例，其维度尺寸(例如，横向尺寸)在预定义范围内的颗粒能够被选通。

系统(诸如图14B中所描绘的系统)能够用于执行以上选通方法。例如，分析器3006能够被编程为确定对多个颗粒的至少一个特征的估计，例如，基于响应于由射频调制光学束的照射来由那些颗粒发射的荧光辐射中的一个或更多个拍频的分析来进行该确定，并且确定颗粒特征的估计是否在预定义范围内，以便相对于该颗粒得出选通决定(例如，如果确定的特征在预定义范围内，则该颗粒将被选通)。在一些实施例中，基于本教导修改的标题为“Neighborhood Thresholding in Mixed Model Density Gating”的美国专利号8,990,047的教导能够用于选通流过流式细胞仪的颗粒。美国专利号8,990,047通过引用将其全部内容并入本文。

在一些方面中，公开了用于基于经由射频调制光学辐射对那些细胞的询问来分选细胞的方法和系统，该射频调制光学辐射例如为包括彼此分开一个或更多个射频的两个或更多个光学频率的光学辐射束。在一些实施例中，该光学束能够包括在多个角度上或空间上分离的子束，这些子束中的每个都具有相对于彼此的射频频移。在一些情况下，使用这种束允许以不同的射频频移光学频率来照射颗粒(例如，细胞)内的不同位置。如下文更详细讨论的，这样的方法能够通过采用响应于光学束的照射由细胞所生成的时变信号来提供分选决定，而不需要基于检测到的一个或多个信号来计算荧光图像。虽然在(例如，在流式细胞仪系统中)分选细胞的背景下，在下文讨论了根据本教导的方法的各种实施例，但是本文所描述的方法也能够用于分选其他类型的颗粒，诸如小型生物(例如，秀丽隐杆线虫)、念珠、微米颗粒、纳米颗粒、病毒颗粒、细菌、外来体或药物产品。在一些实施例中，能够使用本教导进行分选的颗粒的尺寸(例如，最大尺寸)能够为大约50纳米至大约1毫米，例如为大约100纳米至大约1微米。

另外，在许多实施例中，本文所讨论的分选方法能够用于提供具有低等待时间的分选决定，例如，以使得能够使用以高颗粒吞吐量进行操作的分选装置(例如，可以执行每秒1000次以上的分选操作)来对细胞或其他颗粒进行分选。作为示例，本文所描述的方法能够用于进行具有等于或小于大约100微秒的等待时间的分选决定，例如大约10微秒至大约100微秒，或者大约20微秒至大约80微秒，或者大约30微秒至大约70或50微秒。术语“等待时间”在本文中用于指示在利用询问辐射照射颗粒(例如，细胞)与得到颗粒特性和/或关于该颗粒的分选决定之间的时间间隔。

作为示例，图14D的流程图描绘了根据一个实施例的方法，该方法用于基于与从颗粒发出的两个或更多个荧光团(例如，外源和/或内源荧光团)对应的荧光信号的共定位程度来分选颗粒(例如，细胞)。在不损失一般性的情况下，在以下讨论中将颗粒假定成细胞。在块(1)处，经由利用包括彼此分开一个或更多个射频的两个或更多个光学频率的光学辐射束所进行的照射，来对细胞进行光学询问。在一些情况下，该光学束能够包括在多个角度上或空间上分离的子束，这些子束中的每个都具有相对于彼此的射频频移。使用这样的光束允许以不同的光学频率来照射细胞内的不同位置，该不同的光学频率彼此移位一个或更多个射频。能够将光学频率选定为激发预期为与细胞相关的两个或更多个荧光团。例如，荧光团能够是例如经由染色，利用其来标识细胞的荧光染料分子。作为示例，在一些实施例中，辐射束的光学频率能够为大约300THZ至大约1000THZ，并且光学频率之间的射频间隔能够例如为大约50MHz至大约250MHz。

然后可以在两个(或多个)单独的荧光通道中收集从激发细胞发出的荧光辐射，每个荧光通道对应于荧光团之一发射的荧光辐射(块2)。例如，这能够通过采用以上结合图7A讨论的检测器布置来实现。能够将每个通道中所收集的荧光辐射进行数字化(块3)，并且将其表示为信号值的时间序列(荧光强度)。在该实施例和其他实施例中，能够对存在于荧光辐射中的拍频进行编码的这种信号值的时间序列被称为时频波形。对应于两个或更多个荧光通道的数字化时频波形在时间上是同步的(块4)并被归一化(块5)。例如，能够通过将每个波形除以其最大值并将该波形乘以比例因子来实现该归一化。

能够将高通滤波器或带通滤波器施加到波形中的至少之一，以生成至少一个滤波后的波形(块6)。在一些实施例中，将低通滤波器施加为允许小于大约1MHz的频率通过，并且基本上阻止更高的频率。合适的低通滤波器的一些示例包括但不限于时域有限脉冲响应(FIR)滤波器或傅立叶域滤波器。

然后，能够将波形逐点相乘以获得乘法波形，并且能够对该乘法波形进行积分以获得积分值(块7)。作为说明，图15示出了阵列1500和阵列1501，该阵列1500代表在一个荧光通道中检测到的经滤波的归一化的时间序列数字化荧光信号，该阵列1501代表在时间上与阵列1500同步的在另一荧光通道中检测到的经滤波的归一化的时间序列数字化荧光信号(为了简单起见，在该说明性示例中，将荧光通道的数量选择为2并且将阵列元件的数量选择为10，应当理解，荧光通道的数量可以大于2并且阵列元件的数量可以大于10)。该数据在本文中被称为时频波形。经由阵列1500和1501中的数据的逐点乘法来获得结果阵列1502。

来自每个通道的时间荧光信号都包括与光学辐射束的射频分离光学频率的干扰对应的拍频。这样，它们各自数字化数据的相乘将表现出那些频率的和与差。如果在两个或更多个荧光通道中的信号源自激发细胞内的基本相似的空间位置，则基于在源自激发细胞的不同荧光通道中的这些信号的共定位程度，经由将这些信号相乘所获得的结果时域数据将包含DC处或接近DC的频率分量。

在块(8)处，将积分结果与预定义阈值进行比较，以确定所询问的细胞是否表现出足够的荧光信号共定位以被鉴定为满足分选标准的细胞。例如，如果积分结果等于或超过预定义阈值，则将选择该细胞以用于分选。否则，将不选择该细胞以用于分选。

基于荧光共定位的以上分选方法能够用于多种应用中，例如，用于易位分析。

在另一方面，提供了一种用于基于细胞尺寸估计在流式细胞仪系统中分选细胞的方法，其中经由分析由细胞发射的荧光辐射来获得对细胞尺寸的估计。例如，该方法使用从细胞发出的荧光脉冲的持续时间来估计沿着流动方向的细胞维度，并分析通过使荧光信号的平方穿过低通滤波器以基于细胞横向维度(例如，正交于细胞流动方向的细胞维度)的估计来执行分选决定从而获得的低通滤波信号中所含有的功率。

更具体地，参照图16，在一个实施例中，经由利用包括彼此分开一个或更多个射频的两个或更多个光学频率的光学辐射束所进行的照射，来对细胞进行光学询问(块1)。类似于先前的实施例，例如，该光学束能够包括多个角度或空间分离的子束，这些子束中的每个都具有相对于彼此的射频频移。能够将光学频率选定为激发与细胞相关的一个或更多个外源和/或内源性荧光团。细胞穿过光学辐射束并且响应于该束的激发来发射荧光。在不失一般性的情况下，在该实施例中，假定细胞在竖直方向上流过照射束，并且在基本正交于细胞流动方向的横向(水平)方向上检测发射的荧光。

然后检测从细胞发出的荧光信号并且将其数字化以生成时频波形(块2)。然后能够对检测到的荧光辐射进行分析以估计细胞尺寸，如下文所讨论的。在一些实施例中，从细胞发出的光散射脉冲的持续时间能够用于估计沿着流动方向的细胞尺寸。

从细胞发出的荧光脉冲的持续时间与细胞在询问光学辐射束内的停留时间有关，继而又与在平行于流动方向的方向上的光束尺寸、在流动方向上的细胞尺寸和细胞的流动率有关。如果照射该细胞的光束具有直径(H)，并且该细胞的流动率为V，并且该细胞在流动方向上的尺寸为D(例如，直径)，则尺寸D能够近似为以下关系：

D＝V*T-2*H 等式(2)

其中T是检测到的光学脉冲宽度。因此，在块(3)处，例如使用以上关系，基于从细胞发出的荧光或光散射脉冲的持续时间，来估计在流动方向上的细胞尺寸。

继续参照图16的流程图，为了估计细胞的横向尺寸，将数字化荧光数据平方(块4)，并且将带通滤波器施加到平方后的荧光数据(块5)。然后对滤波后的数据进行积分以获得积分脉冲功率的量度(块6)。积分脉冲功率能够提供细胞的横向尺寸的量度。更具体地，基于落在带通滤波器频带内的以不同频率存在的功率(由于平方运算所导致)，积分脉冲功率能够提供细胞的横向尺寸的量度。

在块(7)处，能够采用在流动方向上的细胞尺寸的估计和/或与滤波后数据相关联的积分脉冲功率来做出相对于细胞的分选决定。例如，在一些实施例中，能够将在流动方向上的估计细胞尺寸与第一阈值进行比较，并且能够将积分脉冲功率与第二阈值进行比较以做出分选决定。作为示例，在一些情况下，如果在流动方向上的估计细胞尺寸和积分脉冲功率都超过各自的阈值，则做出肯定的分选决定(即，选定了该细胞)。替代地，分选决定能够仅依赖于在流动方向上的细胞尺寸的估计或者仅依赖于积分脉冲功率。如下文进一步讨论的，在一些情况下，能够采用估计的竖直和水平细胞尺寸的比率来做出分选决定。

作为基于细胞横向尺寸的估计来做出分选决定的进一步说明，图17A示意性地描绘了由假想束来照射的假想细胞，该假想束包括多个射频调制子束，这些射频调制子束具有从15MHz延伸到25MHz并彼此分开1MHz的射频调制。虚线示意性地描绘了在正交于照射方向的平面中被照射细胞的横截面图。从细胞收集并数字化的荧光辐射能够是数字化荧光值的时间序列阵列1700的形式，如图17B中示意性所示(这里仅出于说明目的来示出阵列，而并不是限制可以存在于实际荧光波形中的阵列元件的数量)。将波形1700平方以获得波形1701。然后将带通滤波器施加到平方的荧光波形1701，其中该滤波器允许选定的调制频率在两个频率f₁与f₂(其中f₂>f₁)之间穿过，同时基本上阻止了低于f₁或高于f₂的那些调制频率。作为示例，带通滤波器能够是FIR带通滤波器，但是也可以采用本领域中已知的其他合适的滤波器。滤波后的数据指示在f₁与f₂之间的调制频率处所检测到的荧光脉冲中存在的功率。然后对滤波后的数据进行积分以获得在f₁与f₂之间的频率处的总脉冲功率的量度。然后能够将该积分结果与阈值进行比较，以做出分选决定。例如，基于积分结果小于预定义阈值的这一事实，能够估计细胞的横向尺寸小于某个值。

