褪黑素在制备治疗外伤性白内障药物中的应用
阅读说明：本技术 褪黑素在制备治疗外伤性白内障药物中的应用 (Application of melatonin in preparation of medicine for treating traumatic cataract ) 是由 周健 郑超 吴桐 于 2021-10-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了褪黑素在制备治疗外伤性白内障药物中的应用。褪黑素在应激的晶状体上皮细胞中,对ATF6的上调具有显著的抑制作用,腹腔注射褪黑素能够显著抑制小鼠晶状体在针刺诱导后EMT的发生,进而抑制晶状体的混浊,实验结果表明褪黑素可以达到治疗外伤性白内障的目的。(The invention discloses an application of melatonin in preparing a medicament for treating traumatic cataract. The melatonin has a remarkable inhibiting effect on the up-regulation of ATF6 in stressed lens epithelial cells, the generation of EMT (acute myocardial infarction) of mouse lenses after needle stick induction can be remarkably inhibited by intraperitoneal injection of the melatonin, and further the opacity of the lenses is inhibited, and experimental results show that the melatonin can achieve the purpose of treating traumatic cataract.)
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及褪黑素(melatonin)在制备治疗外伤性白内障药物中的应用。
背景技术
外伤性白内障是指晶状体完整性遭受破坏，并诱发晶状体纤维变性或瘢痕修复，从而导致的晶状体混浊。外伤性白内障是眼球发生穿孔伤或挫伤后常见的并发症之一，多见于儿童及年轻人，致盲率达47.5％。一期手术摘除晶状体是公认的治疗外伤性白内障的方法，但越来越多的证据表明，由于术后并发症、眼内炎症，导致手术高风险以及强烈的玻璃体视网膜粘连等诸多隐患。目前除减轻炎症、抗感染等对症治疗，临床尚无干预外伤所致晶状体混浊病理进程的药物，使得外伤性白内障在保守和手术治疗之间存在不容忽视的疾病临床管理缺口。
前期研究证明EMT是外伤性白内障的主要发病原因，即外伤、刺激或手术后房水中各种细胞因子和生长因子水平升高，刺激晶状体上皮细胞(LEC)增殖并从上皮表型转变为间充质表型，并以此建立了外伤性白内障的小鼠疾病模型作为研究基础。
褪黑素是一种由松果体分泌的吲哚杂环类化合物，其产生和释放受到交感神经调控，能够调节生物的昼夜节律和季节性繁殖，并且具有显著的抗炎症、抗氧化、抗衰老特性。其在年龄相关性白内障和糖尿病白内障中被证实具有一定疗效。在年龄相关性白内障中的研究中，褪黑素作为一种间接的抗氧化剂，可以降低大鼠脂质过氧化水平、增加谷胱甘肽的产生，并增加白内障大鼠抗氧化酶的活性；在STZ诱导的糖尿病大鼠白内障中，褪黑素可以减少醛糖还原酶活性，减缓糖尿病相关白内障发生；在高糖条件下，体外培养兔晶状体可以通过褪黑素干预抑制白内障的形成(曲宏，褪黑素对高糖诱导白内障形成抑制作用的实验研究)。最新的研究发现褪黑素也可作为ATF6抑制剂在脑出血继发脑损伤中发挥保护作用(芦晓阳，褪黑素/ATF6/CHOP通路在脑出血继发脑损伤中的保护作用及其机制研究)。
