生物结合分子
阅读说明：本技术 生物结合分子 (Biological binding molecules ) 是由 H·克洛夫特 M·A·凯瑟梅尔 U·比尔斯纳 于 2019-05-02 设计创作，主要内容包括：本发明涉及诸如抗体或其片段之类的生物结合分子的制备、鉴定和选择领域,以及涉及所述生物结合分子在例如特别是B细胞恶性肿瘤之类的癌症的诊断和治疗中的用途。所述结合分子能够选择性地与具有根据SEQ ID NO.18的轻链的B细胞受体结合。(The present invention relates to the field of the preparation, identification and selection of biological binding molecules, such as antibodies or fragments thereof, and to the use of said biological binding molecules in the diagnosis and treatment of cancer, for example, in particular, B-cell malignancies. The binding molecule is capable of selectively binding to a B cell receptor having a light chain according to SEQ ID No. 18.)
技术领域
本发明涉及抗体或其片段的制备、鉴定和选择的领域，以及所述抗体或其片段在例如特别是B细胞恶性肿瘤之类的癌症的预防和治疗及伴随诊断中的用途。
背景技术
B细胞恶性肿瘤通常指的是造血系统或淋巴系统的恶性疾病。其包括例如白血病之类的临床表现，在更广泛的意义上，包括癌症。白血病的特征在于白细胞的无功能的前体细胞(也称为白血病细胞)的增殖。这些细胞在骨髓中扩散，在该处抑制常规的造血并且通常在外周血中大量增殖积聚。这些细胞可能会浸润肝、脾、淋巴结和其他器官，进而损害其功能。对造血的干扰会导致正常血液成分的减少，从而会因缺少输送氧气的红细胞、缺少止血的血小板以及缺少成熟的、有功能的白细胞而引起贫血。
根据疾病病程，区分急性和慢性白血病。急性白血病是危及生命的疾病，如果不及时治疗，可能会在几周到几个月内致人死亡。而慢性白血病通常会持续数年并且在早期阶段通常是无症状的。
白血病的主要形式有：
急性髓细胞白血病(AML)；
慢性髓细胞白血病(CML)；
急性淋巴细胞白血病(ALL)；
慢性淋巴细胞白血病(CLL)。
通常以化疗的形式对白血病进行治疗。较新的治疗形式更多地集中于例如GA101(obinutuzumab阿托珠单抗)之类的单克隆抗体的使用，其以与Rituximab(利妥昔单抗)和Ofatumumab(奥法木单抗)类似的方式用作CD20抗体，用于治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL)。通过使用这些抗体可以将完全缓解时间延长约10个月。
造血或淋巴系统的其他恶性疾病(B细胞恶性肿瘤)涉及淋巴瘤，例如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤的B细胞变异体。
如果生成针对受体的抗体，则通常借助受体(以纯化、克隆的方式或作为肽片段)使动物免疫并产生杂交瘤细胞。这些杂交瘤细胞产生抗体，然后借助ELISA或细胞系统中表达的受体对这些抗体进行测试。为此要使用常规建立的细胞系，因为只有这些细胞系才易于进行培养。在此情况下，可以产生与特定类型受体(例如抗IgG1、抗IgE)相对特异性结合的抗体。然而，在此情况下通常会引起与其他受体或其他表位的交叉反应。
就BCR抗体的诊断或治疗用途而言，仅使用一种针对BCR的抗体通常是不够的，因为这种广谱使用可能会导致假阳性结果或引起相当大的副作用。确切地说，需要提供与受体选择性结合的抗体，该受体具有包括根据SEQ ID NO.18的表位VL3-21的轻链。此轻链的表位在肿瘤性B细胞中表达过度。现有技术中未揭露过这种抗体，并且未揭露过通过选择制备或获得这种抗体的方法。
用于治疗白血病的现有技术疗法对患者造成了很大的负担。一般而言，可以总结得出，治疗的非期望的副作用以及药物的效果不足致使这种疾病的死亡率较高，因为肿瘤细胞以及免疫系统的健康细胞都会受到损害。此外，通常无法完全治愈，而只是实现疾病得到有效缓解的一定时间段。因此，对于待治疗的患者的确定和选择以及个体治疗计划的制定而言，重要的是具有可用的诊断手段和诊断方法，用于有所区别地检测出B细胞恶性肿瘤的某些形式。
发明内容
因此，本发明的目的是提供用于诊断、预防和/或治疗用途的替代性的理念和有效成分，例如特别是替代性的抗体，用以克服现有技术现存的问题。本发明优选还应适用于检测存在适用于抗体的治疗用途(“伴随诊断”)的表面结构。
在详细探讨本发明的各个方面之前，先对本说明书中所使用的相关术语进行阐释。
在此所使用的术语“瘤形成”通常表示身体组织的新生。如果这是一种病理或恶性表现形式，则称为恶性肿瘤。因此，B细胞恶性肿瘤指的是B细胞的恶性且不受控制地形成新组织，其中这个术语同样涉及到所有B细胞相关癌症，例如白血病和B细胞淋巴瘤。
“用于杀死肿瘤的区域”可以通过直接或间接作用杀死肿瘤。就特定抗体的治疗用途而言，将分子与抗体、这个抗体的功能片段或者另一包含这个抗体或其片段的生物结合分子结合，以便产生超越结合抗体或其片段的效果的效果。这种分子例如可以选自由免疫毒素、细胞因子、螯合剂、放射性同位素及其组合构成的组。
在本案中，“生物结合分子”例如但不完全是指包括融合蛋白的抗体。有利地并且因此优选地，这种抗体选自由IgG抗体、IgM抗体、人源化IgG抗体和嵌入了表位的识别序列的人抗体构成的组。这种结合分子也可以以整个抗体的功能片段的形式提供，例如Fab片段。结合分子还可以包括其他区域，这些区域例如用于杀死/消灭肿瘤，因此具有免疫毒素和/或免疫细胞因子的功能。这种结合分子特别是也可以是膜结合型或细胞介导的。结合分子的这种膜结合形式例如是CAR-T细胞上的嵌合抗原受体(“Chimeric-AntigenReceptor”)。
此外，结合分子还可以包含其他区域或附加的实体，其有利地用于诊断用途。在使用流式细胞术的情况下，这些区域或实体可以是荧光染料(例如：FITC、R-藻红蛋白(R-PE)、别藻蓝蛋白(APC))或生物素以及本领域技术人员已知的其他物质。此外，在使用免疫组化法的情况下，结合分子也可以与底物转化酶(例如HRP)一同使用。此外，针对诊断目的还可以提供融合蛋白，其中荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白(GFP))与抗体的FC部分偶联以进行检测。
