一种基于上转换纳米材料的硫酸软骨素多糖探针及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种基于上转换纳米材料的硫酸软骨素多糖探针及其制备方法与应用 (Chondroitin sulfate polysaccharide probe based on up-conversion nano material and preparation method and application thereof ) 是由 刘秀美 巩洁 于 2021-08-24 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种基于上转换纳米材料的硫酸软骨素多糖探针及其制备方法与应用。本发明以己二酸二酰肼(adipate dihydrazide,ADH)为桥梁,通过羧基氨基的偶联,将上转换纳米材料接枝于硫酸软骨素的分子链上,通过硫酸软骨素的肿瘤靶向作用以及基于稀土上转换材料的发光特性,构建得到硫酸软骨素探针。相比已有的肿瘤成像探针,由于上转换纳米材料的反斯托克斯发光特点,可以实现免疫正常小鼠在980nm激发下的活体肿瘤成像,生物相容性更好,背景荧光干扰更小,可用于肿瘤的体内体外成像。(The invention provides a chondroitin sulfate polysaccharide probe based on an up-conversion nano material, and a preparation method and application thereof. According to the invention, Adipic Dihydrazide (ADH) is used as a bridge, an up-conversion nano material is grafted on a molecular chain of chondroitin sulfate through coupling of carboxyl and amino, and a chondroitin sulfate probe is constructed and obtained through the tumor targeting effect of the chondroitin sulfate and the luminescence property based on a rare earth up-conversion material. Compared with the existing tumor imaging probe, due to the anti-Stokes luminescence characteristic of the up-conversion nano material, the in-vivo tumor imaging of the immune normal mouse under the excitation of 980nm can be realized, the biocompatibility is better, the background fluorescence interference is smaller, and the in-vivo and in-vitro imaging of the tumor can be realized.)
技术领域
本发明涉及一种基于上转换纳米材料的硫酸软骨素多糖探针及其制备方法与应用，属于探针合成技术领域。
背景技术
肝癌是世界上常见的癌症死亡原因，肝细胞肝癌是最常见的肝癌类型，死亡率高，具有较高的远端转移发生率。肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)发生发展是一个多步骤、多阶段的病理学过程，其发病的分子机制是非常复杂的，早期症状不明显，所以发展肝细胞肝癌早期诊断的方法，提高肝细胞肝癌的早期诊断率、提升临床疗效和肝细胞肝癌防治具有重要意义。目前临床上常用的癌症诊断方法包括X光诊断、正电子发射计算机断层显像(positron emission tomography-computed tomography,PET-CT)、磁共振、病理组织切片等。X光和磁共振技术对人体有辐射伤害，且准确率不高。病理组织切片准确率高，但操作复杂、耗时长。PET-CT技术虽影像清晰度高，检测结果准确，但检测费用昂贵，对人体也有一定的辐射。最近有研究者将肿瘤细胞从正常细胞中分离出来进行计数，以期能够对癌症早筛和判断癌症的发展情况，但操作方法复杂，误差大。