中国专利CN111153846A、CN111153850A报道了可以用于治疗具有ID01介导的拳尿氨酸代谢途径的病理学特征的相关疾病(包括白内障)的吡咯类、吲哚类化合物。但这些专利中所提及的白内障为氨基酸生成异常导致的晶状体纤维细胞分化不良及凋亡所致，在白内障的类型、发病机制上都、治疗靶点上与外伤性白内障(由于晶状体纤维和晶状体缝(Y字缝)的结构受到破坏，液体在晶状体缝和晶状体纤维板层间流动形成放射状混浊；或因组织损伤，晶状体纤维变性及形成瘢痕而发生混浊)存在明显差异。
尽管有研究报道晶状体囊膜破裂存在自限性的自然病史，而不会形成进行性白内障，提示非手术的保守药物干预具有可行性，然而针对白内障研发的药物疗效仍不明确，外伤性白内障由于进展更为迅速，目前更是尚无药物管理策略。因此，寻找外伤性白内障有效致病靶点、研发合理药物干预策略，是临床疾病管理的迫切需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种褪黑素在制备治疗外伤性白内障药物中的应用。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明依据所发现的外伤性白内障发病机制，即未折叠蛋白反应(UPR)依赖的上皮-间充质转化(EMT)，在晶状体上皮细胞的体外应激模型中给予未折叠蛋白反应(UPR)抑制剂，例如100～200μM褪黑素进行干预，以及在小鼠针刺致外伤性白内障的疾病模型中给予5～20mg/kg/d褪黑素进行干预，可以显著抑制激活转录因子6(ATF6)的上调，从而阻遏ATF6介导的UPR、抑制UPR依赖的EMT，最终达到了治疗外伤性白内障的目的。
本发明的有益效果体现在：
本发明通过体内外药理实验证实，通过采用药物抑制ATF6上调，可以有效的抑制眼球穿孔伤或挫伤等刺激因素引发的晶状体混浊。实验结果表明UPR抑制剂(例如非特异性ATF6抑制剂褪黑素、特异性ATF6抑制剂CeapinA7)可以开发为外伤性白内障的临床治疗药物。
附图说明
图1为外伤性白内障小鼠模型示意图；其中：(A)小鼠晶状体针刺模型造模手术(LECs：晶状体上皮细胞)；(B)前囊膜下瘢痕及晶状体混浊程度的术后观察。
图2为外伤性白内障小鼠模型形态学改变、组织病理、分子标志物检测结果；其中：(A)造模手术7d后晶状体形态学观察(图上部为活体裂隙灯拍照，图下部为体外晶状体拍照)，(B)HE染色观察造模部位形态特征(图下部为图上部框选区域放大结果)，(C)免疫荧光染色检测造模部位EMT标志物αSMA和Fibronectin(FN)在囊下斑块处的表达。
图3为CCK8药物(褪黑素)毒性检测结果。
图4为各组稳转细胞系UPR与EMT相关标志物表达的检测结果；其中：(A)ATF6及Snail1蛋白表达的代表性WB(Western blot)结果；(B)ATF6、Bip、CHOP、Snail1、Fibronectin、αSMA、N-cadherin mRNA表达的RT-qPCR结果，*P<0.05、**P<0.01。
图5为褪黑素对外伤性白内障的在体干预结果；其中：(A)晶状体形态学观察，(B)晶状体前囊膜EMT标志物表达(铺片免疫荧光染色)，(C)HE染色观察造模部位形态特征，(D)晶状体冰冻切片免疫荧光染色。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。
(一)外伤性白内障的发病机制
通过实验发现外伤性白内障的小鼠疾病模型激活了内质网上的未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)，并证实UPR依赖的上皮-间充质转化(EMT)是外伤性白内障的主要发病机制，即机械性损伤使得晶状体上皮发生细胞应激、激活以激活转录因子6(ATF6)介导的UPR，ATF6进一步转录激活EMT重要转录因子SNAIL1，驱动晶状体上皮细胞增殖并从上皮表型转变为间充质表型，且通过分泌大量的细胞外基质蛋白(例如胶原蛋白、纤连蛋白等)介导纤维修复，最终导致透明的晶状体发生混浊。因此，使用药物靶向抑制UPR可能是外伤性白内障有效的干预策略。