B细胞表面上的B细胞受体复合物(BCR)的任务是识别和结合病原体。这种结合会导致BCR的构象发生变化，从而触发信号级联放大，这最终导致B细胞的活化。在成熟的B细胞中以多种方式形成BCR。
B细胞在人类以及其他一些哺乳动物的骨髓或胎肝中发育。发育中的淋巴细胞从所谓的基质细胞接收发育程序所需的信号。在B细胞发育的过程中，功能性B细胞受体(“抗体”的膜结合形式)的形成至关重要。成熟的B细胞只有借助这个抗原受体才能识别外来抗原，并通过形成相应的抗体而与敌对结构结合。通过关联特定基因片段来确定受体的抗原特异性。这些片段称为V、D和J片段，因此，这个过程被称为V(D)J重组。在此情况下，对这些形成B细胞受体的抗原结合部分的片段进行重新排列。整个受体由两条相同的蛋白轻链和两条相同的蛋白重链组成，其中这些重链和这些轻链通过二硫键相互联接。
每条轻链由一个可变区和一个恒定区构成，其中可变区决定抗原识别，而恒定区则确定了五种免疫球蛋白类别或者在T细胞受体中负责膜锚定。轻链是通过体细胞重组由V和J基因库以及恒定链Lambda或Kappa构造而成。重链指的是三个组分，这些组分构成可变部分(V、D、J)。虽然迄今为止的研究主要集中在重链上并且已进行了很好的研究，但迄今对轻链的关注却很少。由轻链已知两个基因座，即一个针对具有40个V基因片段的Kappa的座和一个针对具有30个V基因片段的Lambda的座。就CLL而言，某些组合在相应的B细胞上占主导地位(Stamatopoulus等人于2005年所著，BLOOD Vol 106(《血液学》第106卷)，第10期)。对CLL患者的B细胞的分析特别是表明，大量患者的细胞具有自主活性BCR，其具有V链VL3-21。已知V链VL3-21存在于三个变体中，其中这些变体彼此之间最多有两个氨基酸有所不同，并且可以相对于本发明等效地进行使用。
此外，在针对每个分子存在一个固有的基因的情况下，通过以下方式实现免疫球蛋白和T细胞受体特异性的超过基因组的大小的较大谱系：在进行重新排列之前，各个基因片段(V、D、J)存在于多个副本中，这些副本可以在淋巴细胞成熟期间以密码锁的方式任意相互组合。
在VDJ重组过程中，首先对B细胞受体的重链的V、D和J片段进行联接，然后对受体轻链的V和J片段进行联接。只有在基因被成功重新排列(这被称为生产性基因重排)时，细胞才能过渡至下一发育步骤中。
在大多数情况下，在其成熟期间在骨髓中对自体抗原作出反应的B细胞会因细胞凋亡而死亡。可以在健康人的血液中检测到少量自体反应性细胞，其中包括针对甲状腺球蛋白或胶原蛋白的细胞(Abul K.Abbas:Diseases of Immunity in Vinay Kumar、AbulK.Abbas,Nelson Fausto:Robbins and Cotran-Pathologie Basis of Disease，第7版，费城2005年，第224页)。
因为生成这种BCR的过程基于基因片段的随机聚合，所以新产生的BCR可能会非期望地识别自体结构并借此“永久活化”。为了防止产生这种“永久激活或活化”的BCR，存在不同的自体保护机制。然而，如果因发育中的B细胞发生病理变化而战胜这些保护机制，则可能会由此发展为恶性或自身免疫性疾病。
与此相对，“自主激活”或“自主活化”的BCR指的是一种特殊类型的永久激活的BCR。虽然传统的活化来自外部抗原(见上文)，但自主激活的BCR是由其与同一细胞的表面上的膜结构的相互作用而产生的。就CCL的临床表现而言，可示出BCR之间的触发自主活化的相互作用，这些BCR彼此相邻地处于同一细胞表面上(M.Dühren-von Minden等人；Nature2012)。自主激活BCR的另一示例是pre-BCR(前B细胞受体)，其在B细胞发育过程中表示为发育检查。但是，除了相邻受体(BCR：BCR)之间的相互作用之外，受体与膜蛋白(BCR：膜蛋白)之间的相互作用也可以产生自主激活或活化的BCR。
根据本发明这些问题的解决方案基于令人惊讶的发现：即，在CLL患者的肿瘤细胞上存在自主激活或自主活化的B细胞受体，并且这些自主激活或活化的受体的特征是存在共同表位，这些共同表位在同一患者的健康细胞的相应受体中无法被检测到。因此，由于存在自主激活的B细胞受体，这些受体的特征在于存在上述表位，这些细胞可以被抗体特异性识别和治疗，以便借此不会影响到没有这个特征的健康B细胞，从而可以更特定地进行治疗并减少非期望的副作用。
然而，在针对本发明而进行的大量实验中，令人惊讶的是，无法借助常规标准方法来制备和选择对这些经修饰的受体区域(表位)具有特殊特异性的抗体。只有在以某种方式调整实验条件以便在结合研究的情况下使用基因工程改造的细胞之后，才能获得具有期望的所需特异性的合适抗体，这些基因工程改造的细胞的经修饰的B细胞受体处于天然的活化状态。换句话说，对于根据本发明所提出的解决方案而言至关重要的是，在结合研究中用于选择合适的诊断、预防或治疗抗体的细胞以尽可能天然且活化的形式呈现其经修饰的区域(表位)。在此，事实表明，所谓的pro-/pre-B细胞(祖B细胞/前B细胞)基于其生理构造而特别合适。因此，提供这类同样具有这个特异性结合行为的特异性抗体及其功能片段能够实现肿瘤的特异性诊断和治疗，其特征在于显著改善治疗效果率，并且由于非期望的全身效应的减少，大幅提高了治疗成功率。
如已述及的那样，提供了形式为抗体或其功能片段的生物结合分子以及一种制备(鉴定和选择)这类结合分子的方法，这些结合分子选择性地与具有包括表位VL3-21的B细胞受体的B细胞结合并且大多还与B细胞肿瘤的自主激活的膜结合型免疫球蛋白的经修饰的表位结合。此外，还提出了使用这类结合分子的诊断、预防和治疗方法，其中治疗应用与抑制表达这类膜结合型免疫球蛋白的细胞的生长或杀死这些细胞有关。诊断方法主要涉及这个受体亚型特别是在使用所提出抗体的治疗决策(“伴随诊断”)下的体外检测，这个受体亚型的特征在于在B细胞上的BCR轻链上存在VL3-21。