肿瘤可视化分析属于国际前沿研究领域。基于生物成像技术对活体状态下的体内生物过程进行细胞和分子水平的定性和定量研究，利用特异性分子探针追踪靶目标并成像，能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为，不仅具有较高的灵敏度，还可以直观的观察到肿瘤在体内的生长及转移、分布情况和特定基因的表达等生物学过程，操作简单，在肿瘤诊断、追踪肿瘤的发展过程以及治疗中具有远大前景。目前发展的依赖于靶向造影剂的分子超声显像技术已成功应用于恶性肿瘤等疾病的早期诊断及病程监测研究，大大提高了疾病的诊出与恶性肿瘤等疾病的早期诊断及病程监测研究，大大提高了疾病的诊出率、诊断率和诊断准确性。但该技术往往受限于所依赖的造影剂的工作时长。所以发展基于肿瘤标志物的肿瘤可视化方法有助于形成对恶性肿瘤本质的新认识，为阐述肿瘤发生的分子基础，明确肿瘤各演进阶段的生物学表征提供科学依据。
目前用于生物活体成像的分子探针常采用有机荧光染料和无机纳米材料。荧光染料光漂白速率较快，容易发生猝灭，进而限制了其进一步的发展和应用。量子点作为无机纳米材料的一种，其光化学稳定性高，生物相容性好，但由于机体的表皮和血液自发光较强，会干扰量子点的发光强度，限制了其在活体成像中的应用。上转换纳米材料(upconversionnanoparticles,UCNPs)是一种具有优良光学性质的纳米复合材料，由于其尺寸小，生物相容性好，可以很容易的与蛋白质或其它的生物分子结合，且对生物组织的损伤小，组织穿透能力强，没有背景荧光噪声干扰，使其在荧光探针靶向标记、生物学检测、生物活体成像和肿瘤光热治疗等方面得到巨大的发展和应用。由于UCNPs本身无靶向性，如何将UCNPs与肿瘤靶向物质相连或者对UCNPs表面进行活性基团修饰，从而实现探针的靶向性设计并用于活体成像等，值得进一步研究。
硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)是一种糖胺聚糖，广泛存在于除植物以外的所有生物中，它由葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺的重复二糖单元组成；研究表明，CS具有多种生物学活性和药理作用。肿瘤组织中存在的肿瘤干细胞是影响肿瘤形成及侵袭转移的重要原因。肝癌干细胞与肝细胞肝癌的形成、进展及复发相关。CD44分子作为肝癌干细胞的生物标志物，在肝癌细胞中的表达高于癌旁组织和正常肝组织，且其表达上调与肝细胞肝癌的分化程度、癌症进展和预后密切相关。CS是CD44的特异性配体，可通过软骨素链与CD44发生相互作用从而可定向靶向CD44，因此具有肿瘤靶向性，常作为抗肿瘤药物载体实现肿瘤靶向给药来提高药效，降低副作用。
如何将CS的肿瘤靶向作用和UCNPs在生物成像方面的优势结合起来，实现HCC的体内体外成像，将为HCC的临床早期诊断提供新的思路。中国专利文献CN103112882A公开了一种具有靶向性近红外NaYF4上转换纳米晶的制备，采用一锅法制备，首先制备硬脂酸盐前驱体，然后通过水热法160℃下处理18小时制备NaYF4上转换纳米晶。该发明将生物靶向分子引入到上转换纳米晶的合成过程中，提供了一种合成亲水性靶向性上转换纳米晶的新方法；所合成出的NaYF4上转换纳米晶具有形貌规则、尺寸均一、生物相容性好、荧光光谱在近红外光区窗口、靶向性高等优良的性质。但该发明的制备需高压高温在反应釜中进行，且反应时间较长，上转换发光较弱。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种基于上转换纳米材料的硫酸软骨素多糖探针及其制备方法与应用。本发明基于CD44分子对HCC演进和诊疗的关键调控作用和在HCC细胞中表达上调，通过对CD44分子功能可视化拟发展HCC肿瘤成像方法；本发明以己二酸二酰肼(adipate dihydrazide，ADH)为桥梁，通过羧基氨基的偶联，将上转换纳米材料接枝于硫酸软骨素的分子链上，通过硫酸软骨素的肿瘤靶向作用以及基于稀土上转换材料的发光特性，构建得到硫酸软骨素探针，用于肿瘤的体内体外成像。
本发明的技术方案如下：
