一种基于gL蛋白检测IBR的间接ELISA的建立方法
阅读说明：本技术 一种基于gL蛋白检测IBR的间接ELISA的建立方法 (Establishment method of indirect ELISA (enzyme-Linked immuno sorbent assay) for detecting IBR (infectious bronchitis Virus) based on gL protein ) 是由 吴同垒 史秋梅 张志强 柳翠翠 付祥 白和平 周诗淼 刘勃兴 于 2021-07-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于gL蛋白检测IBR的间接ELISA的建立方法,属于生物工程技术领域。本发明公开的一种基于gL蛋白检测IBR的间接ELISA的建立方法,对传染性鼻气管炎病毒gL蛋白进行原核表达和纯化,作为包被抗原,建立了牛传染性鼻气管炎的间接ELISA检测方法。本发明方法具有良好的敏感性、特异性、重复性等,可以用于大规模临床样品检测,为牛传染病鼻气管炎疫苗免疫后的抗体水平检测和检疫防控提供了重要的技术手段。(The invention discloses a method for establishing indirect ELISA (enzyme-Linked immuno sorbent assay) for detecting IBR (immunoglobulin B receptor) based on gL protein, belonging to the technical field of biological engineering. The invention discloses an establishment method of indirect ELISA based on gL protein detection IBR, which is used for carrying out prokaryotic expression and purification on gL protein of infectious rhinotracheitis virus as a coating antigen and establishing an indirect ELISA detection method of infectious bovine rhinotracheitis. The method has good sensitivity, specificity, repeatability and the like, can be used for large-scale clinical sample detection, and provides an important technical means for antibody level detection and quarantine control after the bovine infectious disease rhinotracheitis vaccine is immunized.)
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，更具体的说是涉及一种基于gL蛋白检测IBR的间接ELISA的建立方法。
背景技术
牛传染性鼻气管炎病(Infections bovine rhinotracheitis,IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)引起的一种接触性传染病,临床上以严重的呼吸道感染，结膜炎，流产，外阴阴道炎，龟头炎等为主要特征。感染牛常呈现隐性感染，进而不断传染其他健康牛，在牛群免疫力低下或发生应激时，可发展为急性感染，造成大量经济损失，世界动物卫生组织(OIE)将该病列为B类疫病，也是我国进境动物必检疾病之一。近年来，国内关于牛发生IBR的报道迅速增加。分析其原因主要包括几个方面：一是牛繁育基地往往不是牛肉或牛奶产地，不同地区间牛运输频繁，二是从国外输入精液，胚胎、种牛等动物或动物产品时，存在漏检的情况，三是集约化养殖导致IBR的传播速度加快，阳性率增高。
有效控制牛传染性鼻气管炎病毒发生扩散的关键所在是建立快速准确的检测方法。针对IBR的检测往往采用iELISA方法，试剂盒多为进口，成本较高，国产试剂盒较少，供应量严重不足，且存在漏检等问题。IBRV属疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科，有囊膜，分子量大，编码70余种蛋白，其中，gL蛋白分子量约为17kDa，主要功能为介导病毒对宿主细胞的侵入和病毒在细胞间的扩散，可诱导产生抗体。
因此，提供一种基于gL蛋白检测IBR的间接ELISA的建立方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种基于gL蛋白检测IBR的间接ELISA(iELISA)的建立方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于gL蛋白检测IBR的间接ELISA的建立方法，具体步骤如下：
(1)制备IBRV重组gL蛋白，对蛋白进行纯化，获得纯化的蛋白；
(2)以步骤(1)获得的纯化的蛋白为包被抗原检测IBRV血清样本，同时确定抗原包被浓度、抗原包被条件、血清稀释度、封闭液种类、封闭条件、血清孵育时间、二抗稀释度、孵育条件及显色时间；