在该示例中，细胞尺寸导致通过其射频调制为大约18MHz至大约21MHz的光学辐射来照射细胞。因此，荧光数据平方中最大和最小调制频率之间的差为大约6MHz。如果期望检测将导致其荧光数据平方中的频率差为大约10MHz至大约15MHz的更大尺寸细胞，那么能够将区分10MHz以下和15MHz以上的频率的带通滤波器施加到荧光数据平方。在该示例中，将这种带通滤波器施加到荧光数据平方将不会导致足够大的信号以指示具有所期望横向尺寸的细胞的存在，因为荧光数据平方中的调制频率差为10MHz以下。

基于细胞尺寸的以上分选方法能够具有多种不同的应用，例如，根据循环肿瘤细胞(CTC)的尺寸进行分离。

在另一方面，公开了一种基于细胞纵横比来分选细胞的方法。例如，参照图18的流程图，利用辐射来激发穿过光学询问区域的细胞，并且收集由该细胞发射的荧光辐射并将其数字化(块1)以生成数字化时频波形。然后以以上讨论的方式来分析该数字化荧光数据，以估计竖直(沿着流动方向)的细胞尺寸(块2)和水平(沿着正交于流动方向的方向)的细胞尺寸(块3)。更具体地，能够使用由细胞发射的荧光或光散射(或光传输)脉冲的时间宽度来估计细胞的竖直尺寸(块2)，并且能够使用例如以上讨论的方法基于将带通滤波器施加到荧光数据的平方来估计细胞的水平尺寸(块3)。在块(4)处，确定细胞的竖直和水平尺寸的估计的比率，并将其与预定义阈值进行比较以做出相对于该细胞的分选决定。例如，在一些情况下，如果该比率超过阈值，则能够相对于该细胞做出肯定分选决定。

基于细胞纵横比的以上分选方法能够用于例如细胞周期分析、DNA分析等。

在另一方面，公开了一种确定细胞核尺寸相对于其细胞质尺寸的比率的方法。在一些实施例中，能够采用这样的比率来做出分选决定。参照图19A的流程图，在一个这样的实施例中，利用两个荧光标记物来标记(例如，染色)细胞，这两个荧光标记物之一将驻留在细胞膜(细胞质的边界)上并且其另一个则能够透过细胞膜来进入细胞质并将细胞核染色(例如，经由细胞的内部机制)(块1)。与细胞膜结合的荧光标记物的一些示例包括利用与膜蛋白结合的荧光团来标签的任何抗体，诸如抗-CD45-FITC或抗-EpCAM-PE。能够用于将荧光标记物结合到细胞膜的其他常见表面蛋白包括，例如，CD3、CD4、CD8等。合适的核荧光染色剂的一些示例包括但不限于碘化丙啶、SYTO16、7-AAD和DAPI。

然后利用辐射来照射细胞，以便激发这两种类型的荧光标记物(块2)，并且在对应于来自细胞膜及来自其细胞核的荧光发射的两个通道中检测发射的荧光并将其数字化(块3)。例如，以以上讨论的方式来使用对应于细胞膜的荧光数据来获得细胞质尺寸的估计，并且使用对应于细胞核的荧光数据来获得细胞核尺寸的估计(块4)。例如，能够例如以以上讨论的方式来采用每个通道中的荧光或光散射脉冲的宽度，以沿着一个维度(即，沿着流动方向)来估计细胞尺寸。此外，能够通过以以上讨论的方式将带通滤波器施加到各自通道中的荧光数据的平方，来估计细胞质或细胞核的横向尺寸。对该带通滤波后的数据进行积分的结果提供了一个值，该值与预定义阈值进行比较以便对大于或小于该阈值的细胞进行分选。此外，能够例如通过获得竖直尺寸估计和水平尺寸估计的平方和的平方根来组合两个维度中的细胞的尺寸估计，以基于总细胞尺寸的估计来得出分选决定。

在块(5)处，获得针对细胞质和细胞核的尺寸估计的比率，例如，在竖直或水平方向上的尺寸的比率，或组合尺寸的比率。参照图19B的流程图，在一些实施例中，细胞核尺寸相对于其细胞质尺寸的比率(其能够例如以以上讨论的方式来确定并且在图19B的流程图的块(1)-(5)中表示)能够用于做出分选决定。例如，能够将该比率与预定义阈值进行比较以做出分选决定(块6)。作为示例，如果该比率超过阈值，则做出肯定分选决定(即，选定该细胞)。

作为示例，基于核-质尺寸比率的以上分选方法能够用于循环肿瘤细胞的分类中。

在另一方面，公开了一种估计从细胞发射的荧光辐射的细胞粒度(荧光点状性)的方法，其在一些实施例中能够用于分选细胞。换句话说，能够基于从细胞发射的荧光辐射是能够被表征为从发射中心的弥散性细胞内分布发出，还是能够被表征为从在细胞内未弥散分布的发射中心发出，从而做出分选决定。

更具体地，参照图20A所描述的流程图，在一个实施例中，利用具有彼此分开一个或更多个射频的两个或更多个光学频率的光学辐射来照射具有一个或更多个外源和/或内源性荧光标记物的细胞，以便从该标记物引发荧光辐射(块1)。类似于先前的实施例，在一些情况下，该光学束能够包括多个角度或空间分离的子束，这些子束中的每个都具有相对于彼此的射频频移。作为示例，参照图21，在说明性的示例性实施例中，光学辐射束能够包括调制频率f₁、f₂、f₃、f₄、f₅，其能够例如从10MHz(f₁)跨越到15MHz(f₅)并具有0.5MHz的间隔。如下文更详细讨论的，能够通过其中发射的荧光辐射表现出的调制频率不同于用于调制光学束的那些调制频率(例如，在该实施例中，不同于f₁、f₂、f₃、f₄、f₅)的程度来估计发射的荧光辐射的点状性。能够作为用于调制光学束的频率之间的频率的其他频率在本文中被称为“像素外频率”。换句话说，荧光功率到像素外频率的“泄漏”指示出所发射荧光的点状性程度；泄漏越多，所发射荧光的点状性越好。

再次参照图20A的流程图，能够收集荧光辐射并将其数字化以生成时频波形(块2)。在块(3)处，获得整个波形的傅立叶变换，例如快速傅立叶变换(FFT)。随后，例如通过将时域波形除以其最大值，并且将波形重新缩放一常数倍，从而将生成的FFT标准化为固定值以用于细胞之间的比较(块4)。确定FFT的“像素外”窗口的总和(即，对应于照射光学辐射中存在的调制频率之间的频率相对应的窗口)(块5)。该总和指示荧光功率到像素外频率的“泄漏”程度，并且因此指示所发射荧光辐射的点状性程度的量度。

参照图20B，在一些实施例中，能够以以上讨论的方式来确定并且在图20B的流程图的块(1)-(5)中表示的所发射荧光辐射的点状性程度的量度能够用于分选细胞。特别地，在块(6)处，FFT的“像素外”窗口的总和(其指示荧光功率到像素外频率的“泄漏”的程度)能够与预定义阈值进行比较以做出分选决定。例如，当期望对表现出相对较高程度荧光点状性的细胞进行分选时，如果该总和大于阈值，则对细胞进行分选(选定)。替代地，当期望对表现出弥散荧光的细胞进行分选时，如果总和小于阈值，则对细胞进行分选。

基于对所发射荧光辐射的分析的这种细胞分选能够用于多种应用中，诸如斑点计数、荧光原位杂交(FISH)、细胞内转运和定位以及基于滴的单细胞分析。

能够以多种方式来实现针对颗粒(例如，在流式细胞仪系统中流动的细胞)做出分选决定的以上方法。作为示例，图22示意性地描绘了用于分选细胞的示例性系统2200，其能够采用本教导以用于做出分选决定。系统2200能够包含容器2201，该容器用于存储悬浮有多个细胞的悬浮液。细胞悬液容器2201经由入口2202来流体联接到样本导管2203，该样本导管能够由例如刚性金属(诸如不锈钢)形成。样本导管2203设置在盛器2204内，该盛器包含上部圆柱形部分2204a，该上部圆柱形部分经由锥形部分2204b延伸到具有更小直径的下部圆柱形部分2204c，该下部圆柱形部分在其远端处包含喷嘴2205。盛器2204流体联接到鞘液源2206。声学振动器2208(例如，压电驱动器)联接到喷嘴，并且配置为当由发电机2210通电时引起喷嘴的振动。作为示例，振动频率能够为大约60kHz，但是也能够使用其他振动频率。

在使用中，储存在容器2201中的悬浮液经由入口2202被引入到导管2203中。离开容器2203的含有细胞的稀薄流动流体被鞘液夹带并被携带到喷嘴2205。喷嘴的振动运动能够以本领域中已知的方式来配置，以将通过喷嘴的流分成多个液滴D，每个液滴都含有单个细胞颗粒。至少一些细胞与一个或更多个内源和/或外源性荧光团相关联，该内源和/或外源性荧光团能够响应于激发辐射的照射来发射荧光辐射。能够使用各种各样的荧光团。在一些情况下，荧光团能够附接到识别细胞上的靶(例如，受体)的抗体。在一些情况下，荧光团能够附接到针对细胞膜或另一细胞结构(例如，细胞核)而言具有亲和性的化学实体。此外，在一些情况下，能够利用不同荧光团的组合来标识细胞。

继续参照图22，当每个细胞穿过询问区域2212时，由照射系统2216所生成的激光束2214来照射该细胞，以引发与该细胞相关的一个或更多个荧光团的荧光辐射。如上所讨论的，激光束能够包含相对于彼此移位一个或更多个射频的多个光学频率。作为示例，光学束的形式能够为相对于彼此具有射频频移的多个角度或空间分离的子束。从细胞发射的荧光辐射能够被能够包含一个或更多个光电检测器的检测系统2218来检测。能够通过分析模块2220以以上讨论的方式来分析检测到的荧光，以做出关于该细胞的分选决定。

作为示例，照射和检测系统能够是以上例如结合图1-9所讨论的那些。然而，应当理解，本教导用于分选颗粒的实践不限于使用任何特定的照射和检测系统。替代于此，能够采用各种不同的系统，只要它们提供用于做出分选决定的以上方法中使用的必要数据(例如，荧光和/或散射数据)即可。

再次参照图22，系统2200还包括充电环2222，其由继而在分析模块2220的控制下的充电电路2223来通电。该充电环能够在细胞滴穿过环时，向该细胞滴施加正电荷或负电荷。替代地，该环能够允许细胞滴穿过而不向其施加电荷。

更具体地，分析模块2220能够采用以上教导来做出关于细胞的分选决定。基于该决定，分析模块能够确定是否需要对细胞滴充电，并且如果需要，则应将哪种电荷极性施加给该细胞。然后，分析模块能够控制充电电路2223，以经由环2222来将必需的电荷施加给细胞滴。然后细胞穿过设置在环2222下游的一对偏转板2224之间的间隙。电压源2225将电压施加到板2224的至少一个，以在板之间建立电场。电场能够使正细胞滴和负细胞滴的路径沿着不同方向偏转，以使得能够分别通过细胞收集器2226的管2226b和2226c来收集它们。未被环2222充电的细胞则不偏转，并且被细胞收集器的管2226a捕获。