一种基于上转换纳米材料的硫酸软骨素多糖探针，所述探针为硫酸软骨素分子链上通过共价键接枝聚丙烯酸修饰的上转换纳米材料；所述上转换纳米材料为NaYF4:Yb,Tm为核、NaYF4为壳的、粒径为38-40nm的球形核壳结构纳米粒子。
根据本发明优选的，硫酸软骨素(CS)分子链通过羧基与己二酸二酰肼(ADH)中的酰肼基上的氨基反应引入己二酸二酰肼桥梁结构，桥梁结构中的酰肼基通过与聚丙烯酸修饰的上转换纳米材料表面的羧基反应，从而将聚丙烯酸修饰的上转换纳米材料通过共价键接枝于硫酸软骨素分子链上。
上述基于上转换纳米材料的硫酸软骨素多糖探针的制备方法，包括步骤：
(1)硫酸软骨素接枝己二酸二酰肼化合物(CS-ADH)的制备：将硫酸软骨素(CS)溶于水中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作为催化剂，溶解后，调节体系pH为6～7，30-45℃下活化羧基10-20min；然后加入己二酸二酰肼(ADH)，调节体系pH为6～7，30-45℃下反应20-30h，经透析、冻干得CS-ADH；
(2)上转换纳米材料的制备：
i、将醋酸钇、醋酸镱、醋酸铥、油酸、1-十八烯混合，在惰性气体保护下、150-170℃下搅拌20-40min直至固体完全溶解并混合均匀，冷却至室温；加入含有NaOH和NH4F的甲醇溶液，在惰性气体保护下升温至45-55℃反应30-50min，继续升温至100-120℃反应60-90min以除去体系中的甲醇，然后继续升温至295-300℃反应80-100min，经冷却、洗涤、挥干溶剂得到纳米材料(NaYF4:Yb,Tm)；
ii、将醋酸钇、油酸、1-十八烯混合，在惰性气体保护下加热至150-170℃搅拌20-40min使固体完全溶解并混合均匀，自然冷却至70-90℃；加入纳米材料(NaYF4:Yb,Tm)的环己烷分散液，70-90℃反应20-40min以除去体系中的环己烷，自然降温至45-55℃；加入含有NaOH和NH4F的甲醇溶液，在惰性气体保护下升温至45-55℃反应30-50min，继续升温至100-120℃反应60-90min以除去体系中的甲醇，然后继续升温至295-300℃反应80-100min，经冷却、洗涤、挥干溶剂得到上转换纳米材料(NaYF4:Yb,[email protected]4UCNPs)；
(3)聚丙烯酸修饰的上转换纳米材料的制备：将上转换纳米材料分散于环己烷中，加入十六烷基三甲基溴化铵的水溶液，室温剧烈搅拌至环己烷完全挥发，得到十六烷基三甲基溴化铵封端的上转换纳米材料；加入NH3·H2O、聚丙烯酸水溶液，超声分散后，搅拌条件下逐滴加入异丙醇，滴加完毕后，室温搅拌10-20min使溶液混合均匀，经洗涤、冻干得聚丙烯酸修饰的上转换纳米材料(NaYF4:Yb,[email protected]4@PAA)；
(4)探针的制备：将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入至聚丙烯酸修饰的上转换纳米材料的水分散液中，充分混合分散均匀后，加入硫酸软骨素接枝己二酸二酰肼化合物(CS-ADH)，35-40℃搅拌反应20-30h；离心除去未反应完全的聚丙烯酸修饰的上转换纳米材料、取上清液透析、冻干即得基于上转换纳米材料的硫酸软骨素多糖探针(CS-UCNPs-Tm)。
根据本发明优选的，步骤(1)中，硫酸软骨素(CS)的质量和水的体积比为0.002-0.3g/mL；硫酸软骨素(CS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的质量比为1:3-5:0.2-1。
根据本发明优选的，步骤(1)中，己二酸二酰肼(ADH)和硫酸软骨素(CS)的质量比为7-10：1。
根据本发明优选的，步骤(1)中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解后，使用浓度为0.05-0.2mol/L的盐酸调节体系pH；加入己二酸二酰肼(ADH)后，使用0.05-0.2mol/L的NaOH水溶液调节体系pH。
根据本发明优选的，步骤(1)中，透析的截留分子量＝4000Da，将体系中未反应完全的小分子化合物除去。
根据本发明优选的，步骤(2)i中，醋酸钇、醋酸镱、醋酸铥的摩尔比为3.95:1:0.05。
根据本发明优选的，步骤(2)i中，油酸和1-十八烯的体积比为1:1.2-1.8；醋酸钇的物质的量和油酸的体积比为0.05-0.1mol/L。
