藤黄绿脓菌素和自噬抑制剂的药物组合物及用途
阅读说明：本技术 藤黄绿脓菌素和自噬抑制剂的药物组合物及用途 (Pharmaceutical composition of pyoluteorin and autophagy inhibitor and application ) 是由 钱忠明 包勇 于 2020-06-11 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医药领域,涉及用于治疗肿瘤等疾病的药物组合物,具体涉及藤黄绿脓菌素和自噬抑制剂的药物组合。本发明的一种药物组合包括藤黄绿脓菌素和自噬抑制剂。经实验,结果表明,该药物组合通过联合用药可以显著抑制癌细胞的生长,并且具有明显的协同作用,相对于藤黄绿脓菌素单用具有更强的抑制肿瘤的效果。本发明为临床的肿瘤治疗提供新的治疗干预方案,具有良好的临床应用前景。(The invention belongs to the field of biological medicines, relates to a pharmaceutical composition for treating diseases such as tumors and the like, and particularly relates to a pharmaceutical composition of gamboge pyocyancin and an autophagy inhibitor. The drug combination comprises pyoluteorin and an autophagy inhibitor. The experiment shows that the medicine composition can obviously inhibit the growth of cancer cells through combined medication, has obvious synergistic effect and has stronger tumor inhibiting effect compared with the single use of the pyoluteorin. The invention provides a new therapeutic intervention scheme for clinical tumor treatment and has good clinical application prospect.)
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及用于治疗肿瘤等疾病的药物组合物，具体涉及藤黄绿脓菌素(Pyoluteorin)和自噬抑制剂的联合用药物，以及该药物组合物的药用用途。
背景技术
现有技术公开了肿瘤以细胞的无限增殖为特点，是目前全世界人类健康的巨大威胁。例如，胰腺癌是世界上最具侵袭性的人类癌症之一。尽管在过去的几十年里已经取得了显著的进展，胰腺癌的治疗情况并没有太大的改变，5年总体生存率仍然低于6％。目前胰腺癌的一线治疗方案仍然以化疗药物吉西他滨为主。然而，吉西他滨往往会引起耐药性和副作用，因此开发新的更有效的抗胰腺癌药物迫在眉睫。
近年的研究发现，免疫在肿瘤的发生发展中起着重要作用。自噬是一个进化上保守的生理过程，其通过降解错误折叠的蛋白质和受损的细胞器，从而在外界应激下维持自身的稳态并维护机体能量供给的平衡。
藤黄绿脓菌素(Pyoluteorin)是从荧光假单胞菌中分离出来的一种天然的次级细菌代谢产物，目前对该化合物的研究主要集中在其抗菌和抗真菌活性方面。然而，其抗肿瘤活性却鲜有报道。近期研究表明，藤黄绿脓菌素能够诱导三阴性乳腺癌细胞凋亡，预示着藤黄绿脓菌素在肿瘤治疗中具有重要的作用。因此，探索藤黄绿脓菌素在肿瘤中的作用机制，构建新型的藤黄绿脓菌素的药物组合，对于藤黄绿脓菌素的抗肿瘤方面的临床推广具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是基于现有技术的现状，提供一种用于治疗肿瘤等疾病的药物组合物，具体涉及一种藤黄绿脓菌素(Pyoluteorin)和自噬抑制剂的联合用组合物及其新的药用用途。