(二)针刺致外伤性白内障模型构建
参见图1，选择C57BL/6J小鼠左眼作为实验眼，右眼作为对照眼。小鼠经1％戊巴比妥钠常规麻醉后使用复方托吡卡胺滴眼液散瞳，在体式显微镜下使用32G无菌注射器针头(needle)在实验眼角膜旁中央位置刺穿角膜(puncture cornea)，并继续进针至穿破前囊膜1/3针尖，术毕角膜表面滴加替沙星凝胶，7天后观察前囊膜下瘢痕(subcapsularplaque)及晶状体(lens)混浊程度。
(三)晶状体形态学、组织病理、分子标志物检测
3.1晶状体形态学观察
小鼠散瞳后用裂隙灯进行白内障表型观察并拍照；摘除小鼠眼球后体式镜下拍照，观察损伤修复情况及前房环境；分离小鼠眼球晶状体，使用透照法在倒置显微镜下对小鼠眼球的晶状体拍照。
3.2晶状体病理染色
在取材时间牺牲小鼠并摘出眼球，加入适量Davidson固定液于室温下固定整眼过夜，使用PBS洗涤标本、30％蔗糖脱水，OCT包埋后切片；冰冻切片复温后，用PBS洗去包埋剂，进行常规苏木精-伊红(HE)染色，观察囊膜破裂损伤部位晶状体纤维斑块形成范围、形态与细胞成分。
3.3免疫荧光原位检测UPR及EMT分子标志物
晶状体取材与冰冻制片同3.2，使用ATF6抗体进行免疫荧光染色，检测ATF6蛋白的表达改变，明确外伤性白内障与激活UPR的关系；晶状体取材与冰冻制片同3.2，使用α-SMA及Fibronectin抗体分别进行免疫荧光染色，检测α-SMA及Fibronectin的表达，以明确损伤部位修复方式。
针刺诱导后第7天，晶状体完全混浊(图2A)；在冰冻切片上发现针刺部位瘢痕形成(图2B)及EMT的发生(图2C)。
(四)褪黑素细胞毒性实验
4.1晶状体上皮细胞系培养
人晶状体上皮细胞系(HLE-B3)在低糖DMEM培养(含有10％胎牛血清、100IU/mL青/链霉素)。
4.2CCK8细胞增殖实验
制备单细胞悬液，计数后按2000个/孔的密度接种96孔板，每组设5个复孔，待细胞贴壁后2h，分别加入浓度梯度为0(对照组)、5、10、20、50、100、200μM褪黑素孵育24h，然后每孔分别加入10μL CCK8细胞计数溶液混匀，孵箱中孵育1小时，用酶标仪在450nm波长测定各组(组间褪黑素浓度不同)5个孔及空白孔(仅含有细胞培养基与CCK8试剂)的吸光度OD值，并计算各组细胞增殖活力：
增殖活力＝(实验组平均OD值-空白组平均OD值)/(对照组平均OD值-空白组平均OD值)×100％
经三次独立重复实验，比较各孔细胞组间增殖活力差异。实验结果表明5～200μM浓度褪黑素对晶状体上皮细胞活力无影响(图3)。
(五)晶状体上皮细胞的体外应激模型及干预实验
5.1体外实验分组
按照体外联合给予UPR激动剂(Tunicamycin，TM)与shRNA-ATF6(即用于沉默ATF6基因的shRNA表达载体，shATF6)、ATF6抑制剂(褪黑素，melatonin)、阳性对照药物(CeapinA7)进行实验分组，具体分组如下：Control组(仅正常培养细胞，Ctrl组)、TM+PBS组、TM+shATF6组、TM+CeapinA7组和TM+melatonin组。
制备单细胞悬液，计数后按2×105个/孔的密度接种6孔板，每组设3个复孔，待细胞贴壁后2h，各组(除Ctrl组外)分别加入TM及相应实验药物，孵育24h后弃去培养基，使用试剂盒提取总蛋白与mRNA待测。实验中，每孔加入TM至终浓度为4μg/mL，shATF6 MOI值为50、CeapinA7给药浓度为10μM、melatonin给药浓度为100μM。
5.2UPR依赖的EMT细胞水平改变的检测
(1)蛋白免疫印迹