本文中讨论的分析/控制模块，诸如分析/控制模块2220，能够使用本领域中已知的技术并且根据本教导以硬件、固件和/或软件的各种不同方式来实现。作为示例，图23示意性地描绘了分析/控制模块2220的一个示例性实现方式2300，其包括模数转换器2302，该模数转换器用于从检测系统2218接收一个或多个荧光信号并且将该信号进行数字化以生成数字化的荧光数据。分析/控制模块2300还能够包括处理器2304，该处理器用于根据本教导来处理荧光数据以得到关于处于询问状态下细胞的分选决定。分析/控制模块2300还能够包含ROM(只读存储器)2306、RAM(随机存取存储器)2308和永久存储器2310。通信总线2312促进了分析模块的各个部件之间的通信。存储器模块能够用于存储用于分析一个或多个荧光信号和分析结果的指令。例如，在一些实施例中，根据本教导的用于分析荧光数据以得到分选决定的指令能够存储在ROM 2306中。处理器2304能够采用这些指令以对存储在RAM 2308中的数字化荧光数据进行操作，以便确定分选决定。在一些实施例中，处理器能够实现为ASIC(专用集成电路)，该ASIC被配置为执行根据本教导的指令以对荧光数据进行操作来得到分选决定。在该实施例中，分析/控制模块2300还能够包括通信/控制模块2314，该通信/控制模块用于基于分选决定来向充电电路发送适当的信号，以便向处于询问下的细胞施加适当的电荷。

如上所讨论的，根据本教导的方法对时间荧光数据进行操作以得到针对颗粒(例如，细胞)的分选决定，而无需形成细胞的逐像素荧光图像。这继而允许以低等待时间(例如，小于大约100微秒)来分选细胞，这继而允许以高速率来分选细胞。例如，根据本教导的分选方法能够允许以等于或大于每秒1000个细胞的速率来分选细胞，例如以每秒大约1000至大约100,000个细胞来分选细胞。

如上所述，尽管不限于任何特定的照射或检测技术，但是在一些实施例中，根据本教导的细胞分选方法能够有效地用于采用频域复用来激发像素行的流式细胞仪系统中，每个像素都以独特的射频“标记”，该射频例如通过两个频率偏移基本光束的跳动产生。使用频域复用，能够针对每个荧光颜色或散射方向使用例如单个光电倍增管(PMT)来检测并读取单个图像行中来自数百个像素的荧光(或散射)辐射。由于图像行中每个像素的激发都是在唯一的拍频处来调制的，因此像素率与系统的总RF带宽成比例，这能够在大于100MHz的像素率处提供散粒噪声限制的灵敏度。如上所讨论的，根据本教导的分选方法能够采用以时频格式编码的图像数据，来执行分选决定，而无需实际计算图像。

此外，上述系统能够用于基于响应照射从颗粒发出的散射辐射来分选颗粒(例如，细胞)。能够例如以以上讨论的方式来检测并分析散射辐射以得到分选决定。

作为其他示例，以下美国专利提供了与能够根据本教导进行修改以实践本文所公开的分选方法和系统的分选系统有关的信息：标题为“Particle Separator”的美国专利号3,380,584、标题为“Flow Cytometer and Flow Cytometry”的美国专利号9,034,259和标题为“System and Process for Sorting Biological Particles”的美国专利号7,417,734，它们中的每个的全部内容通过引用来并入本文。

作为进一步的阐述，2019年3月22日提交的作为优先权的美国申请62/822,789的附录A(其公开内容通过引用并入本文)提供了有关本教导的各个方面的附加信息。

本领域普通技术人员应当理解，在不脱离本教导的范围的情况下，能够做出各种改变。特别地，以上讨论的实施例的各种特性、结构或特征能够以适当的方式组合。例如，结合一个实施例讨论的检测系统能够用在另一实施例中。

颗粒特征

如上所讨论的，在一些实施例中，具有射频幅度调制的两个或更多个子束在空间上相异的位置处来照射样本。样本与每个子束之间的相互作用能够产生光学散射、光学传输和光学荧光发射信号中的至少一个，这些信号中的每个都利用子束的对应射频来被幅度调制。所收集的信号能够表示为每个调制子束的贡献之和：

S(t)＝∑_iP_i(t)·(1+A_mcos(ω_it+φ_i)) 等式(3)

其中S(t)代表所收集的信号，P_i(t)代表与第i个子束相关联的随时间变化的散射、传输或荧光发射信号，A_m代表子束的调制深度，并且ω_i和φ_i分别代表子束的射频调制的角频率和相位。通过将每个子束分配给图像的不同列，并且将每个时刻分配给图像的不同行，从而能够导出颗粒的图像表示。该图像表示经由傅立叶变换来连接到所收集的信号：

Im(x，y)＝R·W·F·S(t) 等式(4)

其中F是实现短时傅立叶变换的矩阵，W是将傅立叶分量映射到图像像素的矩阵，并且R是执行任何所期望线性图像域后处理(诸如滤波、背景减法和渐晕校正)的矩阵。颗粒的任何线性特性都能够通过图像上的矩阵乘法来表示。因此，对于计算任何所期望线性特性的矩阵M而言，能够经由下式根据所收集的信号来直接计算该特性，即无需先计算图像：

M·Im(x，y)＝M·R·W·F·S(t)＝Q·S(t) 等式(5)

Q＝M·R·W·F 等式(6)

其中Q是代表从当前颗粒表示到所期望线性特性的转换的矩阵。因此，任何线性特性都能够通过首先计算矩阵Q(例如，在预处理步骤中离线)来计算，然后执行如等式(5)中所指示的点积(例如，在线)来提取所期望的特性。在许多实施例中，对于所有特性而言，期望还减去背景信号对该特性的贡献。该过程能够总结如下：

计算：Q＝M·R·W·F

计算：Q_bkg＝M·R·W_bkg·F

在收集数据时：

如果检测到颗粒：

计算：D＝Q·S(t)

否则：

计算：D_bkg(i)＝Q_bkg·S(t)

计算：D_bkg＝mean(D_bkg(i))

生成：D-D_bkg

如上所讨论的，在一些实施例中，能够采用颗粒的一个或更多个计算特性来做出关于该颗粒的分选决定。作为另外的示例，图24示出了描述分选方法的流程图。在块(1)处，能够基于所期望的颗粒特性(特征)来计算以上Q和Q__bkg矩阵。随后，例如利用射频调制光学辐射来照射的来自流式细胞仪的流通池的散射、透射或发射的光学信号能够被收集并被数字化(块2)。能够将信号与阈值交叉进行比较以确定该信号是否来自颗粒，即是否存在颗粒(块3)。如果确定存在颗粒，则将每个数字化样本信号乘以Q(块4)，然后将结果积分成单个值(块5)。从积分值中减去背景信号(块6)以获得对颗粒的所期望特性(特征)的估计。能够经由将该特性的估计与阈值进行比较来做出分选决定(块7)。继续参照图24的流程图，能够将在不存在颗粒的情况下获得的一个或更多个数字化信号乘以Q__bkg(块8)，并且能够对多个背景测量求平均以获得在块(6)中采用的背景估计。

在一些实施例中，能够使用接收信号的各个矩来获得关于散射、传输或发射的辐射的空间分布的信息。图像矩是一类线性图像特性，其代表根据像素距任意原点的距离(取任意幂)的加权总和：

每个图像矩都编码关于散射、透射或发射的光的空间分布的不同信息。高阶矩根据像素距原点的距离来使像素的权重更大，其中每个矩都提供有关信号分布的不同信息。在各种实施例中，所有这些特征都能够通过预先计算适当的Q来从测量信号S(t)中直接计算出来。

能够以相同的方式来计算空间傅立叶分量，其中M定义如下：

M(u，v)＝exp(-j2π(ux+vy)) 等式(8)

能够在实验之前选定期望的分量，并且能够为每个分量来预计算单独的Q。例如，傅立叶分量能够用于确定颗粒是否在照射辐射的焦点中。

一些图像特性在特性提取之前涉及对数据的非线性变换。对于此类特性的子集，可以将它们表示为线性特性的非线性组合。计算这种的特性能够涉及首先像上一节中一样并行地计算多个特性，然后以非线性方式组合其结果。存在能够通过图像矩的非线性组合来表达的许多有用的图像特性。例如，能够通过一阶矩和零阶矩之比来计算像素的质心：

能够通过这种方式来表示多个其他颗粒特征。下文的表1是非详尽的清单。

表1

在一些实施例中，中心二阶矩能够用于区分双峰。散射或透射光信号中具有高二阶矩的颗粒指示更大的信号分布。

共定位和相似度

在一些实施例中，能够以与共定位相同的方式来计算颗粒与参考之间的相似度。在共定位情况下，两个波形对应于观察相同颗粒的不同检测器；在相似的情况下，两个波形对应于观察两个不同颗粒的相同检测器。下文总结了一种用于检测颗粒与参考之间相似性的示例性算法：

令R代表对应于参考颗粒的波形，令Filt是仅使调制频率通过的高通或带通滤波器，令N是参考颗粒的图像表示中的像素数量。该算法包含：

计算

计算R′＝Filt(R)

计算R₂＝||R′||²，

对于与处于研究下的颗粒相对应的每个进入的波形S：

计算

计算S′＝Filt(S)

计算D＝S′·R′

计算S₂＝||S′||²

作为颗粒与参考颗粒相似度的量度，返回

光谱解混

本文公开了用于对从支持FIRE的成像流式细胞仪中生成的图像进行补偿或光谱解混的系统、装置和方法。在被组合束49激发之后使用射频复用激发(FIRE)来检测由一个或更多个荧光团发射的荧光辐射，能够被称为荧光成像。由配置为(例如，使用带通滤波器)检测一个荧光团或染料的荧光辐射的检测器所检测到的荧光辐射、发射、信号或波形，能够包含另一荧光团的荧光发射，因为这两个荧光团的荧光发射光谱可能在光谱上重叠。光谱解混能够包含基于荧光寿命测量的相敏分析。例如，能够在现场可编程门阵列(FPGA)上实现光谱解混以用于细胞分选应用。

当荧光团具有不同的寿命时，波形的荧光信号具有不同的相位。具有不同相位的荧光信号不会以直接的方式在实数空间中相加，而是在复数空间中(具有实数和虚部分量)相加。在一些实施例中，光谱解混能够包括对复数空间中荧光信号进行分析，例如，针对荧光团的不同相位。光谱解混能够包括对复数空间中荧光信号进行分析，以解决FIRE系统中(例如，在每个通道的基础上)固有的光学和电子学的各种系统效应。流式细胞仪的检测系统能够包括多个光电检测器，以检测荧光信号并生成多个通道的荧光信号，如参照图7A-7B所描述的。如果在每个像素的基础上将光谱解混施加到从每个通道的荧光信号中生成的FIRE图像(例如，由光电检测器检测到的从荧光信号中生成的FIRE图像)，或者如果不执行光谱解混，则该图像在荧光团具有不同的荧光寿命时能够包括从不同荧光团的相位贡献差异中得出的伪像。