根据本发明优选的，步骤(2)i中，含有NaOH和NH4F的甲醇溶液中，NaOH的浓度为0.1-0.4mol/L，NH4F的的浓度为0.2-0.6mol/L。
根据本发明优选的，步骤(2)i中，NaOH、NH4F和醋酸钇的摩尔比为1:1.6:0.316。
根据本发明优选的，步骤(2)ii中，油酸和1-十八烯的体积比为0.2-0.6:1；醋酸钇的物质的量和油酸的体积比为0.1-0.2mol/L。
根据本发明优选的，步骤(2)ii中，纳米材料(NaYF4:Yb,Tm)的环己烷分散液中，纳米材料(NaYF4:Yb,Tm)的浓度为0.2-0.3mol/L；纳米材料(NaYF4:Yb,Tm)和醋酸钇的摩尔比为1.5:1。
根据本发明优选的，步骤(2)ii中，含有NaOH和NH4F的甲醇溶液中，NaOH的浓度为0.4-0.6mol/L，NH4F的的浓度为0.6-1mol/L。
根据本发明优选的，步骤(2)ii中，NaOH、NH4F和醋酸钇的摩尔比为2.5:4:1。
根据本发明优选的，步骤(3)中，上转换纳米材料的质量和环己烷的体积比为0.02-0.06g/mL。
根据本发明优选的，步骤(3)中，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的水溶液浓度为4-6mg/mL；十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和上转换纳米材料的质量比为1-1.5:1。
根据本发明优选的，步骤(3)中，NH3·H2O的浓度为1-3mol/L，聚丙烯酸水溶液的浓度为0.1-0.3g/mL；NH3·H2O和聚丙烯酸水溶液的体积比为1-2:1。
根据本发明优选的，步骤(3)中，上转换纳米材料和聚丙烯酸的质量比为10-15:1。
根据本发明优选的，步骤(3)中，异丙醇与环己烷的体积比为15-25:1。
根据本发明优选的，步骤(4)中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的物质的量比为2-5:1。
根据本发明优选的，步骤(4)中，聚丙烯酸修饰的上转换纳米材料的水分散液中，聚丙烯酸修饰的上转换纳米材料的质量浓度为8-10mg/mL；聚丙烯酸修饰的上转换纳米材料和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的质量比为1-1.5:1。
根据本发明优选的，步骤(4)中，硫酸软骨素接枝己二酸二酰肼化合物(CS-ADH)和聚丙烯酸修饰的上转换纳米材料的质量比为1:0.5-1.5。
根据本发明优选的，步骤(4)中，透析的截留分子量＝4000Da，除去产物中未反应完全的小分子化合物。
上述基于上转换纳米材料的硫酸软骨素多糖探针的应用，应用于肿瘤细胞的体外、体内成像。
本发明反应原理示意如下：
本发明的技术特点及有益效果如下：
(1)以己二酸二酰肼(adipate dihydrazide,ADH)为桥梁，构建基于NaYF4:Yb,Tm上转换纳米材料的硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)探针。合成具有核壳结构的NaYF4:Yb,[email protected]4上转换纳米材料，然后进行PAA衍生得到NaYF4:Yb,[email protected]4@PAA材料，通过羧基氨基共价偶联将CS-ADH与NaYF4:Yb,[email protected]4@PAA相连。
(2)与现有上转换合成材料相比，本发明方法制备NaYF4:Yb,Tm的反应时间更短，无需在反应釜中进行，用普通装置即可实现。相比NaYF4:Yb,Tm，出乎预料的发现核壳结构的NaYF4:Yb,[email protected]4材料的上转换发光强度显著性增强，约为单独核材料的17倍，且使发射带红移至适于小动物活体成像的波长。通过PAA衍生后，发射带位置没有明显变化，虽然与核壳结构相比，材料上转换强度减弱，但仍远强于NaYF4:Yb,Tm材料的上转换发光强度。本发明制备的上转换纳米材料(NaYF4:Yb,[email protected]4 UCNPs)与CS-ADH偶联后，虽然发光强度有减弱，但是相比NaYF4:Yb,[email protected]4 UCNPs与CS-ADH偶联所得材料而言，发光强度明显增强，其峰值比约为35:1，且最强峰波长由545nm左右红移到800nm左右，更适合小动物活体成像。
