一种新型小鼠原位胸膜间皮瘤模型及其建立方法
阅读说明：本技术 一种新型小鼠原位胸膜间皮瘤模型及其建立方法 (Novel mouse in-situ pleural mesothelioma model and establishment method thereof ) 是由 韩丹 白崔巍 沈莎莎 王培� 江杰 谢晓洁 康绍磊 赵迅冉 黄益龙 张正华 于 2021-08-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种新型小鼠原位胸膜间皮瘤模型及其建立方法,包括以下步骤：步骤一：取BLAB/C裸鼠90只作为实验组,对照组30只,统一放入培养箱中进行正常培养；步骤二：在BLAB/C裸鼠呼吸和心跳等正常的情况下,将小鼠麻醉并以仰卧位固定在动物手术台上进行实验；步骤三：在小鼠的左侧肋骨5/6肋间隙与左侧胸壁腋前线的交点处,使用显微镊提拉该处的皮肤,随后使用22G无菌锐针头对该处皮肤进行破口,随后使用30G无菌钝枕头沿上述破口对壁层胸膜进行破溃,本发明的移植瘤方法可适用胸膜肿瘤的原位移植。可最大限度的还原胸膜肿瘤的生长方式、侵袭能力以及肿瘤转移效果,为研究胸膜肿瘤构建了一个良好的小鼠模型。(The invention discloses a novel mouse in-situ pleural mesothelioma model and an establishment method thereof, and the novel mouse in-situ pleural mesothelioma model comprises the following steps: the method comprises the following steps: taking 90 BLAB/C nude mice as experimental groups and 30 control groups, and uniformly putting the experimental groups and the control groups into an incubator for normal culture; step two: under the normal conditions of BLAB/C nude mice breathing, heartbeat and the like, anesthetizing the mice and fixing the mice on an animal operating table in a supine position for carrying out an experiment; step three: at the intersection of the left rib 5/6 intercostal space and the left chest wall axillary anterior line of the mouse, the skin at the intersection is lifted by using microscopic forceps, then the skin at the intersection is crevassed by using a 22G sterile sharp needle, and then the parietal pleura is crevassed along the crevasse by using a 30G sterile blunt pillow. The growth mode, the invasion capacity and the tumor metastasis effect of the pleural tumor can be reduced to the maximum extent, and a good mouse model is established for researching the pleural tumor.)
技术领域