(3)确定间接ELISA的临界值：临界值＝平均值+2×标准差；平均值为阴性血清间接ELISA结果的平均值，标准差为阴性血清间接ELISA结果的标准差；间接ELISA结果判定标准：IBRV血清样本的OD值大于等于临界值判断为阳性，IBRV血清样本的OD值小于临界值判断为阴性；
(4)分析间接ELISA方法的特异性、敏感性和重复性。
进一步，步骤(1)所述制备IBRV重组gL蛋白的步骤如下：
1)PCR扩增gL基因；
2)构建重组质粒pET32a-gL；
3)将重组质粒pET32a-gL转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取单克隆进行PCR和双酶切验证，获得阳性克隆，提取pET32a-gL质粒，测序；
4)将pET32a-gL质粒转化大肠杆菌感受态BL21(DE3)中，利用IPTG诱导，纯化后获得重组gL蛋白；
5)利用SDS-PAGE和WesternBlot鉴定重组gL蛋白。
进一步，步骤1)PCR扩增所用引物序列如下：
gL-F：5’-GAGGATCCCTGGCGGCGCTGCTGTGGCTCC-3’；SEQ ID NO.1；BamHI；
gL-R：5’-ATGAATTCCTAGCGGTAGATGCCGTCGCC-3’；SEQ ID NO.2；EcoR I。
进一步，所述的基于gL蛋白检测IBR的间接ELISA方法在鉴别牛传染病鼻气管炎中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种基于gL蛋白检测IBR的间接ELISA的建立方法，在对gL蛋白原核表达的基础上，建立了检测牛传染性鼻气管炎血清抗体的iELISA方法，具有良好的敏感性、特异性、重复性等，可以用于大规模临床样品检测，为牛传染病鼻气管炎疫苗免疫后的抗体水平检测和检疫防控提供了重要的技术手段。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明重组蛋白的SDS-PAGE分析；
其中，M：蛋白质预染Marker；1：空载；2：纯化后的沉淀；3：上清；4：全菌；
图2附图为本发明重组蛋白的Westernblotting分析；
其中，1：空载2：gL蛋白；
图3附图为本发明阴性样品检测正态分布图；
图4附图为本发明敏感性试验结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
牛肾细胞(MDBK)、IBRV均由本试验室保存。E.coli DH5α感受态细胞和E.coliBL21感受态细胞，pET-32a质粒购自天根生化公司。限制性内切酶BamHI、EcoR I、T4连接酶，购自赛默飞公司；IPTG诱导剂、Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒、鼠源抗His标签单克隆抗体、HRP标记兔抗牛IgG抗体，购自康为世纪。IBRV阴阳性血清均购自中国兽医药品监察所，HRP标记的兔抗牛-IgG购自北京博奥森生物技术有限公司；牛血清白蛋白购自Biosharp，马血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司。检测的临床171份牛血清由本试验室保存，采自石家庄、唐山、承德、廊坊、滦县。牛传染性鼻气管炎、牛病毒性腹泻、牛布鲁氏菌病和牛O型口蹄疫病的阳性牛血清均由本试验室提供。牛传染性鼻气管炎病抗体检测试剂盒(gB)购自美国IDEXX。
实施例1重组真核表达质粒的构建及蛋白的表达纯化
(1)引物合计及合成
根据GenBank已登录的IBRV全基因组序列(NC_001847)，用Primer premier5.0软件设计IBRV gL蛋白相应引物，引物序列如下：
gL-F：5’-GAGGATCCCTGGCGGCGCTGCTGTGGCTCC-3’；SEQ ID NO.1；BamHI；
gL-R：5’-ATGAATTCCTAGCGGTAGATGCCGTCGCC-3’；SEQ ID NO.2；EcoR I；
引物合成服务由上海生工生物有限公司提供。
(2)重组真核表达质粒的构建及蛋白的表达纯化
以提取的IBRV DNA作为模板，通过PCR扩增gL基因，PCR反应体系为：2×PCR Mix25μL，模板DNA 1μL，gL-F 1μL，gL-R 1μL，去离子水22μL，共50μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50-62℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃终延伸10min。回收并纯化PCR产物，用BamHI、EcoR I对gL基因双酶切，克隆至pET-32a表达载体构建重组质粒pET32a-gL，转化E.coli DH5α感受态细胞，经菌落PCR鉴定后由生工生物工程(上海)有限公司测序鉴定。
其中，菌落PCR鉴定所用引物序列如下：
P1：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’；SEQ ID NO.3；
P2：5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’；SEQ ID NO.4。
经PCR鉴定验证后，阳性菌落扩大培养提取质粒进行双酶切验证，酶切后获得628bp的目的片段，与预期大小一致，测序结果显示无突变和移码，表明pET-32a-gL表达载体正确构建。