图25是光谱解混方法2500的一个非限制示例性示意图。在动作2504处，能够接收由多个光电检测器检测到的多个通道的荧光信号。例如，与不同的荧光团相关联(例如，结合并缀合)的抗体能够结合到细胞。荧光团的荧光信号能够由多个光电检测器来检测。例如，一个光电检测器能够配置为针对每个荧光团来检测荧光信号。图25示出了两个通道的FIRE波形2506c1、2506c2的两个曲线图2506p11、2506p2。在每个曲线图2506p11、2506p2的x轴线上示出了波形2506c1、2506c2的时间维度。在每个曲线图2506p1、2506p2的y轴线上示出了RIRE波形2506c1、2506c2的强度。例如，由于每个荧光团与多个通道的光谱重叠，所以每个FIRE波形2506c1、2506c2都能够含有来自每个通道中多个荧光团的信号。光谱重叠能够导致图像(例如，图像2510i1、2510i2)具有来自不同于通道所需或感兴趣的荧光团的贡献。能够对图像执行补偿，使得所得图像(例如，图像2522i1、2522i2)每个都是(或者主要是)单独一个荧光团的结果。检测到的波形2506c1、2506c2对荧光团的相位敏感。

在动作2508处，傅立叶变换(FT)(诸如滑动窗口快速傅立叶变换(FFT)或离散傅立叶变换(DFT))能够为每个通道生成原始FT图像2510i1、2510i2。每个原始图像2510i1、2510i2都能够是在频率空间中(例如，在傅立叶空间中)的复数值的像素2510i1p00、2510i1p01、2510i2p00、2510i2p01的阵列(例如，二维阵列)。滑动窗口2510w1、2510w2能够如图所示地重叠或者不重叠。能够经过对检测到的波形2506c1、2506c2进行复杂傅立叶分析来完成成像。生成的图像2510i1、2510i2能够具有复数值，并且能够是相敏的(例如，对荧光团的相位敏感)。生成的图像2510i1、2510i2的一个维度能够对应于FFT或DFT的不同频率窗口。生成的图像2510i1、2510i2的另一个维度能够对应于滑动窗口FFT或DFT的时间维度。

在动作2512处，能够执行固有相位调整。在一些实施例中，该相位调整能够最小化(例如，消除)来自不同通道的光学器件和电子器件的相位贡献。为了在图像空间中执行补偿或解混，能够首先通过例如将原始FT图像乘以通道相位调整，来导致通道之间光学器件和电子器件差异的相位贡献。固有相位校正图像2514i1、2514i2的所得集能够是复数值。能够使用特定于流式细胞仪每个读出通道的一组信号相位校正(用于校正信号相位)以用于固有相位调整。通道相位能够合并或包含明场相位、校准相位和相位偏移。通道相位调整能够校正或导致一个或更多个通道相位。

在动作2516处，能够使用解混矩阵2516m来针对图像2514i1、2514i2的每个像素2514i1p00、2514i1p01、2514i2p00、2514i2p01执行解混操作，以生成解混图像2518i1、2518i2。能够针对固有相位校正图像2514i1、2514i2的对应像素(诸如像素2514i1p00、2514i2p00和像素2514i1p01、2514i2p01)来执行补偿或解混。例如，针对两个通道的图像2514i1、2514i2而言，解混矩阵2516m的尺寸能够为2×2。解混矩阵2516m能够施加到图像2514i1、2514i2中的对应像素(诸如像素2514i1p00、2514i2p00和像素2514i1p01、2514i2p01)以生成解混图像2518i1、2518i2的对应像素(诸如像素2518i1p00、2518i2p00和像素2518i1p01、2518i2p01)的值。能够顺序地或并行地执行对对应像素的解混操作。解混图像2518i1、2518i2能够认为是荧光团的图像(或者是根据荧光团的荧光发射来生成的图像)而没有任何光谱混合(或具有最小或减少的光谱混合)。

解混操作能够取决于所执行的解混的类型。例如，解混操作能够基于面积值的补偿。能够基于复数图像值的面积或高度数据来执行补偿或解混。能够通过手工或使用任何自动补偿或解混程序来导出解混矩阵2516m。对于每个载波频率(例如，用于引发每个荧光团的荧光发射的参考激光束或本机振荡器束的频率)而言，解混矩阵2516m能够说明由于荧光团的不同荧光寿命所引起的信号强度上的差异。

在动作2520处，能够执行寿命相位校正。在对图像的每个像素执行解混之后，能够针对每个荧光团来施加寿命校正，以生成具有含复数值的像素的寿命校正图像。该调整能够校正由于荧光染料的寿命所引起的相位变化。一组“寿命校正”能够用于每个荧光团。这些能够例如使用已知值或根据所收集样本数据的计算来从每个荧光团的荧光寿命中导出。

在一些实施例中，每个像素的复数的实部能够用于针对每个荧光团来生成最终图像2522i1、2522i2的像素2522i1p00、2522i1p01、2522i2p00、2522i2p01的值。寿命校正图像的每个像素的复数值的实部或大小能够用于生成实数空间中荧光团的最终图像2522i1、2522i2。寿命校正图像的每个像素的复数值的虚部能够被丢弃，或者不被计算。能够例如通过将不同的颜色分配给不同荧光团的图像并且将不同的图像与颜色组合以生成细胞的图像，来组合不同荧光团的图像以生成细胞的图像。

在一些实施例中，方法2500的动作整体地包含线性运算，因此能够合并多个动作。该方法能够在用于分选应用的FPGA上实现。在一些实施例中，该方法的一些动作能够仅包含能够被合并的线性运算。

在一些实施例中，能够在与从常规(或非成像)激光器中激发的荧光团相混合来交叉激发的情况下实现方法2500。在交叉激发的情况下，能够测量混合总量。能够使用来自从常规激光器中激发的荧光团的图像数据，来确定交叉激发荧光团的空间分布。附加地或替代地，在相关细胞表面标记物的先验知识的情况下，含有适当空间分布的FIRE通道之一能够用作一个或更多个交叉激发荧光团的替代物。例如，如果交叉激发荧光团附接到表面标记，则能够假定该荧光团的空间分布与从FIRE通道之一中激发的荧光团的另一表面标记物的空间分布相同。

图26A-26B是示出了光谱解混的非限制示例性结果的合成图像。图26A是利用与藻红蛋白(PE)结合的抗-CD16/CD56抗体、与PE-Texas Red结合的抗-CD3抗体、与PE-Cy5结合的抗-DRAQ5抗体以及与异硫氰酸荧光素(FITC)结合的抗-CD4抗体来染色的CD3+T细胞的FIRE图像的合成图像，而无需执行光谱解混。所示的细胞全部为CD16/CD56阴性的，但是这些细胞在图26A中的图像中表现为阳性，这是由于这些细胞从带有FITC标记的抗-CD4抗体溢出到PE通道。图26B是在光谱解混之后图26A中所示的CD3+T细胞的FIRE图像的合成图像。图26B示出了本文所公开的光谱解混方法成功地消除了在细胞最终图像中的这种溢出的任何痕迹。

光谱解混方法

本文公开了细胞分选仪系统的实施例。在一些实施例中，细胞分选仪系统包括：光源(例如，激光光源)，其配置为生成具有多个不同光学频率的光束(例如，激光束)，以用于引发在不同波长处的多个荧光团的荧光发射，该多个荧光团与包括多个细胞的样本中的细胞相关。该细胞分选仪系统能够包括：多个光电检测器，其配置为检测多个荧光团的荧光发射(例如，每个光电检测器都配置为检测该多个荧光团中的荧光团的荧光发射)。细胞分选仪系统能够包括：非暂时性存储器，其配置为存储可执行指令；以及与该非暂时性存储器进行通信的处理器，硬件处理器由可执行指令来编程为：使得激光束来照射细胞以引发与该细胞相关的多个荧光团的荧光发射。该计算系统能够使得多个光电检测器来检测不同波长处的荧光发射，以获得与时间空间中多个荧光团相对应的多个通道的荧光强度数据。该计算系统能够从多个通道的荧光强度数据生成在频率空间中包括复数值的多个像素的多个原始图像。该计算系统能够针对多个通道的荧光强度数据中的每个使用一个或更多个通道相位调整，来从多个原始图像中生成在频率空间中包括复数值的多个像素的多个相位调整图像。该计算系统能够在多个相位调整图像中的对应像素的复数值上使用解混矩阵，从多个相位调整图像中生成在频率空间中包括复数值的多个像素的多个解混图像。该计算系统能够基于多个荧光团中的每个的性质，从多个解混图像中生成在频率空间中包括复数值的多个像素的多个相位校正图像。该计算系统能够基于该多个相位校正图像来确定针对细胞的分选决定。

本文公开的内容包括细胞分选仪系统的实施例。在一些实施例中，细胞分选仪系统包括：光源(例如，激光光源)，其配置为生成具有多个不同光学频率的光束(例如，激光束)，以用于引发在不同波长处的多个荧光团的荧光发射，该多个荧光团与包括多个细胞的样本中的细胞相关；多个光电检测器，其配置为检测多个荧光团的荧光发射(例如，每个光电检测器都配置为检测该多个荧光团中的荧光团的荧光发射)；非暂时性存储器，其配置为存储可执行指令；以及与该非暂时性存储器进行通信的处理器，硬件处理器由可执行指令来编程为：使得激光束来照射细胞以引发与该细胞相关的多个荧光团的荧光发射。该计算系统能够使得多个光电检测器来检测不同波长处的荧光发射，以获得与时间空间中多个荧光团相对应的多个通道的荧光强度数据。该计算系统能够从多个通道的荧光强度数据生成在频率空间中包括复数值的多个原始图像。该计算系统能够在多个原始图像中的对应复数值上使用解混矩阵，从多个原始图像中生成在频率空间中包括复数值的多个解混图像。该计算系统能够基于该多个解混图像来确定针对细胞的分选决定。

本文公开了细胞分选仪系统的实施例。在一些实施例中，细胞分选仪系统包括：光源(例如，激光光源)，其配置为生成具有多个不同光学频率的光束(例如，激光束)，以用于引发在不同波长处的多个荧光团的荧光发射，该多个荧光团与包括多个细胞的样本中的细胞相关；多个光电检测器，其配置为检测多个荧光团的荧光发射(例如，每个光电检测器都配置为检测该多个荧光团中的荧光团的荧光发射)；非暂时性存储器，其配置为存储可执行指令；以及与该非暂时性存储器进行通信的处理器，硬件处理器由可执行指令编程为：从与细胞相关的多个荧光团，接收不同波长处荧光发射的多个通道的荧光强度数据，所述多个通道的荧光强度数据对应于时间空间中的多个荧光团，其中由多个光电检测器来检测荧光发射，并且其中在由激光光源照射细胞之后引发荧光发射。该计算系统能够从荧光强度数据的多个通道中生成在频率空间中包括复数值的多个原始图像。该计算系统能够在多个原始图像中的对应复数值上使用解混矩阵，从多个原始图像中生成在频率空间中包括复数值的多个解混图像。该计算系统能够基于该多个解混图像来确定针对细胞的分选决定。