(3)通过ADH将具有肿瘤靶向作用的CS和上转换发光纳米材料相连，设计合成了具有肿瘤靶向作用的上转换多糖探针CS-UCNPs-Tm；相比已有的肿瘤成像探针，由于上转换纳米材料的反斯托克斯发光特点，可以实现免疫正常小鼠在980nm激发下的活体肿瘤成像，生物相容性更好，背景荧光干扰更小，可用于肿瘤的体外体内成像。
附图说明
图1是实施例1制备的(a)CS-ADH和(b)CS的红外光谱图。
图2是(a)CS与实施例1制备的(b)CS-ADH的1H NMR图谱。
图3是实施例1制备的(a)NaYF4:Yb,Tm、(b)NaYF4:Yb,[email protected]4、(c)NaYF4:Yb,[email protected]4@PAA材料的TEM图。
图4是实施例1制备的(a)NaYF4:Yb,[email protected]4@PAA、(b)NaYF4:Yb,[email protected]4、(c)NaYF4:Yb,Tm、(d)标准卡片JCPDS16-0334的XRD图。
图5是实施例1制备的(a)NaYF4:Yb,[email protected]4、(b)NaYF4:Yb,[email protected]4@PAA的红外光谱图。
图6是实施例1制备的(a)NaYF4:Yb,[email protected]4、(b)NaYF4:Yb,[email protected]4@PAA、(c)NaYF4:Yb,Tm和(d)CS-UCNPs-Tm的上转换发光图(激发：980nm)。
图7是实施例1制备的(a)CS-UCNPs-Tm与对比例制备的(b)CS-UCNPs的上转换发光强度的比较图(激发：980nm)。
图8是实施例1制备的CS-UCNPs-Tm的细胞毒性实验图。
图9是对比例1制备的纳米材料NaYF4:Yb,Tm的TEM图。
图10是对比例2制备的核壳结构的固体NaYF4:Yb,[email protected]4 UCNPs的TEM图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。
同时下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂、材料和设备，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
一种基于上转换纳米材料的硫酸软骨素多糖探针的制备方法，包括步骤：
(1)CS-ADH的合成
取1g CS精密称定，溶于50mL水中，加入4g EDC和0.585g NHS，用0.1mol/L HCl调节pH约为6～7后，37℃水浴活化羧基15min；加入8.8g ADH，用0.1mol/L NaOH水溶液调节pH为6～7，37℃水浴反应24h后，对水透析三天(截留分子量＝4000Da)，冻干得CS-ADH固体，通过FTIR和1H NMR确定CS与ADH的偶联情况。
图1中a、b分别是CS-ADH和CS的红外光谱图。在CS的红外谱图中，主要观察1603.19cm-1的C＝O特征伸缩振动峰；CS-ADH中的C＝O伸缩振动峰出现在了1649.71cm-1，并且在1551.85cm-1出现了新的吸收峰，为N-H弯曲振动峰，是ADH通过酰胺反应偶联到CS上形成酰胺，表明CS与ADH反应成功。
CS与CS-ADH的1H NMR图谱如图2所示。在CS的1H NMR中，a峰化学位移在1.94ppm，是CS中乙酰甲基中的H，化学位移在3.50-4.67ppm范围内的峰是CS糖环骨架的H；在CS-ADH的1H NMR中，b峰和c峰是ADH中两个亚甲基上的H，CS上的H的化学环境发生了变化导致化学位移也发生了变化，由此可以判断，CS与ADH反应成功。
CS-ADH中游离氨基的测定
OPA试剂的配制：取40mg邻苯二甲醛，精密称定，溶于1mL甲醇中，加入新鲜配制的20％SDS溶液2.5mL，0.1M硼砂缓冲液25mL，β-巯基乙醇100μL，加蒸馏水定容至50mL，得OPA试剂。
称取10mg CS溶于5mL蒸馏水中，搅拌使其充分溶解，得2mg/mL CS溶液，向其中依次加入40mg EDC和5.85mg NHS，用0.1mol/L盐酸调节pH至6～7，37℃搅拌15min以活化羧基，加入88mg ADH，用0.1mol/L NaOH水溶液调节溶液pH至6～7，37℃条件下搅拌24h，作为待测溶液A；称取40mg EDC和5.85mg NHS溶于5mL蒸馏水中，用0.1mol/L盐酸调节pH至6～7，37℃搅拌15min以活化羧基，加入88mg ADH，用0.1mol/L NaOH水溶液调节溶液pH至6～7，37℃条件下搅拌24h，作为对照溶液B；称取10mg CS溶于5mL蒸馏水中，搅拌使其充分溶解，得2mg/mL CS溶液，向其中依次加入40mg EDC和5.85mg NHS，用0.1mol/L盐酸调节pH至6～7，37℃水浴搅拌24h作为对照溶液C。