本发明属于胸膜肿瘤原位移植技术领域，具体涉及一种新型小鼠原位胸膜间皮瘤模型及其建立方法。
背景技术
胸膜间皮瘤为胸膜原发性肿瘤，是来源于脏层、壁层、纵隔或横膈四部分胸膜的肿瘤。国外发病率高于国内，各为0.07～0.11％和0.04％。死亡率占全世界所有肿瘤的1％以下。50岁以上多见，男女之比为2:1。该病与石棉接触有关。恶性型尚缺乏有效的治疗方法。
胸膜是分别被覆盖于左右肺胸壁内表面纵隔上面的浆膜，医学把脏腑各种不同的功能活动以“气”来表达，有人认为肺气理论是中医学中重要观点，值得深究。而胸膜包裹于肺度外面，从中医角度来讲，有助于肺脏完隶主气司呼吸的功能，归属于“肺气”的范畴，肺气有卫外功能，关系到机体正气的盛衰，可能与现代免疫功能有一定的关系，在医学中对胸膜尚未记载，而把由于胸膜病变产生的胸腔积液归属“悬饮”的范畴。已证实病理机制是，石棉可导致炎性进行性侵润，或可导致免疫逃逸效应。除此之外，由于石棉物质的特殊性，可以导致细胞在分裂过程中影响纺锤丝等一系列染色体臂缺失效应，但关于胸膜与免疫系统的作用，仅有研究报道胸膜间皮细胞对胸腺、脾细胞增生反应的影响，体外培养正常的胸膜间皮细胞是进行相关实验研究的基础及研究其特性的重要手段，对研究胸膜原位肿瘤的小鼠模型具有深远意义，关于胸膜间皮瘤在小鼠胸腔原位成瘤至今国内未见报道。
目前动物实验的胸膜间皮瘤成瘤方式主要以腋下或腹侧壁成瘤较为常见，但上述成瘤方式所形成的肿瘤无法模拟肿瘤在生长过程中对周围组织 (如：脏层胸膜、壁层胸膜、相邻肺组织)的损伤及侵袭效应。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种新型小鼠原位胸膜间皮瘤模型及其建立方法，以解决上述背景技术中提出的目前动物实验的胸膜间皮瘤成瘤方式主要以腋下或腹侧壁成瘤较为常见，但上述成瘤方式所形成的肿瘤无法模拟肿瘤在生长过程中对周围组织(如：脏层胸膜、壁层胸膜、相邻肺组织)的损伤及侵袭效应的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种新型小鼠原位胸膜间皮瘤模型及其建立方法，包括以下步骤：
步骤一：取BLAB/C裸鼠90只作为实验组，对照组30只，统一放入培养箱中进行正常培养；
步骤二：在BLAB/C裸鼠呼吸和心跳等正常的情况下，将小鼠麻醉并以仰卧位固定在动物手术台上进行实验；
步骤三：在小鼠的左侧肋骨5/6肋间隙与左侧胸壁腋前线的交点处，使用显微镊提拉该处的皮肤，随后使用22G无菌锐针头对该处皮肤进行破口，随后使用30G无菌钝枕头沿上述破口对壁层胸膜进行破溃；
步骤四：沿提拉皮肤的反向方位对裸鼠胸腔进针，破溃肋间肌及壁层胸膜约0.5-0.6mm，旋转针头于左侧胸壁内侧平行进针，并使针头方向指向左侧胸锁关节，体表观察针头位置，并于距离左侧胸锁关节1mm处停止进针，注射肿瘤细胞悬液60-80μl；
步骤五：注射完成后，将针头退出，并观察小鼠的生命体征；
步骤六：每隔1个月对实验组和对照组的小鼠进行一次体重称量并记录数据，实验组的小鼠从诱发后的第三个月开始，每隔1-3个月对小鼠分批次进行胸部CT扫描，实时观察小鼠体内的肿瘤的变化情况。
优选的，所述步骤一中，BLAB/C裸鼠选取的标准为体重16-18g，小鼠身体各项机能正常，且雌雄各半，且实验组的90只小鼠分为三组，分别命名为大剂量组、中剂量组和小剂量组。
优选的，所述步骤三中，对小鼠的左侧肋骨5/6肋间隙与左侧胸壁腋前线的交点处破口时注意不损坏该处的壁层胸膜。
优选的，所述步骤四中，小剂量组注射肿瘤细胞悬液60μl，中剂量组注射肿瘤细胞悬液70μl，大剂量组注射肿瘤细胞悬液80μl。
优选的，所述步骤四中，进针的距离应＜6mm。
优选的，所述步骤四中，实验组每月注射一次，每次60-80μl，连续注射两个月，对照组按照同样的方法和位置注射灭菌生理盐水，每月注射一次，每次注射60-80μl，并连续注射两个月。
优选的，所述步骤五中，对实验组和对照组的小鼠进行观察时，每月称体重1次，并记录体重数据，整个实验历时两年。
优选的，所述步骤六中，每次扫描实验组小鼠10-20只，扫描对照组小鼠 3-5只，实验组小鼠每次扫描完成后，不立即处理掉小鼠，待其自然死亡。