图27是示出了光谱解混的一个示例性方法2700的流程图。该方法2700可以在存储在计算机系统的计算机可读介质(诸如，一个或更多个磁盘驱动器)上的一组可执行程序指令中实施。例如，图30中所示并且在下文中更详细描述的计算系统3000能够执行一组可执行程序指令以实现方法2700。当启动方法2700时，可执行程序指令能够被加载到诸如RAM的存储器中，并且由计算系统3000的一个或更多个处理器(例如，一个或更多个现场可编程门阵列(FPGA))来执行。虽然方法2700是相对于图30中所示的计算系统3000来描述的，但是该描述仅是说明性的并且不旨在是限制性的。在一些实施例中，方法2700或其部分可以由多个计算系统来串行或并行地执行。方法2700的一些块能够被组合并且被并行地执行。方法2700能够用于针对样本的细胞来确定分选决定，或者确定样本的细胞的分选决定。

计算系统3000能够可操作地耦合到流式细胞仪(例如，参照图22来描述的流式细胞仪2200)。计算系统3000能够是细胞分选仪系统(诸如流式细胞仪)的一部分。计算系统3000能够控制光源(例如，激光光源)。能够将光源配置为生成具有多个不同光学频率的光束(例如，激光束，诸如组合束49)。不同的光学频率能够用于引发与样本的细胞相关的多个荧光团的(例如，在不同波长处的)荧光发射。计算系统3000能够接收来自多个光电检测器(例如，参照图7A-7B所描述的光电检测器106、108、110、112)的荧光信号。能够将每个光电检测器配置为检测多个荧光团中的荧光团的荧光发射。

在方法2700在块2704处开始之后，方法2700行进到块2708，在此处计算系统能够从与细胞相关的多个荧光团来接收(例如，在不同波长处)荧光发射的多个通道的荧光强度数据。例如，多个荧光团中的每个都能够与结合到细胞的细胞组分结合试剂(例如，抗体)相结合(例如，缀合)。多个通道的荧光强度数据(例如，参照图25所描述的波形2506c1、2506c2)能够对应于时间空间中的多个荧光团。例如，每个通道的荧光数据都能够包括由光电检测器在一段时间内检测到的强度值。荧光发射能够由多个光电检测器来检测。例如，参照图7A-7B来描述的光电检测器106、108、110、112能够检测并生成荧光强度数据的通道。在细胞被激光源照射后，能够引发荧光发射。

在一些实施例中，为了接收多个通道的荧光强度数据，计算系统能够使得激光束来照射细胞以引发与该细胞相关的多个荧光团的荧光发射。该计算系统能够使得多个光电检测器来检测不同波长处的荧光发射，以获得与时间空间中多个荧光团相对应的多个通道的荧光强度数据。

方法2700从块2708行进到块2712，在此处计算系统能够从多个通道的荧光强度数据来生成在频率空间(例如，傅立叶空间)中包括复数值的多个像素(例如，参照图25所描述的像素2510i1p00、2510i1p01、2510i2p00、2510i2p01)的多个原始图像(例如，参照图25所描述的原始图像2510i1、2510i2)。该计算系统能够使用表示时间-频率空间变换的时频变换矩阵来生成多个原始图像。多个原始图像能够包括多个原始图像的复数值的多个像素。

在一些实施例中，激光束包括参考激光束(例如，LO束)和多个射频频移激光束(例如，RF梳形束24)。多个射频频移激光束的数量能够为m₂。参考激光束能够与多个射频频移激光束在空间上重叠。在一些实施例中，多个射频频移激光束彼此都没有在空间上重叠。参考激光束和多个射频频移激光束中的一个或更多个能够引发多个荧光团中的荧光团的荧光发射。照射细胞能够包括利用多个射频频移激光束来同时地照射细胞的多个空间位置(或者参照图4所描述的样本62的多个空间位置60)。在一些实施例中，细胞的多个空间位置都没有彼此重叠。

在一些实施例中，多个荧光团中的两个的荧光发射在光谱上重叠。多个荧光团中的三个的荧光发射在光谱上重叠。多个荧光团中的五个的荧光发射在光谱上重叠。多个荧光团中的第一荧光团和第二荧光团的荧光发射在光谱上重叠，并且多个荧光团中的第二荧光团和第三荧光团的荧光发射在光谱上重叠。第一荧光团和第三荧光团的荧光发射在光谱上重叠。

在一些实施例中，为了生成多个原始图像，该计算系统能够使用时间-频率空间变换，从多个通道的荧光强度数据生成在频率空间中的多个原始图像。时间-频率空间变换能够包括傅立叶变换。傅立叶变换能够包括离散傅立叶变换。离散傅立叶变换能够包括快速傅立叶变换。傅立叶变换能够包括滑动窗口傅立叶变换。滑动窗口傅立叶变换的滑动窗口的尺寸能够为m₁。例如，滑动窗口的尺寸能够为、大约为、至少为或至多为m₁个数据点(例如，一个通道的荧光强度数据的m₁个数据点，诸如m₁个连续数据点)，诸如5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000、2000、5000、10000、20000、50000、100000、200000、500000、1000000、2000000、5000000、10000000个数据点，或这些值中任两个之间的数或范围个的数据点。作为另一示例，滑动窗口的尺寸能够为、大约为、至少为或至多为m₁秒，诸如1×10^-1、2×10^-1、5×10^-1、1×10^-2、2×10^-2、5×10^-2、1×10^-3、2×10^-3、5×10^-3、1×10^-4、2×10^-4、5×10^-4、1×10^-5、2×10^-5、5×10^-5、1×10^-6、2×10^-6、5×10^-6、1×10^-7、2×10^-7、5×10^-7、1×10^-8、2×10^-8、5×10^-8、1×10^-9、2×10^-9、5×10^-9秒，或这些值中任两个之间的数或范围的秒。滑动窗口傅立叶变换的所有滑动窗口都能够具有相同的尺寸。滑动窗口傅立叶变换的滑动窗口的尺寸能够为2、5、10、20、50、100或更大。尺寸相同的滑动窗口傅立叶变换的滑动窗口的数量能够为5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000或更多。在一些实施例中，没有任一个滑动窗口重叠。在一些实施例中，滑动窗口的两个或更多个重叠。例如，两个滑动窗口能够重叠、重叠大约、重叠至少或重叠至多5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000、2000、5000、10000、20000、50000、100000、200000、500000、1000000、2000000、5000000、10000000个数据点，或这些值中任两个之间的数或范围个的数据点。作为另一示例，两个滑动窗口能够重叠、重叠大约、重叠至少或重叠至多1×10^-1、2×10^-1、5×10^-1、1×10^-2、2×10^-2、5×10^-2、1×10^-3、2×10^-3、5×10^-3、1×10^-4、2×10^-4、5×10^-4、1×10^-5、2×10^-5、5×10^-5、1×10^-6、2×10^-6、5×10^-6、1×10^-7、2×10^-7、5×10^-7、1×10^-8、2×10^-8、5×10^-8、1×10^-9、2×10^-9、5×10^-9秒，或这些值中任两个之间的数或范围的秒。例如，两个滑动窗口能够重叠、重叠大约、重叠至少或重叠至多滑动窗口之一的宽度的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.9％。

在块2712处生成多个原始图像之后，该方法2700行进到块2716，其中该计算系统能够针对多个通道的荧光强度数据中的每个使用一个或更多个通道相位调整，来从多个原始图像中生成在频率空间中包括复数值的多个像素(例如，参照图25所描述的像素2514i1p00、2514i1p01、2514i2p00、2514i2p01)的多个相位调整图像(例如，参照图25所描述的相位校正图像2514i1、2514i2)。该计算系统能够使用表示一个或更多个通道相位调整的一个或更多个通道相位调整矩阵来生成多个相位调整图像。

在一些实施例中，该计算系统能够针对多个通道的荧光强度数据中的每个使用一个或更多个通道相位调整，来从多个原始图像中生成在频率空间中包括复数值的多个相位调整图像。多个相位调整图像能够包括多个相位调整图像的复数值的多个像素。

在一些实施例中，一个或更多个通道相位调整校正，包括针对多个通道中每个通道的明场相位、校准相位和相位偏移的通道相位(例如，特定于通道的相位)。为了生成多个相位调整图像，该计算系统能够针对多个通道中的每个通道：将与该通道对应的多个原始图像中的原始图像的复数值与一个或更多个通道相位调整相乘，以生成与该通道相对应的多个相位调整图像中的相位调整图像。为了生成多个相位调整图像，该计算系统能够针对多个原始图像中的每个原始图像：将原始图像的复数值与针对与原始图像相对应通道的一个或更多个通道相位调整相乘，以生成多个相位调整图像中的相位调整图像。

一个或更多个通道相位调整能够包括或者仅包括复数值。一个或更多个通道相位调整能够包括一个或更多个实数值。通道的通道相位矩阵能够包括针对该通道的一个或更多个通道相位调整。通道相位调整矩阵的尺寸能够为n₁×n₁。在一些实施例中，通道相位调整矩阵能够是对角矩阵。例如，仅通道相位调整矩阵的对角元素为非零。通道相位调整矩阵的对角元素能够是复数值，或者能够全部是复数值。为了生成多个相位调整图像，该计算系统能够针对多个通道中的每个通道：将与该通道对应的多个原始图像中的原始图像的每行的复数值与针对该通道的通道相位调整矩阵相乘，以生成与该通道相对应的多个相位调整图像中的相位调整图像的对应行。为了生成多个相位调整图像，该计算系统能够针对多个原始图像中的每个原始图像：将原始图像的每行的复数值与针对该通道的通道矩阵相乘，以生成多个相位调整图像中的相位调整图像的对应行。用于针对每个通道来校正一个或更多个通道相位的通道相位调整矩阵对于该通道而言能够是唯一的。该计算系统能够确定或接收一个或更多个通道相位调整。

2019年3月22日提交的作为优先权的美国申请62/822,789的附录A显示了一种执行相位校准(例如，以用于生成相位调整图像)的非限制性示例性方法，该专利的公开内容通过引用并入本文。2019年3月22日提交的作为优先权的美国申请62/822,789的附录B显示了一种同时测量许多频率处相位的非限制性示例性方法，该专利的公开内容通过引用并入本文。

方法2700从块2716行进到块2720，在此处计算系统能够在多个相位调整图像的对应像素(例如，参照图25所描述的像素2514i1p00、2514i2p00和像素2514i1p01、2514i2p01)的复数值上使用解混矩阵(例如，参照图25所描述的解混矩阵2516m)，来从多个相位调整图像生成在频率空间中包括复数值的多个像素(例如，参照图25所描述的像素2518i1p00、2518i2p00和像素2518i1p01、2518i2p01)的多个解混图像(例如，参照图25所描述的解混图像2518i1、2518i2)。每个解混图像能够认为是荧光团的图像(或者从荧光团的荧光发射中生成的图像)，而无需来自其他荧光团的荧光发射的任何光谱混合(或具有最小或减少的光谱混合)。为了生成多个解混图像，该计算系统能够在多个相位调整图像的对应复数值上使用解混矩阵，来从多个相位调整图像中生成多个解混图像。

