具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。

需要说明的是，当元件被称为“固定于”或“设置于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“上”、“下”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的，并不表示是唯一的实施方式。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本申请实施例提供一种检测新冠抗原的胶体金层析试剂条10，以解决现有的传统的层析试纸需要配套专业仪器读取荧光强度转化成信号值、抗体结合能力并不突出致病毒抗原漏检的问题。以下将结合附图对进行说明。

本申请实施例提供的检测新冠抗原的胶体金层析试剂条10，示例性的，请参阅图1，图1为本申请实施例提供的检测新冠抗原的胶体金层析试剂条10的结构示意图。本申请的检测新冠抗原的胶体金层析试剂条10能够用于检测新冠病毒抗原。

为了更清楚的说明检测新冠抗原的胶体金层析试剂条10的结构，以下将结合附图对检测新冠抗原的胶体金层析试剂条10进行介绍。

示例性的，请参阅图1所示，图1为本申请实施例提供的检测新冠抗原的胶体金层析试剂条10的结构示意图。一种检测新冠抗原的胶体金层析试剂条10，包括底板101、硝酸纤维素膜102、耦合垫103、样品垫104和吸水纸105，样品垫104、耦合垫103、硝酸纤维素膜102和吸水纸105沿着水平方向顺序连接在底板101上，耦合垫103上耦合有亲和素生物素放大的胶体金纳米花，硝酸纤维素膜102经过纳米纤维素修饰，硝酸纤维素膜102上设有包被新冠抗原捕获抗体的检测线1021和包被质控分子捕获抗体的质控线1022，检测线1021与质控线1022沿着层析方向顺序分布。

在其中一些实施例中，底板101可以是PVC底板。

在其中一些实施例中，耦合垫103与吸水纸105分别位于硝酸纤维素膜102的两侧且均部分搭接硝酸纤维素膜102，样品垫104部分搭接耦合垫。

在其中一些实施例中，请参阅图2所示，检测新冠抗原的胶体金层析试剂条10还包括壳体106。壳体106具有容置腔以及与容置腔相通的检测窗口1061、加样孔1062，底板101、硝酸纤维素膜102、耦合垫103、样品垫104和吸水纸105均设置于容置腔内，检测线1021与质控线1022位于检测窗口1061处，样品垫104部分位置位于加样孔1062处。

在其中一些实施例中，请参阅图2所示，壳体106的外表面设置有分别与检测线1021、质控线1022对应的检测标识区1063、质控标识区1064。

在其中一些实施例中，请参阅图2所示，加样孔1062由朝外的一端至朝内的一端逐渐收窄。

上述检测新冠抗原的胶体金层析试剂条10，能够便捷、快速、高灵敏度的检测出鼻咽拭、咽拭子的新冠抗原。上述检测新冠抗原的胶体金层析试剂条10综合使用胶体金纳米花、亲和素生物素放大系统、纳米纤维素修饰硝酸纤维素膜102的三重放大信号，提高了检测的敏感度和稳定性，从而减少新冠病原体的漏检现象。

本发明另一实施例提供了一种检测新冠抗原的胶体金层析试剂条10的制备方法。

一种的检测新冠抗原的胶体金层析试剂条10的制备方法，包括如下步骤：

a)胶体金颗粒溶液制备：将HAuCl₄在智能磁力搅拌器中边搅拌边加热到120℃，加入1/20～1/4体积的柠檬酸钠(使得柠檬酸钠加入的量为1wt％)，继续加热10～30min，直至溶液颜色稳定呈现为红宝石色，可认为稳定的胶体金颗粒已经产生，冷却至室温后2℃～8℃保存。

b)胶体金纳米花溶液制备：将步骤a)制备的胶体金颗粒溶液加入到60～100倍体积的纯化水中，加热到60℃～80℃后添加HAuCl₄(使得HAuCl₄加入的量为1wt％)、柠檬酸钠(使得柠檬酸钠加入的量为1wt％)以及氢醌溶液，室温下连续搅拌，以9000～13000rpm的速度离心10～30min后去除上清液，收集合成的胶体金纳米花溶液，2℃～8℃保存。

c)胶体金标链霉亲和素的制备：取步骤b)制备的胶体金纳米花溶液并调整pH值至9～10、浓度至0.01-0.05wt％，加入链霉亲和素溶液，链霉亲和素溶液的浓度为10-15mg/mL，链霉亲和素溶液与胶体金溶液的添加量满足：两者混合后，链霉亲和素溶液的终浓度为10～80μg/mL，振荡反应5～30min，加入BSA，BSA的终浓度为1-2wt％，振荡5～30min，离心后去除上清液，得到胶体金标链霉亲和素，用金标稀释液复溶备用。