优选的，所述步骤六中，对于濒死或已经死亡的小鼠，先进行胸部CT扫描后，再进行尸解病理学的检查，观察小鼠胸膜内是否已经诱发肿瘤。
优选的，所述步骤六中，对三组实验组和一组对照组的肿瘤诱发率、小鼠死亡率等数据进行实时记录并制定表格。
与现有技术相比，本发明提供了一种新型小鼠原位胸膜间皮瘤模型及其建立方法，具备以下有益效果：
1、本发明的移植瘤方法可适用胸膜肿瘤的原位移植，可最大限度的还原胸膜肿瘤的生长方式、侵袭能力以及肿瘤转移效果，为临床诊治胸膜间皮瘤的研究提供可靠的动物模型，且有效的避免了目前动物实验的胸膜间皮瘤成瘤方式主要以腋下或腹侧壁成瘤较为常见，但上述成瘤方式所形成的肿瘤无法模拟肿瘤在生长过程中对周围组织(如：脏层胸膜、壁层胸膜、相邻肺组织)的损伤及侵袭效应的问题；
2、本发明通过设置的小鼠原位胸膜间皮瘤模型，有效的解决了肿瘤恶性度高，病情进展快，发现时多已是晚期，无有效的治疗方法，病程短(约6-18 个月)，病死率高，预后极差，由于临床病例较少，发病人群特殊，病例及标本搜集困难，至今仍缺乏对其发生、发展过程中病理、影像及分子生物学方面的系统研究，临床预防、早期诊断和治疗仍是一大难题，本发明通过设置的小鼠原位胸膜间皮瘤模型，可实现实时观察肿瘤动态与离体标本的影像特点，并实现与病理相互对照，有效的解决了上述难题；
3、本发明的诱发瘤在病程、形态上的不一致恰好弥补了人在临床上很难获得新鲜、不同肿瘤时期肿瘤组织标本的缺陷，适合对肿瘤发生发展的病因、机理、病理、影像及遗传学等进行研究，还可利用诱发瘤建株传代；
4、本发明的小鼠肿瘤细胞为人源肿瘤细胞，其诱发瘤的发病部位和发生组织均与人相同，而且分化程度及组织类型构成上也与人具有较大的相似性，与临床有较好的对应性，可作为可作为实验肿瘤模型，模似人体变化，研究其发病机理，探讨阻断防治措施，指导临床诊断及治疗，而且其材料便宜，诱发方法相对简便，易于掌握，与其他诱发方法相比发病快、诱发率高、病变典型,是研究胸膜肿瘤较有价值的动物模型。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制，在附图中：
图1为本发明提出的一种新型小鼠原位胸膜间皮瘤模型及其建立方法的步骤流程图；
图2和图3为将小鼠麻醉并以仰卧位固定在动物手术台后，选择小鼠的左侧肋骨5/6肋间隙与左侧胸壁腋前线的交点处为进针部位；
图4为使用显微镊提拉该处的皮肤，随后用22G无菌锐针头对该处皮肤进行破口，并用30G无菌钝枕头沿上述破口对壁层胸膜进行破溃；
图5为破溃肋间肌及壁层胸膜约0.5-0.6mm，旋转针头于左侧胸壁内侧平行进针，并使针头方向指向左侧胸锁关节，体表观察针头位置，并于距离左侧胸锁关节1mm处停止进针，注射60-80ul结晶紫；
图6为用颈椎脱臼法处死裸鼠后进行解剖，进一步验证结晶紫已顺利进入胸腔，间接表明采用此方法可成功建立小鼠原位胸膜间皮瘤模型。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-6，本发明提供一种技术方案：一种新型小鼠原位胸膜间皮瘤模型及其建立方法，包括以下步骤：
步骤一：取BLAB/C裸鼠90只作为实验组，对照组30只，统一放入培养箱中进行正常培养；
步骤二：在BLAB/C裸鼠呼吸和心跳等正常的情况下，将小鼠麻醉并以仰卧位固定在动物手术台上进行实验；
步骤三：在小鼠的左侧肋骨5/6肋间隙与左侧胸壁腋前线的交点处，使用显微镊提拉该处的皮肤，随后使用22G无菌锐针头对该处皮肤进行破口，随后使用30G无菌钝枕头沿上述破口对壁层胸膜进行破溃；
步骤四：沿提拉皮肤的反向方位对裸鼠胸腔进针，破溃肋间肌及壁层胸膜约0.5-0.6mm，旋转针头于左侧胸壁内侧平行进针，并使针头方向指向左侧胸锁关节，体表观察针头位置，并于距离左侧胸锁关节1mm处停止进针，注射肿瘤细胞悬液60-80μl；
步骤五：注射完成后，将针头退出，并观察小鼠的生命体征；
步骤六：每隔1个月对实验组和对照组的小鼠进行一次体重称量并记录数据，实验组的小鼠从诱发后的第三个月开始，每隔1-3个月对小鼠分批次进行胸部CT扫描，实时观察小鼠体内的肿瘤的变化情况。