在一些实施例中，为了生成多个解混图像，该计算系统能够生成包括多个相位调整图像的对应像素(例如，参照图25所描述的像素2514i1p00、2514i2p00和像素2514i1p01、2514i2p01)的复数值的向量。该计算系统能够将该向量与解混矩阵(例如，参照图25所描述的解混矩阵2516m)相乘，以生成包括解混复数值(例如，参照图25所描述的像素2518i1p00、2518i2p00和像素2518i1p01、2518i2p01的值)的解混向量。该计算系统能够生成包括具有解混复数值的对应像素的多个解混图像。向量的尺寸能够为1×n₁，解混矩阵的尺寸能够为n₁×n₂，和/或解混向量的尺寸能够为1×n₂。例如，n₁和/或n₂能够为1、2、3、4、5、6、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000，或者为这些值中任两个之间的数或范围。为了生成多个解混图像，该计算系统能够针对多个相位调整图像中的对应像素，在该对应像素的复数值上使用多个解混矩阵中的解混矩阵来从多个相位调整图像中生成多个解混图像。多个解混矩阵能够包括m₂个解混矩阵，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000个解混矩阵，或这些值中任两个之间的数或范围个的解混矩阵。解混矩阵能够包括或者仅包括实数值和/或复数值。

在一些实施例中，(1)多个光电检测器的数量、多个原始图像的数量和/或多个相位调整图像的数量(例如，n₁)，以及(2)多个荧光团的数量、多个解混图像的数量和/或相位校正图像的数量(例如，n₂)能够是相同的。在一些实施例中，(1)多个光电检测器的数量、多个原始图像的数量和/或多个相位调整图像的数量(例如，n₁)，以及(2)多个荧光团的数量、多个解混图像的数量和/或相位校正图像的数量(例如，n₂)能够是不同的。例如，多个相位调整图像的数量(例如，n₁)能够小于多个解混图像的数量(例如，n₂)。作为另一示例，多个相位调整图像的数量(例如，n₁)能够大于多个解混图像的数量(例如，n₂)。例如，能够从由多个光电检测器中的不同光电检测器所检测到的荧光强度数据或者从多个光电检测器中的不同光电检测器所接收到的荧光强度数据(例如，在变换到频率空间和/或相位经调整之后)，来生成多个相位调整图像中的每个。多个原始图像的数量、多个相位调整图像的数量以及多个光电检测器的数量能够相同(例如，n₁)。能够通过或使用多个光电检测器来检测多个荧光团的荧光强度数据。多个相位校正图像中的每个(和/或多个解混图像中的每个)能够对应于多个荧光团之一。多个解混图像的数量、多个相位校正图像的数量以及多个荧光团的数量能够相同(例如，n₂)。能够使用更多个光电检测器来检测更少荧光团的荧光发射。例如，能够使用10个光电检测器来生成八个荧光团的荧光发射的荧光强度数据的10个通道。多个解混图像中的每个都能够对应于多个荧光团中的一个荧光团。多个解混图像中的每个都能够是多个荧光团中的一个荧光团的图像。

正方形解混矩阵。能够在通道数量等于荧光团数量的情况下(例如，针对区域数据)执行补偿。解混矩阵能够计算一次，并且用于所有事件以及每个事件中的所有像素。图28A是利用正方形解混矩阵来实施光谱解混的示意图。解混矩阵也称为溢出矩阵。图28A示出，如果通道的数量(示出为三个，由检测器D1、D2和D3来收集)和荧光团的数量(示出为三个，标记为FL1、FL2和FL3)相同，则正方形解混矩阵(或正方形混合矩阵的逆)M^-1能够用于从检测到的值D来确定解混值F。在图28A中示出的示例中，由检测器D1检测到的荧光发射包括荧光团FL1的荧光发射的100％(例如，由D1检测到的FL1的荧光发射被归一化为100％)、荧光团FL2的荧光发射的15％(例如，相对于归一化为100％的由D1检测到的FL1的荧光发射)以及荧光团FL3的荧光发射的1％(例如，相对于归一化为100％的由D1检测到的FL1荧光发射)。由检测器D2检测到的荧光包括荧光团FL2的荧光发射的100％、荧光团FL1的荧光发射的12％以及荧光团FL3的荧光发射的0％。由检测器D3检测到的荧光包括荧光团FL3的100％、荧光团FL1的1％以及荧光团FL2的20％。来自三个荧光团的荧光发射与由三个检测器检测到的荧光发射之间的关系能够表示为D＝M*F。能够使用M^-1来执行光谱解混。例如，能够使用M^-1、通过例如确定M^-1*D，来从荧光发射D确定三个荧光团F的荧光发射。

非正方形解混矩阵。当我们使用比荧光团更多(或更少)的通道时，能够执行光谱解混。图28B1-28B2是利用非正方解混矩阵来实施光谱解混并确定非正方形解混矩阵的示意图。光电检测器的数量和荧光团的数量能够不同，并且非正方形解混矩阵能够用于由光电检测器检测到的荧光强度数据的光谱解混。在图28B1中所示的示例中，12个光电检测器检测三个荧光团的荧光发射，以生成12个通道的荧光强度数据。每个通道的荧光强度数据都能够包括多个像素，该多个像素具有在块2712处的时间-频率空间变换之后并且在执行参照图27所描述的块2716处的相位调整之后在图像(例如，原始图像或相位调整图像)的频率空间中的值。例如，图28B中的D1，...，D12中的每个都能够是参照图27所描述的多个原始图像或相位调整图像中的每个的对应像素。例如，D1和D2能够是参照图25所描述的两个通道的相位调整图像的像素2514i1p00、2514i2p00。作为另一示例，D1和D2能够是参照图25所描述的两个通道的原始图像的像素2510i1p00、2510i2p00。D1，...，D12能够对应于来自对应于一个频率窗口或拍频的12个通道中的12个像素。作为另一示例，图28B1中的D1能够包括对应于(例如，拍频的)不同频率窗口的多个像素。类似地，D2，...D12中的每个都能够包括对应于不同频率窗口的多个像素。D1，...，D12中的每个的尺寸能够是m₂×1。图28B2示出，如果通道的数量和荧光团的数量不同，则能够使用用于光谱解混的普通最小二乘法(OLS)和/或加权最小二乘法(WLS)来确定解混矩阵。

计算系统能够接收和/或确定解混矩阵或多个解混矩阵(例如，m₂)。在一些实施例中，能够使用普通最小二乘法(OLS)、加权最小二乘法(WLS)、泊松回归或它们的组合，来确定解混矩阵(或多个解混矩阵，一个解混矩阵用于每个频率窗口或像素，或者一个解混矩阵用于两个或更多频率窗口或像素)。能够使用其他方法来确定解混矩阵。

普通最小二乘法。在一些实施例中，能够利用普通最小二乘法(例如，用于面积数据)来一次确定解混矩阵，并将其用于光谱解混(例如，以如图28B2所示出地来确定)。能够利用用于所有事件(以及每个事件中的所有像素)的奇异结果来一次计算解混矩阵。利用普通最小二乘法来确定解混矩阵和/或利用这种解混矩阵来执行光谱解混能够快速地计算(例如，基于所需计算的数量)。

加权最小二乘法。在一些实施例中，能够使用加权最小二乘法来确定解混矩阵。基于加权最小二乘法来确定的解混矩阵能够解释或校正泊松噪声(例如，像素值的方差能够随着该值增加)。可能必须经由对于每个多个对应像素的矩阵求逆来确定解混矩阵(或用于不同频率窗口或像素的多个解混矩阵)。能够经由针对每个事件(例如，不同通道的每个多个对应像素的值，或者来自滑动窗口傅立叶变换中对应滑动窗口的不同通道的不同频率窗口的所有对应像素的值)的矩阵求逆来确定解混矩阵。例如，能够经由针对两个通道中相位调整图像的对应像素2514i1p00、2514i2p00进行矩阵求逆来确定解混矩阵(或者图28B2中的矩阵W)，能够经由参照图25所描述的两个通道中相位调整图像的对应像素2514i1p01、2514i2p01进行矩阵求逆来确定另一解混矩阵。利用加权最小二乘法来确定解混矩阵和/或利用这种解混矩阵来执行光谱解混，能够比利用普通最小二乘法来确定解混矩阵和/或利用这种解混矩阵来执行光谱解混的计算量要更大。

由于使用加权矩阵W，所以WLS的计算开销可能比OLS高(例如，高得多)。可能需要针对每个事件来重新计算解混矩阵。计算混合矩阵需要矩阵求逆，这在计算上是昂贵的。进入权重矩阵的权重能够基于每个像素值(或每个量度)的方差的估计。对于每个像素(或每个多个对应像素)，权重矩阵能够不同。方差计算能够取决于FIRE测量中固有的统计信息。对于每个事件中的每个像素(或每个多个对应像素)，WLS能够需要不同和/或新的解混矩阵计算。

泊松回归。在一些实施例中，能够使用泊松回归和/或基于泊松噪声模型的广义线性模型来确定解混矩阵(或用于不同频率窗口或像素的多个解混矩阵)。例如，能够使用最大似然估计(MLE)、使用诸如凸优化技术的优化技术来确定解混矩阵。使用泊松回归来确定解混矩阵能够包含逐事件凸优化求解。使用泊松回归来确定的解混矩阵和/或使用这种解混矩阵来执行光谱解混能够正确地说明或校正噪声(例如，每通道噪声)。在一些实施例中，使用泊松回归来确定的解混矩阵能够胜过使用普通最小二乘法或加权最小二乘法来确定的解混矩阵。利用泊松回归来确定解混矩阵和/或利用这种解混矩阵来执行光谱解混，能够比利用加权最小二乘法来确定解混矩阵和/或利用这种解混矩阵来执行光谱解混的计算量要更大。

参照图27，在块2720处生成多个解混图像之后，方法2700行进至块2724，在此处，计算系统能够基于多个荧光团中每个的特性来从多个解混图像中生成多个相位校正图像。该计算系统能够针对荧光团使用表示多个荧光团相位校正的多个荧光团相位校正矩阵来生成多个相位校正图像。每个相位校正图像能够在频率空间中包括复数值的多个像素。多个相位校正图像能够包括多个相位校正图像的复数值的多个像素。该计算系统能够基于多个荧光团中的每个的性质，从多个解混图像中生成在频率空间中包括复数值的多个相位校正图像。该计算系统能够确定或接收针对荧光团的多个荧光团相位校正。

在一些实施例中，每个相位校正图像能够在频率空间中包括实数值的多个像素。多个相位校正图像能够包括多个相位校正图像的实数值的多个像素。该计算系统能够基于多个荧光团中的每个的性质，从多个解混图像中生成在频率空间中包括实数值的多个相位校正图像。