d)生物素化新冠病毒抗原标记抗体和生物素化质控分子抗体的制备：分别将标记抗体和质控抗体采用缓冲液稀释至0.5～2mg/mL，分别透析得到新冠病毒抗原标记抗体溶液和质控分子捕获抗体溶液，分别加入浓度为0.5～2mg/mL生物素溶液室温反应1～6h后，分别加入浓度为0.5～2mol/LNH₄Cl溶液后室温搅拌反应5～30min，分别透析、过柱纯化，得到生物素化新冠病毒抗原标记抗体和生物素化质控分子抗体。

e)胶体金标记链霉素-生物素化新冠病毒抗原标记抗体及胶体金标记链霉素-生物素化质控分子抗体的制备：取步骤d)制得的生物素化新冠病毒抗原标记抗体和生物素化质控分子抗体，分别与步骤c)所制得的胶体金标链霉亲和素混合振荡反应10～30min，离心后去除上清液，分别得到胶体金标记链霉素-生物素化新冠病毒抗原标记抗体和胶体金标记链霉素-生物素化质控分子抗体，分别用金标稀释液复溶备用。

f)偶合垫的制备：用偶合物稀释液稀释步骤e)制备得到的胶体金标记链霉素-生物素化新冠病毒抗原标记抗体和胶体金标记链霉素-生物素化质控分子抗体制成偶合物处理液，其中，胶体金标记链霉素-生物素化新冠病毒抗原标记抗体的体积占比为18-20％，胶体金标记链霉素-生物素化质控分子抗体的体积占比为20-25％，用偶合物处理液均匀涂布于偶合垫，涂布方式通常采用机器喷涂、手工涂布等方式。

g)：制备硝酸纤维素膜102：将纳米纤维素凝胶(纳米纤维素凝胶加入的量为0.92wt％)稀释至浓度为0.1wt％～0.5wt％后通过滑膜机划线于硝酸纤维素膜102上形成检测线1021、质控线1022，45℃干燥12小时，将新冠抗原捕获抗体和质控分子捕获抗体分别用NC膜包被液稀释到1～3mg/mL、0.1～2mg/mL后通过滑膜机划线于检测线1021、质控线1022处，45℃干燥72个小时。

h)样品垫104的制备：将样品垫104处理液均匀涂抹于样品垫104。

i)试剂条的组装：按照上述的试剂条的结构组装，对组装后的试剂条切割至2～4mm/条，并分别装入壳体106。

本发明另一实施例提供了一种新冠抗原检测试剂盒。

一种新冠抗原检测试剂盒，包括病毒裂解液以及的胶体金层析试剂条或者的制备方法制备得到的胶体金层析试剂条。

实施例1

本实施例提供了一种检测新冠抗原的胶体金层析试剂条10，其制备方法包括如下步骤：

a)胶体金颗粒溶液制备：将HAuCl₄在智能磁力搅拌器中边搅拌边加热到120℃，加入1/10体积的柠檬酸钠(1wt％)，继续加热20min，直至溶液颜色稳定呈现为红宝石色，可认为稳定的胶体金颗粒已经产生，冷却至室温后4℃保存。

b)胶体金纳米花溶液制备：将步骤a)制备的胶体金颗粒溶液加入到80倍体积的纯化水中，加热到60℃后添加HAuCl₄(1wt％)、柠檬酸钠(1wt％)以及氢醌溶液，室温下连续搅拌，以10000rpm的速度离心20min后去除上清液，收集合成的胶体金纳米花溶液，4℃保存。

c)胶体金标链霉亲和素的制备：取步骤b)制备的胶体金纳米花溶液并调整pH值至9～10、浓度至0.01wt％，加入链霉亲和素溶液，两者混合后，链霉亲和素溶液的终浓度为10～80μg/mL。振荡反应20min，加入BSA，BSA的终浓度为1wt％，振荡20min，离心后去除上清液，得到胶体金标链霉亲和素，用金标稀释液复溶备用。

d)生物素化新冠病毒抗原标记抗体和生物素化质控分子抗体的制备：分别将标记抗体和质控抗体采用缓冲液稀释至1mg/mL，分别透析得到新冠病毒抗原标记抗体溶液和质控分子捕获抗体溶液，分别加入浓度为1mg/mL生物素溶液室温反应4h后，分别加入浓度为1mol/L NH₄Cl溶液后室温搅拌反应20min，分别透析、过柱纯化，得到生物素化新冠病毒抗原标记抗体和生物素化质控分子抗体。

e)胶体金标记链霉素-生物素化新冠病毒抗原标记抗体及胶体金标记链霉素-生物素化质控分子抗体的制备：取步骤d)制得的生物素化新冠病毒抗原标记抗体和生物素化质控分子抗体，分别与步骤c)所制得的胶体金标链霉亲和素混合振荡反应20min，离心后去除上清液，分别得到胶体金标记链霉素-生物素化新冠病毒抗原标记抗体和胶体金标记链霉素-生物素化质控分子抗体，分别用金标稀释液复溶备用。