使用12％分离胶和6％浓缩胶倒入电泳缓冲液(1×)，蛋白样品上样量为40μg并加入5μL预染蛋白标准品；以浓缩胶90V，分离胶110V，电泳时间约110min完成蛋白分离；取出凝胶放入转移缓冲液(1×)中，恒流400mA、2h，将凝胶上的蛋白电转移至PVDF膜，脱脂牛奶封闭2h后将目的条带浸泡在1:1000稀释的ATF6、Snail1和GAPDH一抗溶液中，4℃过夜；使用1×TBST洗涤PVDF膜3次，每次10分钟；使用对应二抗进行37℃孵育1小时后，使用1×TBST洗涤PVDF膜3次，每次10分钟；在暗室中滴加超敏ECL发光液于PVDF膜上并曝光，使用ImageJ软件计算条带灰度值，采用GraphPad Prism6软件进行统计学分析。
(2)RT-qPCR
使用紫外分光光度计测定已提取出的细胞总RNA在260nm和280nm处吸光度，计算待检测样品的含量和纯度。用2μg提取的总RNA进行逆转录反应(20μL的反应体系)，具体步骤参考逆转录反应试剂盒说明。使用逆转录得到的cDNA进行PCR反应，将反应体系(cDNA 1μL、SYBR探针10μL、正向引物1μL、反向引物1μL，及无RNA酶水7μL)混匀后上机扩增。反应条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸15s，共45个循环。其中，正、反向引物根据待测物为ATF6、Bip、CHOP、Snail1、αSMA、N-cadherin、Fibronectin mRNA(即目的基因)分别设计，反应结束后，以β-actin为内参，分析各目的基因的表达水平。
对UPR和EMT标志物进行检测后发现(图4)，在TM+PBS组中ATF6和EMT关键转录因子Snail1仍呈现显著的协同上调，但在褪黑素作用(即TM+melatonin组中)或CeapinA7作用(即TM+CeapinA7组中)后，UPR激动剂对Snail1的上调作用消失。
(六)小鼠针刺致外伤性白内障的疾病模型及干预实验
6.1小鼠给药策略
利用8周C57BL/6J小鼠建立针刺致外伤性白内障模型，并随机分为两组：
melatonin组：将褪黑素(melatonin)粉末溶解于含有5％DMSO的玉米油中，超声至完全溶解，按照8mg/kg剂量对C57小鼠每日晚10点进行腹腔注射褪黑素(n＝3)；
对照组：另取相同造模小鼠(n＝3)每日腹腔注射相同体积的溶剂(玉米油，5％DMSO)。
于针刺诱导后第7天对两组小鼠进行活体前节拍照，取材病理学染色，观察褪黑素对外伤性白内障表型(晶状体混浊)的作用。
6.2褪黑素在体显著改善外伤性白内障表型
在小鼠针刺致外伤性白内障模型基础上经腹腔连续注射褪黑素(8mg/kg/d)，结果在7天后可见melatonin组小鼠晶状体混浊程度减轻(图5A)，晶状体前囊膜铺片免疫荧光染色显示ATF6及EMT标志物Fibronectin表达减少(图5B)，HE染色观察造模部位形态特征为褪黑素组囊膜下斑块接近消失(图5C)，晶状体冰冻切片免疫荧光染色检测造模部位ATF6表达减弱(图5D)。
在小鼠针刺致外伤性白内障模型基础上经腹腔连续注射溶剂，结果在7天后对照组裂隙灯拍照可见明显的混浊，对照组晶状体前囊膜铺片可见病灶有局部斑块形成且有ATF6及EMT标志物Fibronectin表达，对照组HE染色可见囊膜卷曲断裂修复，有明显瘢痕斑块。
以上结果证明褪黑素可显著抑制EMT发生，进而抑制晶状体的混浊。
总之，褪黑素在应激的晶状体上皮细胞中，对ATF6的上调具有显著的抑制作用，且腹腔注射褪黑素能够显著抑制小鼠晶状体在针刺诱导后EMT的发生，进而抑制晶状体的混浊。因此，利用褪黑素、CeapinA7等UPR抑制剂治疗外伤性白内障具有可行性、且作用靶点与实验理论研究发现相符，能够满足目前临床对外伤性白内障药物治疗的迫切需求。
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