具体实施方式

下列为各实施例中所用的实验方法：

(1)试剂

葡萄糖、琼脂(上海源叶生物科技有限公司)；乙腈、甲醇、乙酸铵(美国Merck公司)；精氨酸(上海国药集团化学试剂有限公司)；AOH标准品、AME标准品、TeA标准品、TEN标准品(纯度大于99％,美国Romer公司)

(2)仪器

超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；TRIPLE QUADTM 5500三重四级杆质谱仪(美国AB SCIEX公司)；HSC-24B氮吹仪(上海楚定分析仪器有限公司)；Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)；AL104分析天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；SK8210LHC超声波清洗机(上海科导超声仪器有限公司)；BJ-800A食品粉碎机(杭州德清拜杰电器有限公司)；SX-500高压灭菌锅(日本TOMY公司)；MGC-300H人工气候箱(上海一恒科学仪器有限公司)；GZX-CF101-2-BS电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司)；Heraeus MultifugeX3高速离心机(美国Thermo Fisher scientific 公司)

(3)菌株培养基

PDA培养基：去皮马铃薯200g煮沸30min后取滤液，加入葡萄糖20g、琼脂16g，用蒸馏水定容至1000mL，115℃高压灭菌30min，降温到55℃左右倒平板，每平板20mL。

PDB液体培养基：去皮马铃薯200g煮沸30min后取滤液，加入葡萄糖20g，用蒸馏水定容至1000mL，115℃高压灭菌30分钟。

黄桃培养基：称取50g优质黄桃至250mL三角瓶，加入10mL蒸馏水混匀，用透气封口膜密封瓶口，高压灭菌(121℃，30min)，冷却后将黄桃摇散待用。

(4)产毒菌株活化

将链格孢属(Alternaria ochroleuca)CBSX2菌株(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，互隔交链孢ATCC 66981(购自美国模式培养物集存库ATCC)接种于PDA培养基，28℃黑暗培养7天后，接种至PDB液体培养基中，25℃下150r/min震荡继续培养5天。取孢子液，显微镜观察孢子浓度，用无菌水调整至10⁵个/mL，用于后续接种。

(5)菌株接种

将100μL培养好的孢子液接种至PDA培养基，黑暗中培养9天后观察到培养基菌丝生已长满整个培养皿，链格孢属CBSX2和互隔交链孢ATCC 66981菌株整体呈现出黑色，外圈稍有些白色，中心处菌丝生长茂盛。

将100μL培养好的孢子液接种至50g灭菌黄桃的三角瓶中，接种第1周，每天振荡三角瓶1次，使孢子液与培养基充分接触。黑暗中培养28天后观察到三角瓶中长有黑色的菌丝。

(6)样品测定

AOH、AME、TeA、TEN提取方法：将PDA培养基和黄桃于50℃烘箱干燥，粉碎混匀后，准确称取2g粉碎样品于50mL离心管，加入10mL乙腈/水(84/16，v/v)，旋涡震荡1min，浸泡5min后，超声提取1小时。4000r/min离心10min后，取5mL上清液，在40℃下氮气吹干，1mL的5mmol/L乙酸铵水溶液/甲醇(80:20，v:v)溶解残渣，涡旋30s，超声1min，涡旋30s，充分溶解后，适量稀释，过0.22μm滤膜，UPLC-MS/MS测定。

超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)检测条件

AOH、AME、TeA、TEN色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C₁₈色谱柱(100mm×3.0mm，2.7mm)；流动相A为5mmol/L乙酸铵溶液，流动相B为甲醇；梯度洗脱程序：0～0.5mim，10％A；3min，70％A；5min，90％A；6min，90％；6.1min，10％A；8min，10％A；流速0.4mL/min；进样量3μL；柱温40℃。

AOH、AME、TeA、TEN的具体质谱参数如下标1所示：

表1AOH、AME、TeA、TEN的质谱参数

(7)方法学验证

通过考察线性、检出限(limit of detection，LOD)和定量限(limit ofquantitation，LOQ)、回收率和精密度来评价所建立PDA和黄桃培养基中AOH、AME、TeA、TEN分析方法的灵敏度、准确性和重复性。用空白基质溶液稀释标准工作液得到1、2、5、10、20、50、100和200μg/L浓度的基质标准溶液，以毒素浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，建立AOH、AME、TeA、TEN的基质标准曲线并用于样品浓度测定。以定性离子通道的3倍信噪比(signal-to-noise ratio，S/N)确定目标毒素的LOD、定量离子通道的10倍信噪比确定目标毒素的LOQ。采用加标回收试验法考察回收率和精密度，选取空白PDA和黄桃培养基样品分别按照添加浓度5、50和100μg/kg加入适量的标准工作液，每个浓度选取5个平行样。回收率为测定值和理论值的百分比，日内精密度和日间精密度分别为同一天和连续5天测定结果的相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)。