本发明基于下述研究结果构思：
研究过程中发现，鉴于藤黄绿脓菌素能够诱导三阴性乳腺癌细胞凋亡，本申请的研究发现藤黄绿脓菌素能够在胰腺癌细胞中明显诱导细胞凋亡，同时，藤黄绿脓菌素还能够诱导胰腺癌细胞自噬，其诱导的细胞自噬的具体机制是通过激活p-JNK通路促进Bcl-2的磷酸化，从而使得Bcl-2于Beclin1蛋白分离，促进Beclin1蛋白结合到Vps34复合物上，最终促进Vps34的活性以及自噬的发生。藤黄绿脓菌素诱导的细胞自噬能够显著抵抗其诱导的细胞凋亡作用。当藤黄绿脓菌素联用自噬抑制剂后，显著抑制了藤黄绿脓菌素诱导的细胞自噬，进一步增强了藤黄绿脓菌素诱导的细胞凋亡。对于胰腺癌细胞的杀伤作用得到了明显的增加。
本发明提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括藤黄绿脓菌素和自噬抑制剂。
本发明的实施例表明，该药物组合物采用联合用药可以显著抑制胰腺癌细胞的生长，并且具有明显的协同作用。藤黄绿脓菌素作为凋亡诱导剂和自噬抑制剂3-MA的药物组合，可以应用于肿瘤特别是胰腺癌的治疗。
本发明的藤黄绿脓菌素和自噬抑制的组合中，所述藤黄绿脓菌素为藤黄绿脓菌素及其结构类似和功能类似的衍生物。
本发明的联合用药中的藤黄绿脓菌素的结构式如图1所示。
本发明的联合用药中的自噬抑制剂包括磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的抑制剂、氯喹、Thapsigargin(TG，毒胡萝卜素)、巴弗洛霉素A1、去甲氯丙咪嗪(DCMI)、曲古抑菌素(TSA)、，苯基乙炔磺酰胺中的一种或几种。
磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的抑制剂包括：3-MA、Wortmannin(渥曼青霉素)和LY294002(CAS:154447-36-6)等。优选氯喹和3-MA。
3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的抑制剂。PI3K在许多生物过程中起着重要作用，包括控制mTOR的激活，mTOR是自噬的关键调节因子。3-MA通过抑制III类PI3K阻断自噬体的形成来抑制自噬，也是自噬早期抑制剂。
氯喹可以提高溶酶体的pH，从而抑制自噬体与溶酶体的融合和溶酶体蛋白质的降解，在自噬的后期抑制自噬。
所述的药物组合物还包括药学上可以接受的载体和赋形剂。载体可以是制药领域中任何常规的载体和赋形剂。具体的载体和赋形剂的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态。用于特定给药模式的合适药物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。例如，可以作为药学上可接受的载体或赋形剂包括药学领域常规的载体、赋形剂、稀释剂、填充剂、溶剂、支持剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂等。必要时，还可以包括香味剂、防腐剂和甜味剂等。
本发明还提供了上述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
所述的抗肿瘤药物可以是预防和/或治疗肿瘤疾病的药物。例如，所述的抗肿瘤药物是肿瘤细胞增殖抑制剂。
所述的肿瘤细胞可以是恶性肿瘤细胞即癌细胞，优选为胰腺癌细胞、乳腺癌细胞、乳腺导管癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、结直肠癌细胞或者前列腺癌细胞。
所述的癌细胞为胰腺导管腺癌细胞、胰腺癌细胞、乳腺癌细胞或者乳腺导管癌细胞。
所述的细胞是p-JNK通路活性低的细胞。
本发明的实验结果表明，与藤黄绿脓菌素单用相比，藤黄绿脓菌素与自噬抑制剂CQ或3-MA联用后，显著增加藤黄绿脓菌素对肿瘤的抑制效果；藤黄绿脓菌素和自噬抑制剂3-MA联用在小鼠体内能明显抑制肿瘤的发生和发展；藤黄绿脓菌素与自噬抑制剂联用具有协同效应。
本发明的优点有：
藤黄绿脓菌素和自噬抑制剂已经被证实分别可用于临床治疗，而联合用药能明显提高药物抗肿瘤的能力产生协同作用，提高临床治疗效果，安全性高，故本发明为临床治疗肿瘤疾病提供了一种新的、更有效的治疗干预方案。