取4mL OPA试剂，加入200μL待测溶液A或200μL对照溶液B或200μL对照溶液C，37℃水浴2min后，在340nm测得其吸光度值。吸光度值如下表1所示。
表1游离氨基实验中溶液在340nm处的吸光度值
由表1可知，CS-ADH中存在游离氨基，理论上可以与制备的聚丙烯酸修饰的上转换纳米材料通过羧基氨基进行偶联。
(2)上转换纳米材料：NaYF4:20％Yb,1％[email protected]4 UCNPs的合成
合成NaYF4:20％Yb,1％Tm(以下简写为NaYF4:Yb,Tm)：分别取醋酸钇(3.16mmol)、醋酸镱(0.8mmol)、醋酸铥(0.04mmol)精密称定，置于500mL三口烧瓶中，加入40mL油酸和60mL 1-十八烯，通入N2 20min后，加热至160℃并不断搅拌，保持30min使固体完全溶解并混合均匀，自然冷却至室温；加入含有10mmol NaOH和16mmol NH4F的40mL甲醇溶液，在N2保护下(持续通入N2)，升温至50℃反应40min，然后继续升温至110℃反应80min以除去体系中所有的甲醇，将溶液升温至295℃反应90min，反应结束后，冷却至室温，加入无水乙醇离心沉淀数次后，挥干溶剂得到固体NaYF4:Yb,Tm。
合成上转换纳米材料NaYF4:Yb,[email protected]4 UCNPs：取2mmol醋酸钇精密称定，置250mL三口烧瓶中，加入12mL油酸、30mL 1-十八烯，通入N2 20min后，加热至160℃并不断搅拌，保持30min使固体完全溶解并混合均匀，自然冷却至80℃；向溶液中加入分散在12mL环己烷中的3mmol制备好的NaYF4:Yb,Tm，80℃反应30min以除去体系中的环己烷，自然降温至50℃；加入含有5mmol NaOH和8mmol NH4F的10mL甲醇溶液，在N2保护下(持续通入N2)，升温至50℃反应40min，然后继续升温至110℃反应80min以除去体系中所有的甲醇，将溶液升温至300℃反应90min，反应结束后，冷却至室温，加入无水乙醇离心沉淀数次后，挥干溶剂得到核壳结构的固体NaYF4:Yb,[email protected]4 UCNPs。
(3)NaYF4:Yb,[email protected]4@PAA的合成
PAA衍生制备[email protected]：取80mg UCNPs精密称定，分散于2mL环己烷中，加入含0.1g CTAB的20mL蒸馏水，室温剧烈搅拌挥发掉环己烷，形成CTAB封端的UCNPs；加入45μL2mol/L NH3·H2O、30μL 0.2g/mL PAA水溶液，超声分散30min后，不断搅拌的条件下逐滴加入40mL异丙醇，室温下搅拌10min使混合均匀后，用蒸馏水离心洗涤数次后冻干，得NaYF4:Yb,[email protected]4@PAA固体。
NaYF4:Yb,[email protected]4 UCNPs干燥后分散于环己烷中，超声30min使分散均匀，滴两滴于200目铜网上，待铜网上环己烷挥干后，于TEM下观察纳米粒子的形貌和尺寸大小；NaYF4:Yb,[email protected]4@PAA冻干后分散于蒸馏水中，超声45min使分散均匀，滴两滴于200目铜网上，待水挥干后将铜网置于TEM下观察纳米粒子的形貌和尺寸。
图3a是合成的NaYF4:Yb,Tm，从图中可以看出合成的NaYF4:Yb,Tm上转换材料形貌均匀，大小均一，尺寸约在35nm左右，分散良好；图中b是制备的NaYF4:Yb,[email protected]4核壳结构材料，壳层厚度约为3-4nm，核壳结构材料整体形貌均匀，尺寸均一，在环己烷中分散好；图中c是PAA衍生后的NaYF4:Yb,[email protected]4@PAA材料，从图中可以看出，材料表面均匀包覆了一层PAA，在水中的分散性好，衍生过程对形貌和尺寸基本没有影响。