一般而言，白血病和淋巴瘤是借助免疫毒素和/或免疫细胞因子进行治疗的有吸引力的靶标。B细胞恶性肿瘤患者的反应在免疫毒素活性的I/II期临床研究中得到了广泛研究(Amlot等人，(1993)，Blood 82，第82卷,2624-2633页；Sausville等人，(1995)，Blood85，第85卷,3457-3465页；Grossbard等人，(1993)，Blood 81，第81卷,2263-2271页；Grossbard等人，(1993)Clin.Oncol.11，第11期,726-737页)。迄今为止已确定了一些抗肿瘤反应，但对正常组织的免疫毒素介导的毒性通常会阻止剂量增加到治疗水平。多个B细胞特异性抗原，例如CD19、CD22和CD40，被选为免疫毒素的靶标，其由诸如蓖麻毒素A链之类的植物毒素和诸如假单胞菌外毒素A(PE)之类的细菌毒素而产生(Uckun等人，(1992)，Blood79，第79卷,2201-2214页；Ghetie等人，(1991)，Cancer Res.51，第51期,5876-5880页；Francisco等人，(1995)，Cancer Res.55，第55期,3099-3104页)。
膜结合型免疫球蛋白非常适合靶向、即特异性免疫治疗。在骨髓中的B细胞的发育过程中，每个单独的B细胞前体通过各个基因的重排产生自身的几乎独特的B细胞受体(BCR)段。
已知自主激活的BCR的两个变体(亚群2；亚群4)，这两个变体在其表征的分子基序(表位)方面彼此有所不同(Minici,C.等人，Distinct homotypic B-cell receptorinteractions shape the outcome of chronic lymphocytic leukaemia，Nature Comm.，2017)。两种变体都具有不同的短氨基酸序列，其对于这些变体而言是特异的。本领域技术人员已知的是，除了所列出的亚群之外，其他CLL B细胞受体也具有自主活性。在此情况下，亚群2的对受体的自主激活功能起决定性作用的区域的特征在于轻链的氨基酸序列KLTVLRQPKA(SEQ ID NO.1)和VAPGKTAR(SEQ ID NO.2)，而亚群4的对受体的自主激活功能起决定性作用的区域的特征则由重链的可变部分的氨基酸序列PTIRRYYYYG(SEQ ID NO.3)和NHKPSNTKV(SEQ ID NO.4)定义。用于在免疫的框架下产生鼠源性单株抗体的亚群2和4的序列在SEQ ID NO.5和6(vHC；LC)或7和8(vHC；LC)中给出。为完整起见，SEQ ID NO.17(VSSASTKG)中给出了对亚群4的BCR重链的可变部分具有特异性的另一目标序列或另一表位。因此，除了负责形成BCR(亚群4)的自主激活状态的根据SEQ ID NO.3和4的目标序列(表位)之外，根据SEQ ID NO.17的序列表示这个亚群的另一表征的特性。
要指出的是，亚群2和4作为B细胞受体的两个变体在具有严重疾病病程的患者中的发现和表征是基于对大量的个别情况研究的检查，因此并不意味着在BCR的可能的其他多个亚型中不存在表征这两个已知亚型的目标序列(表位)的同一亚型，并且这些亚型与严重的疾病病程相关。
要指出的是，与发现对亚型2和4的BCR具有特异性的结合分子有关的本实施方案应理解为前期工作，其有助于发现根据本发明的对表位VL3-21具有特异性的其他结合分子并且又是平行专利申请的主题。
尽管原则上应能够借助标准方法例如在小鼠中产生针对这两个亚群的抗体，但令人惊讶地观察到的是，使用肽进行免疫不会形成期望的特异性抗体。使用受体的单个链进行免疫，例如使用包括经修饰的序列区域的BCR轻链，也不会带来期望的成功，因此，最终借助BCR的重组产生的可溶性形式(参见SEQ ID NO.5和6)使小鼠免疫。然后可以从这些小鼠中获得具有期望的特异性的免疫细胞，并通过细胞融合将其转化为杂交瘤细胞。在此令人惊讶的是，无法通过ELISA测试或其他标准方法对这些活性抗体进行鉴定。然而，在第一步骤中通过ELISA被鉴定为潜在结合配偶体的克隆在进行选择之后被证实是非特异性结合或未与自主活性受体(包括SEQ ID NO.1和2)结合，因此必须被丢弃。
至上述识别为止，所使用的方法不仅包括标准方法，例如ELISA和SPR，还包括以细胞内FACS染色作为结合对照的成纤维细胞中的细胞内表达。
在进行较为复杂的其他系列试验之后，可以示出，根据本发明适用的结合分子的成功选择既不能借助于游离受体或其片段来实施，也不能借助于膜结合型或细胞内受体片段来实施。相反，观察到只有使用细胞系统的情况下才能成功进行选择，在这个细胞系统中，完整的功能性B细胞受体呈膜结合型。具有其经修饰的区域(表位)的BCR自主激活地存在或呈现在这些细胞中或这些细胞上是非常重要的。只有借助这种处理方式才能鉴定出仅与肿瘤细胞高度特异性且选择性结合的抗体(即与在其细胞膜上表达具有表征这个细胞类型的亚群2或亚群4的表位的BCR的B细胞结合，而不是与根据定义不属于亚群2或4的B细胞的其他B细胞或其受体(BCR)结合)，这个处理方式的条件反映了很大程度上生理天然的原位场景。换句话说，这些结合分子选择性地与自主激活或自主活化的B细胞受体结合，这些结合分子的特征在于存在结构域或表位(目标序列)，并且这些结合分子与B细胞受体的自主激活或活化状态存在因果关系。
还可以示出，尽管操作困难且获取方式较为复杂，使用从“三重敲除”小鼠(TKO)中获得的被阻滞的pro-/pre-B细胞特别适合表达这些受体以及用于识别这些受体的测试系统中。pro-/pre-B细胞的阶段当时是用于实现BCR的成熟和选择，这个阶段的细胞由于其酶谱(分子伴侣等)也特别适合正确折叠“较难的”BCR组分并以足够生理天然的形式在其表面上表示这些组分。通过下面所列出的删除(敲除)避免通过重组或使用“替代轻链”(“Surrogate light chain”)来改变期望的BCR。通过在选择对自主激活或活化的B细胞受体具有选择性的特异性结合行为的抗体的过程中使用这些细胞或阻滞的pro-/pre-B细胞的这种细胞类型来表达和呈现BCR而提供一个选择平台，与现有技术中用于进行选择的常规系统相比，这个选择平台的特征在于显著提高的质量，这表明使用原代TKO细胞或培养数代原代TKO细胞的高成本是合理的。
在以上述方式选择合适的杂交瘤细胞之后，可以获得大量形式为单克隆抗体的适用于诊断、预防和/或治疗目的的抗体。可以通过对这些细胞的DNA进行测序来确定抗体的结合位点(参见SEQ ID NO.9和10)。相应的方法是本领域技术人员已知的并且也是市售的。在此情况下有利的是，获得更多数量的杂交瘤细胞并选择具有最佳结合活性(特异性和结合强度/亲和性)的杂交瘤细胞。