实验结果显示PDA和黄桃培养基中AOH、AME、TeA、TEN在各自范围内线性关系良好，相关系数(R²)均大于0.990。PDA中AOH的定量限为2μg/kg，检出限为0.6μg/kg；黄桃中AOH的定量限为0.28μg/kg，检出限为0.11μg/kg。加标回收试验结果表明，PDA中AOH回收率范围为74.6％～93.7％(n＝5)，精密度(RSD％)范围为3.6％～9.2％(n＝5)；黄桃中AOH的回收率范围为85.1％～101.2％(n＝5)，精密度(RSD％)范围为1.9％～9.7％(n＝5)。

PDA中AME的定量限为2μg/kg，检出限为1μg/kg；黄桃中AME的定量限为0.18μg/kg，检出限为0.07μg/kg。加标回收试验结果表明，PDA中AME回收率范围为83.1％～106.7％(n＝5)，精密度(RSD％)范围为2.7％～11.2％(n＝5)；黄桃中AME的回收率范围为88.7％～106.1％(n＝5)，精密度(RSD％)范围为3.3％～6.0％(n＝5)。

PDA中TeA的定量限为5μg/kg，检出限为2μg/kg；黄桃中TeA的定量限为0.2μg/kg，检出限为0.07μg/kg。加标回收试验结果表明，PDA中TeA回收率范围为76.2％～88.5％(n＝5)，精密度(RSD％)范围为1.5％～6.7％(n＝5)；黄桃中TeA的回收率范围为76.6％～102.0％(n＝5)，精密度(RSD％)范围为0.7％～11.2％(n＝5)。

PDA中TEN的定量限为0.1μg/kg，检出限为0.02μg/kg；黄桃中TEN的定量限为0.05μg/kg，检出限为0.02μg/kg。加标回收试验结果表明，PDA中TEN回收率范围为75.1％～101.7％(n＝5)，精密度(RSD％)范围为2.8％～13.7％(n＝5)；黄桃中TEN的回收率范围为89.2％～100.8％(n＝5)，精密度(RSD％)范围为0.7％～1.6％(n＝5)。

以上数据表明，采用的分析方法灵敏、准确、可靠，满足PDA培养基和黄桃中AOH、AME、TeA、TEN的准确定量，可以采用该方法对精氨酸对PDA培养基和黄桃中AOH、AME、TeA、TEN生物合成的抑制作用进行研究。

实施例1

PDA培养基中精氨酸对AOH、AME、TeA、TEN合成的抑制作用

量取适量精氨酸溶于10mL无菌超纯水，过滤除菌后加入90mL灭菌后的PDA培养基，使得最终添加浓度分别达到0、0.1、1、50和100mmol/L。混匀倒板后，接种100μL的菌种孢子液，于28℃恒温恒湿培养箱黑暗培养培养9天，采用上述UHPLC-MS/MS技术检测AOH、AME、TeA、TEN的产量。每个浓度设置平行5份。

结果表明(图1)，与对照组相比(精氨酸浓度0mmol/L)，当精氨酸的浓度达到1mmol/L及以上时，对TeA的生物合成有明显的抑制效果(P<0.01)，抑制率达到97.1％；当精氨酸的浓度不低于50mmol/L时，即可有效抑制AME的生物合成(P<0.05)，产量下降66.7％，抑制效果随着精氨酸浓度的升高而增强；当精氨酸浓度达到50mmol/L时，AOH、TEN的生物合成量明显减少(P<0.05)；当精氨酸浓度达到100mmol/L时几乎完全抑制AOH、AME、TeA、TEN的产生。

实施例2

黄桃中精氨酸对AOH、AME、TeA、TEN合成的抑制作用

量取适量精氨酸溶于无菌超纯水，分别配制浓度分别为10mmol/L、100mmol/L、200mmol/L和500mmol/L的精氨酸溶液，过滤除菌。准确称取50g黄桃于250mL无菌锥形瓶中，120℃高压灭菌30min后分别加入不同浓度的20mL精氨酸溶液，对照组加入20mL无菌超纯水。用无菌透气封口膜密封锥形瓶，摇匀后加入100μL各菌种孢子液于28℃恒温恒湿培养箱黑暗培养培养28天，检测AOH、AME、TeA、TEN的产量。每个浓度设置平行5份。

结果显示(图2)，与对照组相比，当精氨酸的浓度达到10mmol/L以上时，对AOH、AME的生物合成有明显的抑制效果(P<0.01)，抑制率分别达到83.4％和85.9％；当精氨酸的浓度为100mmol/L时即可显著抑制TeA、TEN的合成(P<0.01)，TeA、TEN产量分别下降79.7％和95.0％；当精氨酸的浓度达到500mmol/L基本可完全抑制AOH、AME、TeA和TEN的产生。