图4是制备的NaYF4:Yb,Tm(c)、NaYF4:Yb,[email protected]4核壳材料(b)和NaYF4:Yb,[email protected]4@PAA(a)的XRD图，与标准卡片JCPDS16-0334(d)比较，说明制备的材料呈结晶性好的六方相，结合TEM图，材料形貌均匀、尺寸均一、结晶性好，可以用于进一步的合成。
PAA衍生前(NaYF4:Yb,[email protected]4核壳材料，图中a)后(NaYF4:Yb,[email protected]4@PAA，图中b)的红外光谱图如图5所示，与表面包覆油酸的NaYF4:Yb,[email protected]4核壳结构比较，PAA衍生后的NaYF4:Yb,[email protected]4@PAA材料在2925cm-1和2854cm-1附近的C-H键伸缩振动吸收峰降低，由于C＝O键的伸缩振动，在1720cm-1附近产生了新的吸收峰，表明PAA成功的包覆在了NaYF4:Yb,[email protected]4上。
(4)上转换纳米材料的硫酸软骨素多糖探针即CS-UCNPs-Tm的合成
称量100mg NaYF4:Yb,[email protected]4@PAA，加入10mL水超声分散45min；取80mg EDC、11.7mg NHS精密称定，37℃条件下边搅拌边加入至分散好的NaYF4:Yb,[email protected]4@PAA水溶液中，搅拌15min后，加入精密称定的100.0mg CS-ADH，37℃搅拌24h，反应结束后，5000rpm离心10min除去未反应完全的聚丙烯酸衍生的上转换纳米材料，取上清液对水透析三天(截留分子量＝4000Da)除去未反应完全的小分子化合物，冻干得CS-UCNPs-Tm固体。
图6是NaYF4:Yb,Tm(图中c曲线)、NaYF4:Yb,[email protected]4(图中a曲线)、NaYF4:Yb,[email protected]4@PAA(图中b曲线)和CS-UCNPs-Tm(图中d曲线)的上转换发光图(激发：980nm)。在980nm激发下，其发射带主要集中在800nm，并且与NaYF4:Yb,Tm相比，核壳结构NaYF4:Yb,[email protected]4材料的上转换发光强度显著性增强，约为单独核材料的17倍，通过PAA衍生转水后，发射带位置没有明显变化，虽然与核壳结构相比，材料上转换强度减弱，但仍远强于NaYF4:Yb,Tm材料的上转换发光强度。
图7是(a)实施例1制备的CS-UCNPs-Tm与(b)对比例3制备的CS-UCNPs上转换发光强度的比较(激发：980nm)。与CS-ADH偶联后，材料的上转换发光强度明显减弱，可能是由于CS分子量大，空间位阻大，二糖结构中的-COOH不能完全参与反应，导致发光强度大大减弱。但是相比对比例3中合成的CS-UCNPs材料而言，发光强度明显增强，其峰值比约为35:1，且最强峰波长由545nm左右红移到800nm左右，如图7所示，更适合小动物活体成像。
对比例1
纳米材料NaYF4:Yb,Tm的合成，包括步骤：
合成NaYF4:20％Yb,1％Tm(以下简写为NaYF4:Yb,Tm)：分别取醋酸钇(3.16mmol)、醋酸镱(0.8mmol)、醋酸铥(0.04mmol)精密称定，置于500mL三口烧瓶中，加入40mL油酸和60mL 1-十八烯，通入N2 20min后，加热至160℃并不断搅拌，保持30min使固体完全溶解并混合均匀，自然冷却至室温；加入含有10mmol NaOH和16mmol NH4F的40mL甲醇溶液，在N2保护下(持续通入N2)，升温至50℃反应40min，然后继续升温至110℃反应80min以除去体系中所有的甲醇，将溶液升温至290℃反应90min，反应结束后，冷却至室温，加入无水乙醇离心沉淀数次后，挥干溶剂得到固体NaYF4:Yb,Tm。所得NaYF4:Yb,Tm的电镜图如图9所示，从图中可以看出制备的纳米材料尺寸不均一，形貌不均匀，无法用于下一步实验。
对比例2
上转换纳米材料：NaYF4:Yb,[email protected]4 UCNPs的合成，包括步骤：
合成NaYF4:20％Yb,1％Tm(以下简写为NaYF4:Yb,Tm)：分别取醋酸钇(3.16mmol)、醋酸镱(0.8mmol)、醋酸铥(0.04mmol)精密称定，置于500mL三口烧瓶中，加入40mL油酸和60mL 1-十八烯，通入N2 20min后，加热至160℃并不断搅拌，保持30min使固体完全溶解并混合均匀，自然冷却至室温；加入含有10mmol NaOH和16mmol NH4F的40mL甲醇溶液，在N2保护下(持续通入N2)，升温至50℃反应40min，然后继续升温至110℃反应80min以除去体系中所有的甲醇，将溶液升温至295℃反应90min，反应结束后，冷却至室温，加入无水乙醇离心沉淀数次后，挥干溶剂得到固体NaYF4:Yb,Tm。