在一些实施例中，为了生成多个相位校正图像，该计算系统能够使用与通道对应的多个荧光团中的荧光团的多个荧光团相位校正(例如，时间)，来从与多个通道中的通道相对应的多个解混图像中的解混图像中生成多个相位校正图像中的相位校正图像。在一些实施例中，为了生成多个相位校正图像，该计算系统能够使用多个荧光团中的荧光团的一个或更多个荧光团相位校正(例如，一组寿命校正)，来从与多个荧光团中的荧光团相对应的多个解混图像中的解混图像中生成多个相位校正图像中的相位校正图像。针对荧光团进行的多个荧光团相位校正能够与荧光团的性质有关。荧光团的性质能够包括荧光团的寿命。针对荧光团的多个荧光团相位校正能够包括复数值。

为了生成多个相位校正图像，该计算系统能够针对多个解混图像中的每个解混图像：将解混图像的每行的复数值与针对该荧光团的荧光团相位校正矩阵相乘，以生成与荧光团相对应的多个相位校正图像中的相位校正图像的对应行。针对荧光团的荧光团相位校正矩阵能够包括针对该荧光团的一个或更多个荧光团相位校正。针对荧光团的荧光团相位校正矩阵对于该荧光团而言能够是唯一的。荧光团相位校正矩阵能够包括或仅包括一个或更多个复数值。荧光团相位校正矩阵能够包括一个或更多个实数值。荧光团相位校正矩阵的尺寸能够为n₂×n₂。在一些实施例中，荧光团相位校正矩阵能够是对角矩阵。例如，仅荧光团相位校正矩阵的对角元素为非零。荧光团相位校正矩阵的对角元素能够是复数值，或者能够全部是复数值。荧光团相位校正矩阵对于每个荧光团而言都能够是唯一的。

在一些实施例中，每个通道相位调整矩阵(或通道相位调整)包括具有复数值的元素。每个通道相位调整矩阵能够包括仅具有复数值的元素。每个通道相位调整矩阵能够包括具有实数值的一个或更多个元素(例如，复数值的虚部为零)。在一些实施例中，每个解混矩阵都包括具有实数值的元素。每个解混矩阵能够包括仅具有实数值的元素。在一些实施例中，每个荧光团相位校正矩阵都包括具有复数值的元素。每个通道相位调整矩阵能够包括仅具有复数值的元素。每个通道相位调整矩阵能够包括具有实数值的一个或更多个元素(例如，复数值的虚部为零)。

在一些实施例中，每个原始图像都包括具有复数值的像素。每个原始图像都能够包括仅具有复数值的像素。每个原始图像都能够包括具有实数值的一个或更多个像素。在一些实施例中，每个相位调整图像都包括具有复数值的像素。每个相位调整图像都能够包括仅具有复数值的像素。每个相位调整图像都能够包括具有实数值的一个或更多个像素。在一些实施例中，每个解混图像都包括具有复数值的像素。每个解混图像都能够包括仅具有复数值的像素。每个解混图像都能够包括具有实数值的一个或更多个像素。

在一些实施例中，每个相位校正图像都包括具有复数值的像素。每个相位校正图像都能够包括仅具有复数值的像素。每个相位校正图像都能够包括具有实数值的一个或更多个像素。每个相位校正图像都能够包括仅具有实数值的像素。例如，针对荧光团的荧光团相位校正矩阵能够将荧光团的解混图像的像素的复数值旋转到实部的轴，以使得荧光团相位校正图像的每个像素的虚部为零。作为另一示例，针对荧光团的荧光团相位校正矩阵能够将荧光团的解混图像的像素的复数值旋转到实部的轴线，以使得荧光团相位校正图像的每个像素的虚部接近于零并被丢弃(或完全不计算)。

图29示意性地示出了荧光团相位校正。荧光团的解混图像的像素能够是包括信号相位S和噪声相位N的复数值。能够对像素的复数值进行相位校正。基于荧光团的寿命，能够确定针对荧光团的荧光团相位(例如，与像素的拍频相对应的荧光团相位)，并将其用于荧光团相位校正。例如，荧光团相位能够是(或基于)其能够用于确定针对荧光团的荧光团相位校正。荧光团相位校正(例如，以荧光团相位校正矩阵的形式)能够用于校正解混图像的像素的荧光团相位。图29示出了相位校正之后的像素的复数值的实部比像素的复数值的幅度更接近于解混图像中像素的复数值的信号。在一些实施例中，能够通过基于荧光团的已知相位来移位(例如，利用荧光团相位校正来旋转)对应于荧光团的解混图像的每个像素的复数值并取荧光团相位校正之后的像素的复数值的实部，从而实现更高的信噪比。

参照图27，在一些实施例中，多个原始图像的数量、多个相位调整图像的数量、多个解混图像的数量以及多个相位校正图像的数量是相同的。多个原始图像的数量、多个相位调整图像的数量、多个解混图像的数量和/或多个相位校正图像的数量能够为n₁。多个原始图像能够与第一时间维度和第一频率维度相关联。多个相位调整图像能够与第二时间维度和第二频率维度相关联。多个解混图像能够与第三时间维度和第三频率维度相关联。多个相位校正图像能够与第四时间维度和第四频率维度相关联。

第一时间维度、第二时间维度、第三时间维度和第四时间维度中的两个或更多个沿着该维度能够具有相同的尺寸和/或相同数量的像素。第一时间维度、第二时间维度、第三时间维度和第四时间维度能够具有相同的尺寸和/或相同数量的像素。第一频率维度、第二频率维度、第三频率维度和/或第四频率维度能够具有m₂的尺寸和/或m₂个像素(或傅立叶变换窗口)，诸如5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000、2000、5000、10000、20000、50000、100000、200000、500000、1000000、2000000、5000000、10000000个数据点，或这些值中任两个之间的数或范围个的数据点。第一频率维度、第二频率维度、第三频率维度和第四频率维度中的一个或更多个能够具有相同的尺寸和/或相同数量的像素。第一频率维度、第二频率维度、第三频率维度和第四频率维度能够具有相同的尺寸和/或相同数量的像素。在不同的实现方式中，m₂和m₁能够不同。例如，m₂能够等于1/2*m₁。作为另一示例，m₂小于1/2*m₁。m₂和1/2*m₁能够相差、大约相差、至少相差或至多相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000、5000、10000、20000、50000、100000、200000、500000、1000000、2000000、5000000、10000000，或这些值中任两个之间的数或范围。

沿着第一频率维度的像素尺寸和/或像素数量、沿着第二频率维度的像素尺寸和/或像素数量、沿着第三频率维度的像素尺寸和/或像素数量和/或者第四频率维度的像素尺寸和/或像素数量能够与多个射频频移激光束的数量相同。沿着第一频率维度的像素、沿着第二频率维度的像素、沿着第三频率维度的像素和/或沿着第四频率维度的像素能够对应于多个射频频移激光束。与射频频移激光束或该射频频移激光束的频率不对应的傅立叶变换(例如，离散傅立叶变换)的窗口能够被丢弃(或不计算)。沿着第一频率维度的像素、沿着第二频率维度的像素、沿着第三频率维度的像素和/或沿着第四频率维度的像素能够对应于细胞的多个空间位置。

在一些实施例中，该计算系统能够基于多个相位校正图像的复数值的实部，来生成多个相位校正图像的多个视觉表示。该计算系统能够基于多个相位校正图像的复数值的幅度，来生成多个相位校正图像的多个视觉表示。该计算系统能够从多个相位校正图像的多个视觉表示中生成组合视觉表示(例如，图26B中所示的细胞的图像)。为了生成组合视觉表示，计算系统能够将颜色分配给多个视觉表示(或对应荧光团)中的每个；基于分配给视觉表示的颜色来生成多个视觉表示中的多个彩色视觉表示，并且组合该多个彩色视觉表示以生成组合视觉表示。

方法2700从块2724行进到块2728，在此处，计算系统基于多个相位校正图像来确定针对细胞的分选决定。为了确定该分选决定，该计算系统能够基于该多个相位校正图像来确定对于细胞的分选决定。为了确定分选决定，该计算系统能够基于多个相位校正图像的多个视觉表示来确定针对细胞的分选决定。为了确定分选决定，硬件处理器由可执行指令编程为：基于分选决定阈值以上的多个相位校正图像的一个或更多个的像素数量来确定针对细胞的分选决定。该分选决定阈值能够为、大约为、多于或少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000，或这些值中任两个之间的数或范围。为了确定分选决定，硬件处理器由可执行指令编程为：基于分选决定阈值以上的多个相位校正图像的一个或更多个的像素百分比来确定针对细胞的分选决定。该分选决定阈值能够为、大约为、多于或少于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％，或这些值中任两个之间的数或范围。方法2700在块2732处结束。

块2712、2716、2720、2724和2728中的两个或更多个能够一起执行。在一些实施例中，计算系统能够执行以下中的两个或更多个：生成多个原始图像、生成多个相位调整图像、生成多个解混图像，并且生成多个相位校正图像是使用包括或表示时频变换矩阵、通道相位调整矩阵、解混矩阵和荧光团相位校正矩阵的中两个或更多个的组合矩阵来执行的。为了生成多个原始图像并生成多个相位调整图像，计算系统能够使用包括或表示时频变换矩阵以及通道相位调整矩阵的组合矩阵，从多个通道的荧光强度数据生成多个相位调整图像。为了生成多个解混图像并生成多个相位校正图像，计算系统能够使用包括或表示解混矩阵以及荧光团相位校正矩阵的组合矩阵，从多个相位调整图像中生成多个相位校正图像。例如，能够将多个相位调整图像的对应像素行(例如，相位调整图像2514i1的像素2514i1p00、2514i1p01，...和相位调整图像2514i2的像素2514i2p00、2514i2p01，...)组合成行向量。能够将该行向量乘以包括或表示解混矩阵和荧光团相位校正矩阵的组合矩阵，以生成包括多个相位校正图像的对应像素行(例如，相位校正图像2522i1的像素2522i1p00、2522i1p01、...和相位校正图像2522i2的像素2522i2p00、2522i2p01、...)的行向量。为了生成多个原始图像、生成多个相位调整图像、生成多个解混图像以及生成多个相位校正图像，计算系统能够使用包括或表示时频变换矩阵、通道相位调整矩阵、解混矩阵和荧光团相位校正矩阵的组合矩阵，从多个通道的荧光强度生成多个相位校正图像。

在一些实施例中，该计算系统能够从多个相位校正图像中生成多个通道的校正荧光强度数据的。为了生成多个通道的校正荧光强度数据，该计算系统能够使用频率-空间到时间-空间变换来从多个相位校正图像中生成多个通道的校正荧光强度数据。该计算系统能够基于多个通道的校正荧光强度数据来确定细胞特征的估计。确定分选决定能够包括基于如本文所描述的细胞特征的估计(诸如参照图14A、14C、14D、16、18、19A、19B、20A、20B、和28所描述的方法，或其部分)来确定细胞的分选决定。细胞特征能够包括细胞尺寸、细胞在两个不同维度上的尺寸之比、与细胞相关的多个荧光团中的两个或更多个对荧光发射的共定位、细胞的细胞质和细胞核的尺寸之比、细胞的荧光发射的点状程度、荧光发射的空间分布量度、细胞位置或定向量度、细胞偏心率量度、细胞与参考细胞的相似性量度、细胞处于激光束焦点中的程度的量度、或者其组合。