通过由此获得的关于结合位点的遗传信息将为此编码的序列嵌入具有人抗体序列的DNA的表达质粒中，以便以常规的重组方式产生具有期望的特异性的人源化单克隆抗体。与常规的诊断试剂和有效成分相比，这些人源化抗体基于其独特的特异性在副作用相对较少的情况下具有更好的诊断特异性或预防和治疗效果。本领域技术人员知悉，这些人源化抗体可以通过生物技术手段大量制备。可以使用标准化方法(例如由沉淀、过滤和层析构成的组合)来纯化合成的抗体，这是已为本领域技术人员所知的，其中应注意不使抗体发生变性并且定量地去除可能的异物，例如蛋白质、热原和毒素。
优选在系统中对期望的抗体进行表达，在这些系统中，抗体经历糖基化，例如特别是人糖基化。这类系统是本领域技术人员众所周知的并且包括使用昆虫细胞(S2细胞)、哺乳动物细胞(CHO细胞)以及特别优选使用人类细胞，例如HEK293T类型的细胞。
充分纯化的抗体本身在治疗上是有效的，只要这个抗体具有引发特定免疫应答的同种型，例如IgG亚型，其通过Fc受体引起针对肿瘤的免疫应答。
但是，这个抗体也可以作为片段存在。在此情况下重要的是，抗原结合位点存在于这个片段中，也就是说，这个片段是功能性片段。此类片段例如可以通过蛋白酶处理被制备为F(ab)片段。因为这些片段在抗体的恒定部分被截断，所以在此有利且优选的是，插入用于杀死肿瘤的效应分子。
根据一种替代性的优选实施方式，所述抗体配备有偶联物，以便提升所述抗体的效果。这个偶联物是用于杀死肿瘤的区域并且可以以直接或间接作用杀死这类肿瘤。这种偶联物的一个示例是蓖麻毒素与抗体的键合，其中通过使用化学交联剂实现蓖麻毒素与抗体的优选共价的键合。这类分子和方法在Greg T.Hermanson所著的BioconjugateTechniques一书中的第11章Immunotoxin Conjugation Techniques中进行了详细的描述。
根据另一优选的实施方式，所述抗体也可以以修饰形式存在，例如作为形式为具有T细胞特异性活化域的融合蛋白的生物结合分子。为了产生这种所谓的嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor；CAR)，首先从患者的外周血中获取T细胞并在体外对其进行基因工程改造，使得这些T细胞在其细胞表面表达CAR。然后将这些经修饰的T细胞重新引入患者体内，从而可以借此进行CAR-T细胞免疫治疗(参见例如N Engi J Med.2014Oct 16；371(16):1507-17.doi:10.1056/NEJMoal407222)。
就治疗用途而言，优选将抗体用于具有药学上可接受的载体的组合物中。
药学上可接受的载体是被治疗的患者在生理上可接受的且保留与其一起给药的化合物的治疗特性的载体。示例性的药学上可接受的载体是生理盐溶液。其他适用的生理学上可接受的载体及其配方已为本领域技术人员所知并且例如在Remington'sPharmaceutical Sciences，第18版，Hrsg.A.Gennaro,1990,Mack Publishing Company,Easton,PA中进行了描述。
根据本发明的结合分子的另一治疗应用方案是本身已知的单采术(Apharese)，其中在“血液透析”的意义上在患者体外对患者的血液或血液样本进行处理。
例如可以将根据本发明的抗体用于单采系统，这个单采系统用于从患者的血液样本中分离白血病细胞。对此原则上适用本领域技术人员已知的各种方法。
根据第一个示例性实施方式，所述抗体可以与可磁化颗粒(珠)(例如免疫磁珠)结合。给血液配备抗凝剂并使其在患者体外与颗粒进行接触。理想地，为此针对每个肿瘤细胞使用至少一个颗粒，优选10至100个颗粒。尺寸例如小于20μm的颗粒通常包含多个具有相同特异性的抗体(颗粒数大于5000/μl血液)。可以在将经清洁的剩余血液返回给患者之前，借助磁体对这些颗粒进行结合。通过这个治疗措施显著减少了患者血液中肿瘤细胞的数量。根据另一个实施方式，所述颗粒的尺寸大于20μm并且同样针对每个颗粒具有多个抗体(>100、>1000)。这样就能借助一个粒子结合和去除多个淋巴细胞(肿瘤细胞)。通过单采术通常所使用的常规离心分离来去除这些颗粒/细胞偶联物。为此所需的时间与颗粒的类型以及仪器相关并且必须以实验的方式进行测定。
在另一实施方式中，可以借助精细网络将这些颗粒/细胞偶联物(特别是在使用直径超过20μm的较大颗粒时)以及不发生细胞结合的游离颗粒与血液分离。这类网络例如可以作为所谓的“细胞训练器”在市场上购得。将抗体与颗粒偶联的方法是本领域技术人员总所周知的。例如由Dynal公司向其客户提供工艺说明。
就诊断用途而言，优选将抗体用于标准化方法中，例如用于流式细胞术或免疫组化中。针对诊断目的而提出的抗体、生物结合分子或其功能片段优选具有小鼠的骨架。优选通过第二抗体实现流式细胞仪中的检测，或者作为替代方案，优选通过与抗体、生物结合分子或其功能片段直接结合的荧光染料实现流式细胞仪中的检测。
为了稳定地进行储存，有利的是，以稳定形式提供抗体或其片段，因此这也是优选的。为此，例如可以借助稳定盐缓冲液进行干燥。这种缓冲液例如可以是本领域技术人员已知的磷酸缓冲液(PBS)。适用的干燥形式例如是冷冻干燥或冻干。
下面结合示例对本发明的各个方面进行详细说明。
在对实验程序进行详细说明之前，参见以下实施方案。
与经修饰的B细胞受体选择性结合的抗体的制备和鉴定存在较大且不可预见的问题。借助标准方法产生杂交瘤。混合杂交瘤组的上清液并通过ELISA(ELISA板上的可溶性B细胞受体)检查阳性结合事件。分离阳性池并测试单个克隆。在此情况下令人惊讶的是，在ELISA中不再鉴定到阳性克隆。此后，这些池的阳性ELISA信号经证实是非特异性结合。
为了实现更好的表位来识别抗体，在成纤维细胞中表达BCR的轻链。这应该确保携带负责自主信号的基序(表位)的蛋白质正确折叠。借助这些细胞进行细胞内FACS分析。无法鉴定出阳性克隆(抗体)。
出于这个原因，在进一步的实验中对RAMOS细胞(humane Burkitt LymphomZellline(人伯基特淋巴瘤细胞系))进行修饰，使得这些细胞具有功能上经修饰的BCR。借此应确保BCR的完全正确的生物合成、折叠和修饰。为此，借助CRISPR删除细胞自身的BCR，然后以分子生物学的方式重建“CLL受体”(CMV载体的电穿孔)。将这些细胞用于测试阳性结合事件。在此，也无法借助FACS检测出阳性克隆。
而令人惊讶的是，使用通过基因穿梭将CCL受体引入其中的小鼠TKO(三重敲除)细胞(阻滞的pro-/pre-B细胞)会产生阳性克隆。尽管如此，但人类细胞系统还是无法确保这一点。这些细胞在其基因组中具有以下三个基因敲除作为特性：