合成上转换纳米材料NaYF4:Yb,[email protected]4 UCNPs：取2mmol醋酸钇精密称定，置250mL三口烧瓶中，加入12mL油酸、30mL 1-十八烯，通入N2 20min后，加热至160℃并不断搅拌，保持30min使固体完全溶解并混合均匀，自然冷却至80℃；向溶液中加入分散在12mL环己烷中的2mmol制备好的NaYF4:Yb,Tm，80℃反应30min以除去体系中的环己烷，自然降温至50℃；加入含有5mmol NaOH和8mmol NH4F的10mL甲醇溶液，在N2保护下(持续通入N2)，升温至50℃反应40min，然后继续升温至110℃反应80min以除去体系中所有的甲醇，将溶液升温至300℃反应90min，反应结束后，冷却至室温，加入无水乙醇离心沉淀数次后，挥干溶剂得到核壳结构的固体NaYF4:Yb,[email protected]4 UCNPs。所得材料的电镜图如图10所示，从图中可以看出制备的UNCPs尺寸不均一，纳米粒子形貌相差较大，分散差。
对比例3
一种基于上转换纳米材料的硫酸软骨素多糖探针的制备方法，包括步骤：
(1)CS-ADH的合成，同实施例1；
(2)上转换纳米材料的合成如实施例1所述，所不同的是：上转换纳米材料的制备原料由醋酸钇(3.16mmol)、醋酸镱(0.8mmol)、醋酸铥(0.04mmol)替换为醋酸钇(3.12mmol)、醋酸镱(0.8mmol)、醋酸铒(0.08mmol)，且非核壳结构；具体步骤如下：
分别取醋酸钇(3.12mmol)、醋酸镱(0.8mmol)、醋酸铒(0.08mmol)精密称定，置于500mL三口烧瓶中，加入40mL油酸和60mL 1-十八烯，通入N2 20min后，加热至160℃并不断搅拌，保持30min使固体完全溶解并混合均匀，自然冷却至室温；加入含有10mmol NaOH和16mmol NH4F的40mL甲醇溶液，在N2保护下(持续通入N2)，升温至50℃反应40min，然后继续升温至110℃除去体系中所有的甲醇，将溶液升温至295℃反应90min，反应结束后，冷却至室温，加入无水乙醇离心沉淀数次后，挥干溶剂得到固体NaYF4:Yb,Er。
(3)NaYF4:Yb,[email protected]的合成，同实施例1；
(4)上转换纳米材料的硫酸软骨素多糖探针即CS-UCNPs的合成，同实施例1。
试验例：细胞培养及细胞毒性实验
Bel-7402细胞完全培养基的配制：gibco RPMI 1640培养基，含10wt％四季青胎牛血清，1wt％Solarbio青链霉素混合液100X，4℃保存待用。
MTT实验：通过MTT实验考察5μg/mL-500μg/mL浓度范围内实施例1制备的CS-UCNPs-Tm探针对Bel-7402细胞的毒性。96孔板设置调零孔、对照孔和5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL和500μg/mL CS-UCNPs-Tm样品孔。取对数期生长的Bel-7402细胞，用胰酶消化后，加入两倍体积的细胞完全培养基停止消化，800rpm离心5min，用细胞完全培养基重悬稀释后，除调零孔外以8000个/孔接种到96孔板里，接种好的96孔板置37℃，5％CO2恒温培养箱中培养至细胞贴壁后，调零孔和对照孔每孔加入100μL细胞完全培养基，样品孔加入完全培养基为溶剂配制的对应浓度的100μL CS-UCNPs-Tm，分别置恒温培养箱中孵育12h及24h后，取出弃掉每孔中溶液，用无菌PBS洗涤两次后，每孔加入90μL完全培养基和10μL MTT溶液，继续置恒温培养箱中培养4h，取出每孔加入110μL Formazan溶解液，在摇床上低速震荡10min后，用酶标仪检测490nm下的吸光度值。
通过MTT实验考察了合成的CS-UCNPs-Tm的细胞毒性(见图8)，从图中可以看出，在10μg/mL-500μg/mL范围内不同浓度的CS-UCNPs-Tm与Bel-7402共孵育12h及24h后的细胞存活率均在60％以上，且总体来看，12h组的细胞存活率高于24h。表明制备的CS-UCNPs-Tm探针具有良好的细胞相容性，可以用于体外及体内实验。