本发明中，优选的，步骤一中，BLAB/C裸鼠选取的标准为体重16-18g，小鼠身体各项机能正常，且雌雄各半，且实验组的90只小鼠分为三组，分别命名为大剂量组、中剂量组和小剂量组。
本发明中，优选的，步骤三中，对小鼠的左侧肋骨5/6肋间隙与左侧胸壁腋前线的交点处破口时注意不损坏该处的壁层胸膜。
本发明中，优选的，步骤四中，小剂量组注射肿瘤细胞悬液60μl，中剂量组注射肿瘤细胞悬液70μl，大剂量组注射肿瘤细胞悬液80μl。
本发明中，优选的，步骤四中，进针的距离应＜6mm。
本发明中，优选的，步骤四中，实验组每月注射一次，每次60-80μl，连续注射两个月，对照组按照同样的方法和位置注射灭菌生理盐水，每月注射一次，每次注射60-80μl，并连续注射两个月。
本发明中，优选的，步骤五中，对实验组和对照组的小鼠进行观察时，每月称体重1次，并记录体重数据，整个实验历时两年。
本发明中，优选的，步骤六中，每次扫描实验组小鼠10-20只，扫描对照组小鼠3-5只，实验组小鼠每次扫描完成后，不立即处理掉小鼠，待其自然死亡。
本发明中，优选的，步骤六中，对于濒死或已经死亡的小鼠，先进行胸部CT扫描后，再进行尸解病理学的检查，观察小鼠胸膜内是否已经诱发肿瘤。
本发明中，优选的，步骤六中，对三组实验组和一组对照组的肿瘤诱发率、小鼠死亡率等数据进行实时记录并制定表格。
实施例一
一种新型小鼠原位胸膜间皮瘤模型及其建立方法，包括以下步骤：
步骤一：取BLAB/C裸鼠30只作为实验组，对照组30只，统一放入培养箱中进行正常培养；
步骤二：在BLAB/C裸鼠呼吸和心跳等正常的情况下，将小鼠麻醉并以仰卧位固定在动物手术台上进行实验；
步骤三：在小鼠的左侧肋骨5/6肋间隙与左侧胸壁腋前线的交点处，使用显微镊提拉该处的皮肤，随后使用22G无菌锐针头对该处皮肤进行破口，随后使用30G无菌钝枕头沿上述破口对壁层胸膜进行破溃；
步骤四：沿提拉皮肤的反向方位对裸鼠胸腔进针，破溃肋间肌及壁层胸膜约0.5-0.6mm，旋转针头于左侧胸壁内侧平行进针，并使针头方向指向左侧胸锁关节，体表观察针头位置，并于距离左侧胸锁关节1mm处停止进针，注射肿瘤细胞悬液60μl；
步骤五：注射完成后，将针头退出，并观察小鼠的生命体征；
步骤六：每隔1个月对实验组和对照组的小鼠进行一次体重称量并记录数据，实验组的小鼠从诱发后的第三个月开始，每隔1-3个月对小鼠分批次进行胸部CT扫描，实时观察小鼠体内的肿瘤的变化情况。
步骤一中，BLAB/C裸鼠选取的标准为体重16-18g，小鼠身体各项机能正常，且雌雄各半。
步骤三中，对小鼠的左侧肋骨5/6肋间隙与左侧胸壁腋前线的交点处破口时注意不损坏该处的壁层胸膜。
步骤四中，进针的距离应＜6mm。
步骤四中，实验组每月注射一次，每次60μl，连续注射两个月，对照组按照同样的方法和位置注射灭菌生理盐水，每月注射一次，每次注射60-80 μl，并连续注射两个月。
步骤五中，对实验组和对照组的小鼠进行观察时，每月称体重1次，并记录体重数据，整个实验历时两年。
步骤六中，每次扫描实验组小鼠10只，扫描对照组小鼠3-5只，实验组小鼠每次扫描完成后，不立即处理掉小鼠，待其自然死亡。
步骤六中，对于濒死或已经死亡的小鼠，先进行胸部CT扫描后，再进行尸解病理学的检查，观察小鼠胸膜内是否已经诱发肿瘤。
步骤六中，对实验组和对照组的肿瘤诱发率、小鼠死亡率等数据进行实时记录并制定表格。
实施例二
一种新型小鼠原位胸膜间皮瘤模型及其建立方法，包括以下步骤：
步骤一：取BLAB/C裸鼠30只作为实验组，对照组30只，统一放入培养箱中进行正常培养；
步骤二：在BLAB/C裸鼠呼吸和心跳等正常的情况下，将小鼠麻醉并以仰卧位固定在动物手术台上进行实验；
步骤三：在小鼠的左侧肋骨5/6肋间隙与左侧胸壁腋前线的交点处，使用显微镊提拉该处的皮肤，随后使用22G无菌锐针头对该处皮肤进行破口，随后使用30G无菌钝枕头沿上述破口对壁层胸膜进行破溃；
步骤四：沿提拉皮肤的反向方位对裸鼠胸腔进针，破溃肋间肌及壁层胸膜约0.5-0.6mm，旋转针头于左侧胸壁内侧平行进针，并使针头方向指向左侧胸锁关节，体表观察针头位置，并于距离左侧胸锁关节1mm处停止进针，注射肿瘤细胞悬液70μl；