-RAG2基因的敲除防止其自身免疫球蛋白重链和轻链发生体细胞重组，因此，排除了BCR的内源性形成。从而在这个发育阶段中阻滞、阻断或“冻结”相应处理的B细胞。已知RAG1和RAG2形成仅能够进行通常的VDJ重排的复合物，因此，RAG1基因的敲除是同样有效的手段，因而是RAG2基因敲除的替代方案并且被根据本发明的规则所涵盖。
-替代轻链的一部分Lambda5的删除防止了pre-BCR的形成。因为pre-BCR是自主激活的，所以这将干扰到自主激活受体的检测。在此，将新的BCR克隆到细胞中，因此，pre-BCR是非期望的，因为其会以期望的重链(HC)连同非期望的替代轻链出现在表面上并且会干扰到选择。
-SLP65(BCR信号通路中至关重要的衔接蛋白)基因的敲除防止TKO细胞被可能重建的BCR激活。
RAG2或RAG1和Lambda5基因敲除的组合致使从pro-B细胞阶段到pre-B细胞阶段的过渡被阻断，这个pre-B细胞阶段的典型特征是重链(HC)的VDJ片段的开始重排。因此，这涉及的是pro-/pre-B细胞。
对于BCR的表达和适用抗体的选择而言，RAG2或RAG1和Lambda5基因的敲除就足够了。通过借助诱导型SLP65进行重构可以测量BCR的活性。
在此选择的方法是借助FACS分析以及Ca2+依赖性染料(如Indo-1)的使用来测量SLP65诱导后的Ca通量。这些方法是本领域技术人员已知的(参见M.Dühren-von Minden等人，Nature 2012)。
通过前两次基因敲除确保只有“相关的BCR”在表面上被表达。此外，通过使用用于重建细胞的诱导型SLP65可以表征被表达的BCR的功能，进而在选择之前对BCR在表面上的自主激活状态进行验证。
通过FACS上的抗IgM和抗LC抗体来确定BCR的表达。为此，提取一些细胞并借助PBS中的每100μl的总体积中的5μl的抗体对这些细胞进行染色。
以这些细胞为“靶标”，借助FACS成功鉴定出一种抗体，这个抗体与用于实现和表征BCR的自主活化的经修饰的区域特异性结合。尽管如此，但与RAMOS细胞中的相同受体类型的结合仍未成功。
为此，首先将表面带有“相关BCR”的细胞与混合的上清液一起孵育，在经过若干清洗步骤之后，借助第二抗体检测结合的抗体。将TKO细胞(TKO)用于进行特异性选择，这些细胞表达了“相关BCR”的不同版本。图1所示的选择矩阵是CLL亚群2BCR的选择示例，用于鉴定和选择阳性克隆。为了便于鉴定，对杂交瘤的上清液进行混合和测量。对显示出结合的群组进行分离并测试各个杂交瘤的上清液的结合。
通过两个空白样本，即借助无BCR的细胞(见图1A)和具有非CLL-BCR的细胞(见图1E)确认所选择的抗体与经修饰的BCR特异性结合而不与其他BCR变体结合。通过FACS检查白血病患者血液中的原代B细胞的结合。所选择的抗体能够特异性鉴定具有目标结构的BCR。这一点已在基因组的基础上得到了证实。无这个目标结构的样本不具有结合。
在研究过程中，事实表明，所有所使用的CCL亚群2型的自主活性细胞除了具有特殊突变(R110G)外，还具有BCR轻链的V区域的特殊变体。这个表位变体被鉴定为VL3-21(SEQID NO 18)并且是本发明的主题。可以证实，在所有CCL病例的约30％中，这个表位存在于肿瘤细胞BCR上。然而，这个表位也可能出现在健康细胞上。因此，这个表位是肿瘤相关的表位，可将其用于肿瘤的诊断和治疗。特别是适用上述情形，因为存在这个V区域的多个变体，因此，在这些细胞中不到5％的“健康”细胞(即非肿瘤样B细胞)中，在此所描述的变体VL3-21被表达。借此在与针对BCR的非特异性抗体的常规使用相比对健康的非肿瘤样B细胞的损害要低得多的情况下，实现优先抑制肿瘤性B细胞(肿瘤细胞)的方案。有鉴于此，可以借助根据本发明提出的抗体或其具有针对VL3-21的特异性的功能性片段，进行更具特异性且对于患者来说负担更小的治疗。此外，就例如CCL患者而言，可以将针对VL3-21的抗体用于所谓的伴随诊断。在这个诊断中，已证实治疗性抗体的目标结构VL3-21存在于肿瘤细胞上并且表明在这个方面进行治疗的成功机率很大。
附图说明
下面结合示例并参照附图对本发明进行详细说明。
具体实施方式
示例1
制备三重敲除细胞(TKO)的起点是形成转基因小鼠，其具有Lambda5、RAG2和SLP65基因的相应敲除(Dühren von Minden等人，2012年，Nature，第489期，第309-313页)。产生这类小鼠是本领域技术人员已知的并且属于现有技术。为了获得这些细胞，在这些小鼠死后，从这些小鼠身上提取大腿骨的骨髓。然后在有利于pro-/pre-B细胞存活的条件(37℃、7.5％CO2、Iscove的培养基、10％FCS、P/S、小鼠的IL7)下对以此方式获得的细胞进行培养。多次传代之后，实施FACS分选以进行对照，其对pro-/pre-B细胞进行分选，然后重新进行培养。为此所使用的标记已为本领域技术人员所知。
为了借助“相关BCR”进行重建，合成对重链(HC)和轻链(LC)的进行编码的相应序列，然后将其分别克隆到具有CMV启动子的表达载体中。借助脂质体转染将这些表达载体引入包装细胞系(Phoenix细胞系)中。在持续孵育36小时后，去除病毒上清液并将其用于TKO细胞的旋转感染。获得上清液的工作和TKO的旋转感染都是广为人知的方法并且是本领域技术人员已知的。
亚群2的B细胞受体的结构特性摘自相关文献(见上文)。示例性CCL亚群2VH和完整的LC DNA片段由委托制造商以标准方法合成。然后通过PCR将其与小鼠的IgG1恒定片段融合并克隆到CMV载体中。通过Sanger测序来确认最终载体的序列。
CLL亚群2VH(SEQ ID NO.5)：
CLL亚群2LC(SEQ ID NO.6)：
将基于HEK293T细胞的人类细胞表达系统用于表达CCL亚群2IgG1。使用基于聚乙烯亚胺(PEI)的方案进行转染。在多次传代之后，混合上清液，并借助蛋白G柱纯化混合的细胞上清液中所包含的培养基。借助免疫印迹测定可溶性亚群2IgG1的纯度和质量。
根据标准程序在小鼠中以及在随后的杂交瘤细胞的产生过程中进行单克隆抗体的制备。没有如同常规那样借助ELISA进行阳性克隆的筛查。因为目标结构是膜结合型受体，所以尤为重要的是验证潜在抗体在细胞系统中的结合，即在很大程度上保留这种细胞类型固有的细胞生理状态。首先，借助FACS分析检查混合的上清液组的结合事件。为此，在自身无法进行表达的细胞系(TKO)的表面上表达不同的CCL亚群2的BCR变体。借此首先可以鉴定这些上清液，其抗体显示出结合。然后在其结合方面对各个杂交瘤克隆的上清液进行深入研究，以便以这种方式鉴定具有较高亲和力的高度特异性克隆。