附图说明
图1为藤黄绿脓菌素的结构式图；
图2为胰腺癌细胞系BxPC3中LC3的蛋白表达的western blot结果图；
图3为胰腺癌细胞系BxPC3中免疫荧光共聚焦成像图；
图4为胰腺癌细胞系BxPC3中透射电镜结果成像图；
图5为胰腺癌细胞系BxPC3和Capan-1经处理后相对细胞活力图，图A为经过藤黄绿脓菌素和3-MA处理，图B为经过藤黄绿脓菌素和CQ处理；
图6为胰腺癌PDX模型的瘤体生长曲线。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。实施例中未注明具体条件者，按照分子生物学与免疫学的常规实验条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1藤黄绿脓菌素诱导细胞凋亡
本实施例通过western blot实验，验证藤黄绿脓菌素能够诱导细胞自噬。具体实验步骤如下：
将对数生长的胰腺癌细胞BxPC3消化后，接种于6孔板中，通过不同浓度的藤黄绿脓菌素(0,0.5,1和2μM)处理细胞24小时，然后收集并裂解细胞，取20μg蛋白进行westernblot实验，检测凋亡指标Caspase3的表达变化情况；
实施例2藤黄绿脓菌素诱导细胞自噬
本实施例通过western blot实验，免疫荧光实验和透射电镜实验，验证藤黄绿脓菌素能够诱导细胞自噬。具体实验步骤如下：
将对数生长的胰腺癌细胞BxPC3消化后，接种于6孔板中，用藤黄绿脓菌素处理细胞，进行浓度梯度和时间梯度实验：
①浓度梯度实验：通过不同浓度的藤黄绿脓菌素(0,0.5,1和2μM)处理细胞24小时，然后收集并裂解细胞，取20μg蛋白进行western blot实验，检测自噬指标LC3的表达变化情况；
②时间梯度实验：用藤黄绿脓菌素(1μM)处理细胞8小时，16小时和24小时，然后收集并裂解细胞，取20μg蛋白进行western blot实验，检测自噬指标LC3的表达变化情况；Western Blot检测结果见图2。
免疫荧光实验：
取指数生长期的BxPC3细胞，瞬时转染GFP-LC3并培养24小时。胰酶消化后，1500rpm离心5min，弃去上清液后用相应培养基打匀，制成细胞悬液，用计数仪计数后稀释成浓度为5.6×104个细胞/mL的细胞悬液，接种于共聚焦皿中，每孔200μL，置于细胞培养箱24h。然后加入藤黄绿脓菌素(1μM)，对照加入等量的DMSO，接着培养24小时后。移去上清，PBS洗涤细胞一遍后，用100μL/孔含4％多聚甲醛，室温固定细胞15min后，用PBS洗3遍，后加入10μg/mL Hoechst的PBS常温孵育5min后，于Opera上成像。成像中物镜选择40X水镜头，每个孔随机自动采集9张图片，分别用488激发检测GFP蛋白和425激发Hoechst检测细胞核，结果见图3。
透射电镜实验：
取对数生长期的BxPC3细胞，加入藤黄绿脓菌素(1μM)，对照加入等量的DMSO，接着培养24小时。随后将贴壁细胞刮下，细胞连同培养基转移至15ml离心管中，1500rpm离心5min，然后弃去上清。用1ml的PBS重悬细胞，加入到1.5ml的EP管中，1500rpm离心5min，弃去上清，随后注入新鲜配制的2.5％的戊二醛固定液，切片后上机检测，结果见图4。
实施例3藤黄绿脓菌素与自噬抑制剂联用抑制肿瘤细胞活性
本实施例将藤黄绿脓菌素分别与CQ或3-MA进行联用，通过CCK8法，验证藤黄绿脓菌素与细胞自噬抑制剂联用能够显著增加藤黄绿脓菌素促细胞凋亡的功能。实验步骤如下：
藤黄绿脓菌素与CQ联合用药：
取指数生长期胰腺癌细胞系BxPC3和Capan-1，1500rpm离心5min，弃去上清液后用相应培养基重悬，制成细胞悬液，用细胞计数器计数后稀释成浓度为3.0ⅹ104个细胞/ml的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔40μL，另留一孔不加细胞作为背景对照。于37℃、5％二氧化碳的条件下，培养细胞于添加10％的FBS培养基中。细胞置于培养箱过夜，分别加入藤黄绿脓菌素(1μM)，CQ(5μM)或者两者联用(藤黄绿脓菌素1μM，CQ 5μM)，以10μM的DMSO处理作为空白对照。在培养箱内培养48小时后，吸掉培养液，在每个孔内加入50μl的新鲜培养液，其含5μL的CCK-8试剂，在培养箱内培养1-2小时后，在450nm波长处用Envision测定吸光度，参比波长为650nm。将所有孔读值减去不种细胞孔的背景值后，计算测试化合物对细胞的增殖抑制率IR(％)＝(OD值对照孔－OD值给药孔)/OD值对照孔ⅹ100％。实验重复3次，计算3次实验的平均值作为抑制能力的最终指标。检测得到细胞活性值见图5A。