执行环境

在图30中描绘了一个示例计算装置3000的总体架构，该示例计算装置被配置为实现本文所公开的代谢物、注释和基因整合系统。图30中所描绘的计算装置3000的总体架构包含计算机硬件和软件部件的布置。计算装置3000可以包括比图30中所示的元件更多(或更少)的元件。然而，没有必要将所有这些通常的常规元件都显示出来以便提供一种可行的公开方式。如图所示，计算装置3000包含处理单元3010、网络接口3020、计算机可读介质驱动器3030、输入/输出装置接口3040、显示器3050和输入装置3060，所有这些都可以通过通信总线来与彼此通信。网络接口3020可以提供到一个或更多个网络或计算系统的连接性。处理单元3010因此可以经由网络来从其他计算系统或服务中接收信息和指令。处理单元3010还可以通信到存储器3070并且从其通信，并且还经由输入/输出装置接口3040来向可选显示器3050提供输出信息。输入/输出装置接口3040还可以接受来自可选输入装置3060的输入，该可选输入装置诸如为键盘、鼠标、数字笔、麦克风、触摸屏、手势识别系统、语音识别系统、游戏板、加速计、陀螺仪或其他输入装置。

存储器3070可以含有处理单元3010执行以实现一个或更多个实施例的计算机程序指令(在一些实施例中被分组为模块或部件)。存储器3070大体上包含RAM、ROM和/或其他持久性、辅助性或非暂时性计算机可读介质。存储器3070可以存储操作系统3072，该操作系统提供计算机程序指令以供计算装置3000的一般管理和操作中的处理单元3010来使用。存储器3070还可以包含用于实现本公开各个方面的计算机程序指令和其他信息。

例如，在一个实施例中，存储器3070包括用于执行光谱解混(诸如参照图25所描述的光谱解混方法2500和参照图27所描述的光谱解混方法2700)的光谱解混模块3074。另外，存储器3070可以包括数据存储区3090和/或一个或更多个其他数据存储区或者与之通信，这些数据存储区存储荧光发射或信号、原始图像、相位调整图像、解混图像、相位校正图像和/或分选决定。

术语

如本文所使用的，术语“确定了”或“确定”涵盖各种各样的动作。例如，“确定”可以包含数学计算、计算、处理、推导、调查、查找(例如，在表、数据库或另一数据结构中查找)、查明等。而且，“确定”还可以包含接收(例如，接收信息)、访问(例如，访问存储器中的数据)等。而且，“确定”还可以包含解析、选定、选择、建立等。

如本文所使用的，术语“提供了”或“提供”涵盖各种各样的动作。例如，“提供”可以包含将值存储在存储装置的位置中以供后续检索、经由至少一个有线或无线通信介质将值直接发送给接收者、发送或存储对值的引用等。“提供”还可以包含经由硬件元件的编码、解码、加密、解密、证实、验证等。

如本文所使用的，术语“选定性地”或“选定性的”可以涵盖各种各样的动作。例如，“选定性的”过程可以包含从多个选项中确定一个选项。“选定性的”过程可以包含以下中的一个或更多个：动态确定的输入、预配置的输入或用于进行确定的用户启动的输入。在一些实现方式中，可以包含n-输入开关以提供选定性功能，其中n是用于进行选定的输入的数量。

如本文中所使用的，术语“消息”涵盖了用于通信(例如，发送或接收)信息的各种格式。消息可以包含信息(诸如XML文档、固定字段消息、逗号分隔的消息等)的机器可读集合。在一些实现方式中，消息可以包含用于发送信息中的一个或更多个表示的信号。尽管以单数形式叙述，但应当理解，消息可以以多个部分来组成、发送、存储、接收等。

如本文所使用的，“用户界面”(也称为交互式用户界面、图形用户界面或UI)可以是指基于网络的界面，该界面包含数据字段、按钮或者用于接收输入信号或用于提供电子信息或用于响应于任何接收到的输入信号来向用户提供信息的其他交互式控件。能够使用诸如超文本标记语言(HTML)、JAVASCRIPT^TM、FLASH^TM、JAVA^TM、.NET^TM、WINDOWS OS^TM、macOS^TM、web服务或丰富站点摘要(RSS)的技术来全部或部分地实现UI。在一些实现方式中，UI可以被包含在被配置为根据所描述的一个或更多个方面进行通信(例如，发送或接收数据)的独立客户端(例如，厚客户端、胖客户端)中。

如本文所使用的，“数据存储区”可以实施在由装置(诸如访问装置、服务器或所描述的其他计算装置)可访问或可访问到这些装置的硬盘驱动器、固态存储器和/或任何其他类型的非暂时性计算机可读存储介质中。如本领域中已知的，在不背离本公开的范围的情况下，数据存储区还可以或者替代地在多个本地和/或远程存储装置上分布或分区。在其他实施例中，数据存储区可以包含或实施在数据存储网络服务中。

本领域技术人员将理解，可以使用各种不同技术手段或技术中的任一种来表示信息、消息和信号。例如，在整个以上描述中可能引用的数据、指令、命令、信息、信号、位、符号和芯片可以由电压、电流、电磁波、磁场或颗粒、光学场或颗粒、或者它们的任何组合来表示。

本领域技术人员还将理解，结合本文所公开实施例来描述的各种说明性的逻辑块、模块、电路和算法步骤可以被实现为电子硬件、计算机软件或两者的组合。为了清楚地说明硬件和软件的这种可互换性，上文已经大体上在其功能方面描述了各种说明性的部件、块、模块、电路和步骤。是将这种功能性实现为硬件还是实现为软件取决于特定的应用和施加在整个系统上的设计约束。技术人员可以针对每个特定应用以各种方式来实现所描述的功能，但是这种实现方式决定不应被解释为导致脱离本发明的范围。

本文所描述的技术可以以硬件、软件、固件或它们的任何组合来实现。这样的技术可以在各种装置(诸如专门编程的事件处理计算机、无线通信装置或集成电路装置)中的任一种中实现。被描述为模块或部件的任何特征都可以在集成逻辑装置中一起实现，或者也可以分别作为离散但可互操作的逻辑装置来实现。如果以软件来实现，则技术可以由计算机可读数据存储介质来至少部分地实现，该计算机可读数据存储介质包括程序代码，该程序代码包含在被执行时执行上述一个或更多个方法的指令。计算机可读数据存储介质可以形成计算机程序产品的一部分，该计算机程序产品可以包含包装材料。计算机可读介质可以包括存储器或数据存储介质，诸如随机存取存储器(RAM)(诸如同步动态随机存取存储器(SDRAM))、只读存储器(ROM)、非易失性随机存取存储器(NVRAM)、电可擦可编程只读存储器(EEPROM)、闪存、磁或光学数据存储介质等。计算机可读介质可以是非暂时性存储介质。附加地或替代地，该技术可以由计算机可读通信介质来至少部分地实现，该计算机可读通信介质(诸如传播的信号或波)以指令或数据结构的形式来携带或通信程序代码，并且能够由计算装置来访问、读取和/或执行。

程序代码可以由专门编程的分选策略处理器来执行，该处理器可以包含一个或更多个处理器，诸如一个或更多个数字信号处理器(DSP)、可配置的微处理器、专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)或其他等效的集成或离散的逻辑电路。这样的图形处理器可以特别地被配置为执行本公开中所描述的任何技术。计算装置的组合，例如DSP与微处理器、多个微处理器、与DSP内核结合的一个或更多个微处理器、或至少部分数据连接中的任何其他此类配置的组合，都可以实现所描述的一个或更多个特性。在一些方面，本文所描述的功能可以被提供在被配置为用于编码和解码的专用软件模块或硬件模块中，或者被并入在专用分选控制卡中。

本领域技术人员将理解，通常在本文中，并且尤其是在所附权利要求书(例如，所附权利要求书的主体)中所使用的术语通常旨在作为“开放性”术语(例如，术语“包括”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“至少具有”，术语“包含”应解释为“包含但不限于”等等)。本领域技术人员还将理解，如果意图为一定数量的所引入的权利要求条款，则该意图将在权利要求中明确地叙述，并且在不存在这种叙述的情况下则不存在这种意图。例如，为了帮助理解，所附权利要求可以含有介绍性短语“至少一个”和“一个或更多个”的使用以引入权利要求的叙述。然而，使用这样的短语不应被解释为暗示由不定冠词“一”或“一个”所引入的权利要求叙述将含有这种所引入的权利要求叙述的任何特定权利要求限制为仅含有一个这样的叙述的实施例，即使是在同一权利要求包括介绍性短语“一个或更多个”或“至少一个”以及不定冠词(诸如“一”或“一个”(例如，“一”和/或“一个”应解释为是指“至少一个”或“一个或更多个”))时；对于用于引入权利要求叙述的定冠词的使用而言也是如此。另外，即使明确叙述了具体数量的所引入的权利要求叙述，本领域技术人员也将认识到，这样的叙述应当解释为意味着至少所叙述的数量(例如，没有其他修饰语的“两个叙述”的无修饰叙述，是指至少两个叙述，或者指两个或更多个叙述)。此外，在使用类似于“A、B和C等中的至少一个”的约定的情况下，这样的构造通常旨在于本领域技术人员会理解该约定的意义上(例如，“具有A、B和C中至少一个的系统”将包括但不限于单独具有A、单独具有B、单独具有C、具有A和B、具有A和C、具有B和C和/或具有A、B和C等的系统)。在使用类似于“A、B或C等中的至少一个”的约定的情况下，这样的构造通常旨在于本领域技术人员会理解该约定的意义上(例如，“具有A、B或C中至少一个的系统”将包括但不限于单独具有A、单独具有B、单独具有C、具有A和B、具有A和C、具有B和C和/或具有A、B和C等的系统)。本领域技术人员还将理解，实际上，无论是在说明书、权利要求书还是附图中，呈现两个或更多个替代性术语的任何析取词和/或短语都应理解为考虑了包括术语之一、术语中的任一个或这两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。

另外，在根据马库什组来描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，由此也根据马库什组的任何单个组分或组分的子组来描述本公开。

如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，诸如就提供书面说明而言，本文所公开的所有范围也涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都能够容易地识别为充分描述，并且能够将相同范围分解为至少等于一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性示例，本文所讨论的每个范围都能够容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，所有语言(诸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等等)包括所叙述的数字，并且是指能够随后分解为上述子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的组分。因此，例如，具有1-3个物品的组是指具有1、2或3个物品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1、2、3、4或5个物品的组，并且依此类推。

本文所公开的方法包括用于实现所描述的方法的一个或更多个步骤或动作。在不脱离权利要求的范围的情况下，方法步骤和/或动作可以彼此互换。换句话说，除非指示了步骤或动作的特定顺序，否则可以在不脱离权利要求的范围的情况下修改特定步骤和/或动作的顺序和/或使用。

尽管本文已经公开了各个方面和实施例，但是其他方面和实施例对于本领域技术人员将是显而易见的。本文所公开的各个方面和实施例是出于说明的目的，并且不旨在进行限制，其真实的范围和精神由所附权利要求书来指示。