就筛查过程而言，在先前的转化过程中使用相应的CLL-BCR的重链(HC)和轻链(LC)的以下组合的不同载体，其中这些组合用于BCR重建系统的表面上：
·对照物(无BCR的转化载体)(见图1A)；
·具有CCL亚群2的典型HC/LC的载体(VL3-21)(见图1B)；
·具有非CCL亚群2HC/CCL亚群2的典型LC的载体(VL3-21；无目标基序R110G)(见图1C)；
·具有CCL亚群2的典型HC/非CCL亚群2LC的载体(见图1D)；
·具有非CCL亚群2HC/非CCL亚群2LC的载体(见图1E)；
·具有CCL亚群2的典型HC/LC的载体(VL3-21；包括突变R110G(目标基序))(见图1F)。
这个选择的过程在图1中以CLL亚群2BCR为例示意性地示出，其中符号“TKO”指的是TKO细胞(见上文)。
在第1选择回合中，合并多个克隆的上清液并检查其与选择矩阵的结合特性。在示出与“相关BCR”特异性结合的情况下，给出阳性结合特性。对显示出这种特性的群组进行分离，并且在第二选择回合中在选择矩阵上再次对单个克隆的结合特性进行表征。在使用荧光标记的抗小鼠IgG抗体的情况下，使用FACS结合分析来验证单克隆抗体的结合。其表明：A)无BCR(对照)；B)典型BCR的CCL亚群2；C)具有任意重链和CLL亚群2典型轻链的BCR；D)具有CLL亚群2典型重链和任意轻链的BCR；E)具有任意重链和轻链的BCR(对照；非CLL亚群2典型BCR)；F)典型BCR的CLL亚群2，其在目标基序(R110G)中具有突变(对照)。要指出的是，在图1B、C和F所示情形下，将变体VL3-21用作轻链。
基于抗体仅与具有目标结构的细胞结合的发现(CLL亚群2BCR；图1B)，可以推断出，在此存在与具有自主活性受体的细胞特异性结合的抗体。
在此情况下，事实表明，使用处于pro-/pre-B细胞发育阶段的细胞对于检测BCR的所需的精确表达来说是必不可少的。这些细胞在基因发育上适于通过精确的折叠以及在其表面上的表达来表示新的BCR。RAG2和Lambda5的失活(敲除)防止了内源性BCR或pre-BCR的表达。SLP65的删除以及随后的诱导型SLP65的重建能够对“相关BCR”的活性水平进行表征。
为了测定借助选择而选定的单克隆抗体的氨基酸序列，从各个杂交瘤克隆中分离出mRNA，由此产生cDNA，然后借助锚定PCR对其进行扩增(Rapid expression cloning ofhuman Immunoglobulin Fab fragments for the analysis of antigen specificity ofB cell lymphomas and anti-idiotype lymphoma vaccination；Osterroth F,Alkan O,Mackensen A,Lindemann A,Fisch P,Skerra A,Veelken H.,J Immunol Methods，1999年10月29日；229(1-2):1 41-53)。
在对结合而言较为重要的区域(CDR)进行鉴定和序列测定之后，通过PCR将这些区域转移到人抗体框架中。为此，由人的FR区和小鼠的CDR区在计算机中生成VH序列，然后将其合成为DNA片段。然后通过PCR将这些片段与人的IgG1融合并将其克隆到适于进行表达的载体中。
就单克隆抗体的产生而言，除了完整的免疫球蛋白外，还使用了合成肽，其代表自主信号能力的区域。
针对亚群2的特异性单克隆抗体已被测序并且是独立专利申请的主题。
在测序过程中测定以下氨基酸序列，其中SEQ ID NO.9涉及重链(HC)的可变部分，SEQ ID NO.10涉及轻链(LC)的可变部分，且其中标记区域——以给定的顺序——表示CDR1、2和3。
SEQ ID NO.9(AVA-mAb0l HC)
SEQ ID NO.10(AVA-mAb01 LC)
根据SEQ ID NO.9的重链的与CDR1、CDR2和CDR3对应的部分序列在SEQ ID NO.11至13中给出，而根据SEQ ID NO.11轻链的与CDR1、CDR2和CDR3对应的部分序列在SEQ IDNO.14至16中示出。
SEQ ID NO.11(AVA-mAB01 CDRI HC)
GFSLTSYG
SEQ ID NO.12(AVA mAB01 CDR2 HC)
IWRGGGT
SEQ ID NO.13(AVA mAB01 CDR3 HC)
ARSRYDEEESMNY
SEQ ID NO.14(AVA mAB01 CDR1 LC)
GNIHSY
SEQ ID NO.15(AVA mAB01 CDR2 LC)
NAKT
SEQ ID NO.16(AVA mAB01 CDR3 LC)
QHFWNTPPT
上述过程是生成对CCL亚群2具有特异性的抗体的示例。还在使用亚群4的特定序列和同种型的情况下实施了相同的过程。
示例性CCL亚群4VH和完整的LC DNA片段由委托制造商以标准方法合成。然后通过PCR将其与小鼠的IgG1恒定片段融合并将其克隆到CMV载体中。通过Sanger测序确认最终载体的序列。
CLL亚群4HC(SEQ ID NO.7)：
以粗体标记的区域表示亚群4的BCR重链的可变部分的目标序列(表位)，这些目标序列负责亚群4的自主激活状态(参见SEQ ID NO.3和4)。
CLL亚群4LC(SEQ ID NO.8)：
对最初丢弃的杂交瘤细胞系的后续研究引发了对B细胞受体的轻链VL3-21具有特异性的根据本发明的结合分子的惊人发现。根据图1B、IC和1F，这些杂交瘤细胞系的相应上清液示出与TKO细胞系的结合。
对针对具有表位VL3-21的B细胞受体的在此所鉴定的特异性单克隆抗体进行测序。在此情况下，测定了以下氨基酸序列，其中SEQ ID NO.25涉及重链(HC)的可变部分，SEQID NO.26涉及轻链(LC)的可变部分，且其中标记区域——以给定的顺序——表示CDR1、2和3。
SEQ ID NO.25(AVA-mAb02 HC)
SEQ ID NO.26(AVA-mAb02 LC)
根据SEQ ID NO.25的重链的与CDR1、CDR2和CDR3对应的部分序列在SEQ ID NO.19至21中给出，而根据SEQ ID NO.26轻链的与CDR1、CDR2和CDR3对应的部分序列在SEQ IDNO.22至24中示出。