藤黄绿脓菌素与3-MA联合用药：
取指数生长期胰腺癌细胞系BxPC3和Capan-1，1500rpm离心5min，弃去上清液后用相应培养基重悬，制成细胞悬液，用细胞计数器计数后稀释成浓度为3.0ⅹ104个细胞/ml的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔40μL，另留一孔不加细胞作为背景对照。于37℃、5％二氧化碳的条件下，培养细胞于添加10％的FBS培养基中。细胞置于培养箱过夜，分别加入藤黄绿脓菌素(1μM)，3-MA(5mM)或者两者联用(藤黄绿脓菌素1μM，3-MA 5mM)，以10μM的DMSO处理作为空白对照。在培养箱内培养48小时后，吸掉培养液，在每个孔内加入50μl的新鲜培养液，其含5μL的CCK-8试剂，在培养箱内培养1-2小时后，在450nm波长处用Envision测定吸光度，参比波长为650nm。将所有孔读值减去不种细胞孔的背景值后，计算测试化合物对细胞的增殖抑制率IR(％)＝(OD值对照孔－OD值给药孔)/OD值对照孔ⅹ100％。实验重复3次，计算3次实验的平均值作为抑制能力的最终指标。检测得到细胞活性值见图5B。
根据图5显示，与藤黄绿脓菌素单用相比，藤黄绿脓菌素与自噬抑制剂CQ或3-MA联用后，显著增加藤黄绿脓菌素对肿瘤的抑制效果。
实施例4藤黄绿脓菌素和自噬抑制剂3-MA联用在小鼠模型中抑制肿瘤生长
将人胰腺癌细胞株BxPC3细胞按5×106细胞/只分别皮下接种于5到6周的裸鼠右侧腋窝，形成移植瘤后再在裸小鼠体内传代后使用。取生长旺盛期的肿瘤组织，无菌条件下剪切成1.5到2.0mm3左右，接种于裸小鼠右侧腋窝的皮下。用游标卡尺测定移植瘤直径，当肿瘤体积达到100mm3左右时，随机分4组，每组5到6只裸鼠。第一组是阴性对照组，给等量溶剂；第二组是每2日尾静脉注射10mg/kg的藤黄绿脓菌素；第三组是每两日尾静脉注射3-MA(25mg/kg)；第四组是这两个药的联用，即每两日尾静脉注射10mg/kg藤黄绿脓菌素和25mg/kg的3-MA。每3天测量肿瘤长(B，肿瘤直径)宽(A，肿瘤横径)，并由此计算肿瘤体积V＝A×B2/2。
相对肿瘤增值率的计算公式如下：RTV＝Vt/V0。其中Vt为某一时间的肿瘤体积，V0为开始给药时的肿瘤体积。相对肿瘤增值率的计算公式：T/C(％)＝治疗组相对肿瘤增值率/溶剂对照组相对肿瘤增值率x 100％。
肿瘤抑制百分比的计算公式：肿瘤抑制百分率％＝(对照组瘤重－给药组瘤重)/对照组瘤重x 100％。
疗效评价标准：T/C(％)>60认为是无效；T/C(％)≤60，并且与溶剂对照组比较，瘤体积经统计学处理P<0.05，认为是有效的。计量资料的统计分析均采用双侧T检验。生长曲线见图6。由图可见，藤黄绿脓菌素和自噬抑制剂3-MA联用在小鼠体内能够明显抑制肿瘤的发生和发展。
实施例5藤黄绿脓菌素和自噬抑制剂联用具有协同效应
采用标准协同指数计算公式Q＝E(A+B)/(E(A)+E(B)-E(A)×E(B))，(E(A+B)为两药联用抑制率，E(A)为A药单用的抑制率，E(A)为B药单用的抑制率)进行藤黄绿脓菌素与CQ的协同效应统计，当Q值大于1.15时定义为协同效应。在胰腺癌细胞系BxPC3中E(藤黄绿脓菌素)＝0.23，E(CQ)＝0.16，E(藤黄绿脓菌素+CQ)＝0.84，Q＝1.57，显示为协同效应。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本申请公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
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