步骤五：注射完成后，将针头退出，并观察小鼠的生命体征；
步骤六：每隔1个月对实验组和对照组的小鼠进行一次体重称量并记录数据，实验组的小鼠从诱发后的第三个月开始，每隔1-3个月对小鼠分批次进行胸部CT扫描，实时观察小鼠体内的肿瘤的变化情况。
步骤一中，BLAB/C裸鼠选取的标准为体重16-18g，小鼠身体各项机能正常，且雌雄各半。
步骤三中，对小鼠的左侧肋骨5/6肋间隙与左侧胸壁腋前线的交点处破口时注意不损坏该处的壁层胸膜。
步骤四中，进针的距离应＜6mm。
步骤四中，实验组每月注射一次，每次70μl，连续注射两个月，对照组按照同样的方法和位置注射灭菌生理盐水，每月注射一次，每次注射60-80 μl，并连续注射两个月。
步骤五中，对实验组和对照组的小鼠进行观察时，每月称体重1次，并记录体重数据，整个实验历时两年。
步骤六中，每次扫描实验组小鼠10只，扫描对照组小鼠3-5只，实验组小鼠每次扫描完成后，不立即处理掉小鼠，待其自然死亡。
步骤六中，对于濒死或已经死亡的小鼠，先进行胸部CT扫描后，再进行尸解病理学的检查，观察小鼠胸膜内是否已经诱发肿瘤。
步骤六中，对实验组和对照组的肿瘤诱发率、小鼠死亡率等数据进行实时记录并制定表格。
实施例三
一种新型小鼠原位胸膜间皮瘤模型及其建立方法，包括以下步骤：
步骤一：取BLAB/C裸鼠30只作为实验组，对照组30只，统一放入培养箱中进行正常培养；
步骤二：在BLAB/C裸鼠呼吸和心跳等正常的情况下，将小鼠麻醉并以仰卧位固定在动物手术台上进行实验；
步骤三：在小鼠的左侧肋骨5/6肋间隙与左侧胸壁腋前线的交点处，使用显微镊提拉该处的皮肤，随后使用22G无菌锐针头对该处皮肤进行破口，随后使用30G无菌钝枕头沿上述破口对壁层胸膜进行破溃；
步骤四：沿提拉皮肤的反向方位对裸鼠胸腔进针，破溃肋间肌及壁层胸膜约0.5-0.6mm，旋转针头于左侧胸壁内侧平行进针，并使针头方向指向左侧胸锁关节，体表观察针头位置，并于距离左侧胸锁关节1mm处停止进针，注射肿瘤细胞悬液80μl；
步骤五：注射完成后，将针头退出，并观察小鼠的生命体征；
步骤六：每隔1个月对实验组和对照组的小鼠进行一次体重称量并记录数据，实验组的小鼠从诱发后的第三个月开始，每隔1-3个月对小鼠分批次进行胸部CT扫描，实时观察小鼠体内的肿瘤的变化情况。
步骤一中，BLAB/C裸鼠选取的标准为体重16-18g，小鼠身体各项机能正常，且雌雄各半。
步骤三中，对小鼠的左侧肋骨5/6肋间隙与左侧胸壁腋前线的交点处破口时注意不损坏该处的壁层胸膜。
步骤四中，进针的距离应＜6mm。
步骤四中，实验组每月注射一次，每次80μl，连续注射两个月，对照组按照同样的方法和位置注射灭菌生理盐水，每月注射一次，每次注射60-80 μl，并连续注射两个月。
步骤五中，对实验组和对照组的小鼠进行观察时，每月称体重1次，并记录体重数据，整个实验历时两年。
步骤六中，每次扫描实验组小鼠10只，扫描对照组小鼠3-5只，实验组小鼠每次扫描完成后，不立即处理掉小鼠，待其自然死亡。
步骤六中，对于濒死或已经死亡的小鼠，先进行胸部CT扫描后，再进行尸解病理学的检查，观察小鼠胸膜内是否已经诱发肿瘤。
步骤六中，对实验组和对照组的肿瘤诱发率、小鼠死亡率等数据进行实时记录并制定表格。
综上所述，实验组和对照组的小鼠体重在两年内的变化基本相同，当对实验组小鼠注射肿瘤细胞悬液的量为90μl时，实验组的小鼠存活率最高，最高约为83％，且在83％内的小鼠有80％的小鼠能成功诱发体内的肿瘤，可以进行医学观察和研究，证明了本发明的移植瘤方法可适用胸膜肿瘤的原位移植。可最大限度的还原胸膜肿瘤的生长方式、侵袭能力以及肿瘤转移效果，为研究中医藏象理论与胸膜的功能作用构建了一个良好的平台，且有效的避免了目前动物实验的胸膜间皮瘤成瘤方式主要以腋下或腹侧壁成瘤较为常见，但上述成瘤方式所形成的肿瘤无法模拟肿瘤在生长过程中对周围组织 (如：脏层胸膜、壁层胸膜、相邻肺组织)的损伤及侵袭效应的问题。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
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