将pET32a-gL质粒转化大肠杆菌感受态BL21(DE3)中，经1mmol/L的IPTG诱导5h，离心，使用预冷的PBS洗涤菌泥，最后用合适体积PBS重悬后，经超声破碎，离心后收集上清和沉淀，分别加入蛋白上样缓冲液煮样后，进行SDS-PAGE和可溶性分析；经验证，蛋白获得表达，且表达形式为包涵体。超声破碎后的沉淀使用包涵体纯化(Ni-NTA)试剂盒进行亲和层析纯化，并进行SDS-PAGE分析纯化效果。
全菌蛋白加入蛋白上样缓冲液煮样，经SDS-PAGE和转膜，用标准阳性血清(1:100稀释)为一抗，HRP标记的兔抗牛IgG(1:5000稀释)为二抗进行WesternBlot检测。
SDS-PAGE结果(图1)显示得到37ku的蛋白条带，与预期大小相符，同时获得了纯化蛋白，成功获得了重组gL蛋白。Westernblot鉴定结果(图2)显示，原核表达的重组gL蛋白能够与IBR阳性血清发生反应，可用于iELISA方法的建立。
实施例2间接ELISA方法的优化及建立
取IBRV阳性血清和阴性血清，以纯化的重组gL蛋白作为抗原建立iELISA方法，检测IBRV血清抗体样品。在此过程中，确定最佳抗原包被浓度、抗原包被条件、血清稀释度、封闭液的种类、封闭条件、血清孵育时间、二抗稀释度、孵育条件及显色时间。测定样品OD450nm值。最佳条件判定标准为阳性OD值/阴性OD值(P/N值)最高，阳性血清OD450nm≥1，阴性血清OD450nm较小的值，所对应的条件作为iELISA最佳条件。
最佳条件如下：抗原包被浓度为0.773μg/mL，4℃包被过夜；用3％BSA作为封闭液，37℃封闭1h；血清稀释度为1:20，室温孵育30min。兔抗牛IgG-HRP二抗稀释度1:5000，37℃孵育30min，TMB 37℃显色5min后终止反应。
实施例3间接ELISA临界值的确定
随机选择30份阴性血清用来确定间接ELISA方法的临界值。按实施例2的间接ELISA方法检测该阴性血清，测定OD450nm值并计算平均值和标准差。临界值的计算公式为：临界值＝平均值+2x标准差。
根据测得的OD450nm值计算30份血清的平均值和标准差，平均值为0.2101，标准差为0.1562，即临界值＝0.5225；即本发明建立的基于gL蛋白的间接ELISA方法，OD450nm值大于等于0.5225即可判为阳性，小于0.5225则为阴性。结果如图3所示。
实施例4间接ELISA特异性试验
用已建立的间接ELISA方法对牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻、牛布鲁氏菌病和牛口蹄疫病毒O型阳性牛血清进行检测，确定该方法的特异性。
结果显示IBRV阳性血清检测结果为阳性，其余检测结果均为阴性。表明该方法具有较强的特异性，仅对IBRV阳性血清有良好的反应，而对其他血清无反应。
实施例5间接ELISA敏感性试验
将IBRV阳性血清按2倍倍比稀释1:20～1:2560，按照实施例2的条件进行iELISA试验检测，确定该方法的敏感性。
检测经1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560等梯度稀释IBRV阳性血清，结果见图4。图4结果显示，阳性血清经最高稀释度为1:640稀释后检测结果仍为阳性，表明该方法具有较高的敏感性。
实施例6间接ELISA重复性试验
对两种不同批次的酶标板进行包被，随机选取4份阴阳性血清样品稀释后用筛选出的优化条件对其进行检测，每组设置3个平行重复，测定的OD450nm进行统计，计算变异系数，评价该间接ELISA方法的批内、批间重复性。
用两种不同批次的酶标条包被抗原检测4份阴性血清样品(Negative1-4)和4份阳性血清样品(Positive1-4)，计算变异系数：阴性血清样品批内变异系数为1.9％～6.2％，批间变异系数为2.6％～4.0％，阳性血清样品批内变异系数为2.9％～7.7％，批间变异系数为2.7％～4.6％(表1)。结果表明该方法的重复性较好。
表1重组蛋白gL重复性试验
实施例7间接ELISA临床样品检测
用本发明建立的IBRV间接ELISA方法对本试验室保存的171份血清进行检测，并分析IBRV抗体总阳性率。
采自河北省内的171份血清，其中阳性70份，阴性101份；用本发明建立的iELISA方法进行检测，结果见表2，本发明建立的检测方法检测出阳性血清71份，阴性血清100份，阳性检出率为97.14％(68/70，即本发明建立的iELISA方法检测阳性样品为阳性的血清数，除以总的阳性血清数)，阴性检出率为97.03％(98/101，即本发明建立的iELISA方法检测阴性样品为阴性的血清数，除以总的阴性血清数)；IDEXX试剂盒检出阳性血清69份，阴性血清102份，阳性检测率为92.86％，阴性检出率为96.04％。结果表明本发明建立的检测方法具有较高的准确性。
表2临床样品检测结果
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 河北科技师范学院
<120> 一种基于gL蛋白检测IBR的间接ELISA的建立方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gaggatccct ggcggcgctg ctgtggctcc 30
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atgaattcct agcggtagat gccgtcgcc 29
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
taatacgact cactataggg 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gctagttatt gctcagcgg 19