阅读说明：本技术 一种小滴玻璃化法草莓茎尖超低温脱毒的方法 (Method for ultra-low temperature detoxification of strawberry stem tips by droplet vitrification method ) 是由 赵磊 吴云锋 于 2020-06-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种小滴玻璃化法草莓茎尖超低温脱毒的方法,属于草莓脱毒技术领域。所述的小滴玻璃化法草莓茎尖超低温脱毒的方法,具体包括以下步骤：取感染病毒的草莓外植体、切取茎尖、预培养、小滴玻璃化处理并投入液氮、解冻、恢复培养、植株再生和继代培养。本发明小滴玻璃化法草莓茎尖超低温脱毒的方法具有操作简单、耗时短、脱毒率高、再生率高的优点,具有较好的技术效果和应用前景。(The invention discloses a method for ultra-low temperature detoxification of strawberry stem tips by a droplet vitrification method, belonging to the technical field of strawberry detoxification. The method for ultralow-temperature detoxification of strawberry stem tips by a droplet vitrification method specifically comprises the following steps: taking a strawberry explant infected with virus, cutting a stem tip, pre-culturing, performing small droplet vitrification treatment, putting into liquid nitrogen, unfreezing, recovering and culturing, regenerating a plant and performing subculture. The method for ultralow-temperature detoxification of the stem tips of the strawberries by the droplet vitrification method has the advantages of simplicity in operation, short consumed time, high detoxification rate and high regeneration rate, and has good technical effect and application prospect.)

一种小滴玻璃化法草莓茎尖超低温脱毒的方法

技术领域

本发明属于植物病毒学技术领域，特别是涉及草莓病毒的脱除方法。

背景技术

草莓(Fragaia ananassa)作为草本植物，其主要是通过母株形成的匍匐茎苗作为子苗的方式进行繁殖。草莓一旦感染病毒，则母株会100％直接传给后代，造成严重的品种退化现象，一般产量降低20％-80％，并造成显著的品质降低。草莓一旦感染病毒，无法通过必要的田间管理来解决。使用脱毒苗是防治草莓病毒病危害最经济有效的手段之一。然而，我国草莓脱毒快繁研究与生产严重脱节，常规脱毒技术脱毒效率低，且脱毒苗生产成本高。因此，提高草莓脱毒效率，规范高效、低成本脱毒苗快繁技术以降低脱毒苗的成本就显得非常必要。近年来本研究团队建立的草莓茎尖超低温疗法脱毒技术可有效解决上述问题。

发明内容

本研究针对我国草莓病毒病害危害严重，脱毒方法落后的现状，发明了一种小滴玻璃化法草莓茎尖超低温脱毒的方法。

本发明可通过如下技术方案实现：一种小滴玻璃化法草莓茎尖超低温脱毒的方法，具体包括以下步骤：

剥离2mm左右的草莓茎尖在继代培养基上培养1天后转入含有甘油和蔗糖的液体培养基上再培养1天，将茎尖转入PVS2中在冰上处理40分钟后转到灭菌铝箔条上的小滴中，然后浸入液氮中进行冷冻处理1h，再将铝箔条快速取出并浸入液体蔗糖培养基中进行解冻。解冻20min后取出茎尖，用滤纸吸干表面的水分，移入继代培养基中进行再生培养，前3天黑暗处理，第4天开始10μmol s^-1m^-2弱光培养，再生一周后茎尖转入新的继代培养基中在正常光照下进行再生。

所述的继代培养基成为：MS+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA，pH5.8。

所述的含有甘油和蔗糖的培养基配方为：MS+2.0M甘油+0.8M蔗糖。

所述的液体蔗糖培养基配方为：MS+1.2M蔗糖。

本发明小滴玻璃化法草莓茎尖超低温脱毒的方法具有操作简单、耗时短、脱毒率高、再生率高的优点，具有较好的技术效果和应用前景。

附图说明

图1是4种病毒的RT-PCR检测结果：A-D分别为草莓斑驳病毒(SMoV)、草莓镶脉病毒(SVBV)、草莓皱缩病毒(SCV)和草莓轻型黄边病毒(SMYEV)的检测结果；M：DNA分子量标准；1-10分别为10个茎尖超低温脱毒后再生的草莓苗；其中对于SMoV 10个样品均脱除了该病毒；对于SVBV，1-2和5-10号样品均脱除了该病毒。对于SCV和SMYEV 10个样品均脱除了该病毒。

图2是经过茎尖超低温脱毒后再生的红颜草莓组培苗。

具体实施方式

为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但下述实施例并不限制本发明。

本发明提供了一种小滴玻璃化法草莓茎尖超低温脱毒的方法，具体包括以下步骤：剥离2mm左右的草莓茎尖50个，在继代培养基(MS+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，pH5.8)上培养1天后转入MS+2.0M甘油+0.8M蔗糖培养基上再培养1天，将茎尖转入PVS2中在冰上处理40分钟后转到灭菌铝箔条上的小滴中，然后浸入液氮中进行冷冻处理1h，再将铝箔条快速取出并浸入液MS+1.2M蔗糖培养基中进行解冻。解冻20min后取出茎尖，用滤纸吸干表面的水分，移入继代培养基中进行再生培养，前3天黑暗处理，第4天开始10μmol s^-1m^-2弱光培养，再生一周后茎尖转入新的继代培养基中在正常光照下进行再生。再生一周后统计成活幼苗数，计算成活率。结果50个茎尖最终成活26个，成活率为52％。

对成活的幼苗继续进行光照培养，3周后需要继代培养一次，继代后再培养4周，进行SMoV、SVBV、SCV和SMYEV 4种草莓病毒的RT-PCR检测。检测引物由北京奥科生物科技有限公司合成，具体引物名称和序列见表1。

表1 4中草莓病毒的检测引物

具体检测步骤包括样品总RNA的提取，RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳检测。检测后统计以上4种病毒的脱毒率，结果SMoV、SCV和SMYEV脱毒率为100％，SVBV的脱毒率为80％。