SEQ ID NO.19(AVA-mAB02 CDR1 HC)
GYTFTDYA
SEQ ID NO.20(AVA-mAB02 CDR2 HC)
ISTYYGDS
SEQ ID NO.21(AVA-mAB02 CDR3 HC)
SRDTSNFDY
SEQ ID NO.22(AVA-mAB02 CDR1 LC)
QDINSH
SEQ ID NO.23(AVA-mAB02 CDR2 LC)
RANR
SEQ ID NO.24(AVA-mAB02 CDR3 LC)
LQYDEFPRT
示例2
使用本发明的规则，从患者体内抽取少量外周血。为了进行分析，将100μl的血液转移到反应容器中并加入2ml的PBS-BSA缓冲溶液。然后在Eppendorf离心机5804中以1500转/分钟的速度对这个样本离心5分钟。丢弃上清液并对沉淀物进行充分混合。然后加入抗体。在将这些产物在室温下在黑暗中孵育15分钟之前，针对以下表面参数进行染色：1)CD19-FITC、2)CD5-PE以及3)VL3-21特异性抗体(APC)。然后开始进行裂解并且对红细胞进行裂解。如上所述，用PBS-BSA缓冲液清洗两次，将这些细胞容置并重悬在500μl的0.1％PBS-BSA缓冲液中。在2-8℃下对这些细胞进行避光保存，直至在流式细胞仪上进行测量。
在BDCalibur上进行FACS分析。各个激光和检测参数的设定根据设备制造商的说明进行并且是本领域技术人员总所周知的。然后，借助FlowJo分析软件对这个分析的原始数据进行评估。首先，选择并标记FSC/SSC印迹中的淋巴细胞群。在此情况下，对于这个选择而言，重点在于CD19阳性B细胞，并且对VL3-21特异性抗体的结合进行分析。图2示例性地示出以VL3-21特异性抗体的使用为例进行这种分析。在第一步骤中，选择用于进行进一步分析的CD19阳性B细胞(左侧面板)。然后检查这些特异性抗体的结合(右侧面板)。
示例3
将对具有VL3-21的BCR具有特异性的根据本发明的抗体用于单采系统中以从患者的血液样本中分离白血病细胞。
从患者身上抽取外周血(采血管中的EDTA血)。借助细胞计数器测定淋巴细胞数，结果为80,000个淋巴细胞/μl。为了测定“肿瘤负荷”，即样本负荷的肿瘤细胞材料，通过FACS(借助CCL标准面板WHO肿瘤负荷)进行免疫表型分析。其次，借助根据本发明的抗体对携带CCL表位的细胞进行染色，以便检测出这些细胞对这个表位呈阳性。然后将500μl的这种血液与5x 108的MACS微珠(Miltenyi Biotech)混合，这些微珠与特异性抗体偶联。在通过Miltenyi LS柱处理血液之前，在室温下对这个混合物进行长达5分钟的晃动。在此情况下，与这些颗粒(珠)偶联的淋巴细胞留在柱子上，从而从柱子中获得作为通流尽可能去除淋巴细胞的血液。在两次进行纯化之后，通过这些柱子(根据制造商的规定)在FACS测量中测定淋巴细胞数低于5000个淋巴细胞/μl。在使用在白血病细胞上不存在具有VL3-21的BCR的CCL患者的血液进行的对照实验中，这个纯化并不会如预期的那样导致血液中的B细胞的显著减少。
序列表
<110> H·克洛夫特
U·比尔斯纳
M·A·凯瑟梅尔
<120> 对VL3-21的抗体
<130> AVA-mAB02
<160> 26
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 自主激活区域亚群2/1
<400> 1
Lys Leu Thr Val Leu Arg Gln Pro Lys Ala
1 5 10
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 自主激活区域亚群2/2
<400> 2
Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Arg
1 5
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 自主激活区域亚群4/1
<400> 3
Pro Thr Ile Arg Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly
1 5 10
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 自主激活区域亚群4/2
<400> 4
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
1 5
<210> 5
<211> 116
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 自主激活区域亚群2 VH
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gln Asn Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 215
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 自主激活区域亚群2 LC
<400> 6
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ala Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Gly Ser Asp His
85 90 95
Pro Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 7
<211> 224
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 自主激活区域亚群4 HC
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Tyr Gly Asp Thr Pro Thr Ile Arg Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130 135 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Cys Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
195 200 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Cys
210 215 220
<210> 8
<211> 220
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 自主激活区域亚群4 LC
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asp Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr His Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 9
<211> 119
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<220>
<223> AVA mAb01 HC
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Arg Gly Gly Gly Thr Asp Ser Asn Ala Ala Phe Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ser Arg Tyr Asp Glu Glu Glu Ser Met Asn Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<220>
<223> AVA mAb01 LC
<400> 10
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Asn Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<220>
<223> AVA mAb01 CDR1 HC
<400> 11
Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly
1 5
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<220>
<223> AVA mAb01 CDR2 HC
<400> 12
Ile Trp Arg Gly Gly Gly Thr
1 5
<210> 13
<211> 13
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<220>
<223> AVA mAb01 CDR3 HC
<400> 13
Ala Arg Ser Arg Tyr Asp Glu Glu Glu Ser Met Asn Tyr
1 5 10
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<220>
<223> AVA mAb01 CDR1 LC
<400> 14
Gly Asn Ile His Ser Tyr
1 5
<210> 15
<211> 4
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<220>
<223> AVA mAb01 CDR2 LC
<400> 15
Asn Ala Lys Thr
1
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<220>
<223> AVA mAb01 CDR3 LC
<400> 16
Gln His Phe Trp Asn Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<220>
<223> 自主激活区域亚群 4/2
<400> 17
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
1 5
<210> 18
<211> 96
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 18
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85 90 95
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 19
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ala
1 5
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 20
Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 21
Ser Arg Asp Thr Ser Asn Phe Asp Tyr
1 5
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 22
Gln Asp Ile Asn Ser His
1 5
<210> 23
<211> 4
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 23
Arg Ala Asn Arg
1
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 24
Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Arg Thr
1 5
<210> 25
<211> 116
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 25
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Val
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asn Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Asp Thr Ser Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser His
20 25 30
Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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