f)偶合垫的制备：用偶合物稀释液稀释步骤e)制备得到的胶体金标记链霉素-生物素化新冠病毒抗原标记抗体和胶体金标记链霉素-生物素化质控分子抗体制成偶合物处理液，其中，胶体金标记链霉素-生物素化新冠病毒抗原标记抗体的体积占比为18％，胶体金标记链霉素-生物素化质控分子抗体的体积占比为20％，用偶合物处理液手工均匀涂布于偶合垫。

g)：制备硝酸纤维素膜102：将纳米纤维素凝胶(0.92wt％)稀释至浓度为0.5wt％后通过滑膜机划线于硝酸纤维素膜102上形成检测线1021、质控线1022，45℃干燥12小时，将新冠抗原捕获抗体和质控分子捕获抗体分别用NC膜包被液稀释到2mg/mL、1mg/mL后通过滑膜机划线于检测线1021、质控线1022处，45℃干燥72个小时。

h)样品垫104的制备：将样品垫104处理液均匀涂抹于样品垫104。

i)试剂条的组装：按照上述的试剂条的结构组装，对组装后的试剂条切割至4mm/条，并分别装入壳体106，得到检测新冠抗原的胶体金层析试剂条10。

实施例2

本实施例利用实施例1制备得到的检测新冠抗原的胶体金层析试剂条10对新鲜样本中新冠病毒抗原进行快速检测并和PCR结果匹配，以评估检测新冠抗原的胶体金层析试剂条10的灵敏度及特异性。

通过在3个不同地点对514份新鲜鼻咽拭子分别进行检测，其结果与PCR结果进行对比。将鼻咽拭子添加到450μL的病毒裂解液中，上下旋转挤压3-10次，待充分裂解后取80μL加入到检测新冠抗原的胶体金层析试剂条10的加样孔1062中，大约3滴，等待15min后，观测检验结果，检验结果如表1所示，由表1可知，其匹配结果为，敏感度为96.49％；特异度为99.25％，准确度为98.6％。

表1

实施例3

本实施例利用实施例1制备得到的检测新冠抗原的胶体金层析试剂条10对新冠病毒培养物进行快速检测，以评估检测新冠抗原的胶体金层析试剂条10的最低检测限。

样本：灭活病毒培养物(ATCC)，浓度为1.6×10⁵TCID₅₀/mL，用正常健康人群的鼻咽拭子洗脱液进行梯度稀释，先10倍稀释，测试出阴性结果后，再从上一浓度进行2倍稀释。选择20次测试结果中不少于19阳性结果的浓度水平作为测试的最低检测限。

结果：进行热灭活病毒培养物梯度稀释测试，浓度为2.0×10²TCID₅₀/mL，检测结果都为阳性，故实施例1制备得到的检测新冠抗原的胶体金层析试剂条10的最低检测限位2.0×10²TCID₅₀/mL。不同浓度培养物的显色如图2所示，浓度分别为1.6×10³TCID₅₀/mL、8.0×10²TCID₅₀/mL、4.0×10²TCID₅₀/mL、2.0×10²TCID₅₀/mL、1.0×10²TCID₅₀/mL。

实施例4

本实施例利用实施例1制备得到的检测新冠抗原的胶体金层析试剂条10对新冠病毒培养物配置的样本进行快速检测，以评估检测新冠抗原的胶体金层析试剂条10的抗干扰能力。

方法：用阴性样本将细胞培养新型冠状病毒液稀释成2×LoD浓度水平作为基础样本。将收集的各菌株、病毒培养物原液，用阴性样本进行稀释，配制相应浓度的交叉样本。将收集的各菌株、病毒培养物原液，用基础样本进行稀释，配制相应浓度的干扰样本。将阴性样本用基础样本进行稀释，配制相应浓度的对照样本。通过对交叉样本、干扰样本、对照样本进行检测。

结果表明：当样本中的人类冠状病毒229E、人类冠状病毒OC43、人类冠状病毒HKU1、人类冠状病毒NL63、腺病毒、副流感病毒、甲型流感病毒H1N1、甲型流感病毒H3N2、乙型流感病毒、肠道病毒、呼吸道合胞病毒≤105TCID₅₀/mL，鼻病毒的浓度≤10⁵PFU/mL，肺炎支原体的浓度≤10⁶CFU/mL时，交叉样本检测结果均满足检测标准，无交叉反应。干扰样本检测结果均满足检测标准，SARS-CoV-2与其他微生物(包括各种微生物、病毒和阴性基质)一起存在于标本中时，不会出现假阴性。干扰样本及对应的干扰浓度具体结果如下表2所示。

表2

综上，本发明的检测新冠抗原的胶体金层析试剂条10中，胶体金纳米花具有更大的空间表面积，可以更加充分的和偶联抗体发生电荷吸附，从而提升检测的灵敏度和结果的稳定性，且胶体金纳米花表面具有尖端分级花状构表现出强的光信号敏感性，可以在自然光下色彩感更明显便于肉眼识别；本发明通过亲和素生物素信号放大系统可以获得更多抗原抗体结合表位；本发明通过将纳米纤维素凝胶预涂在检测线1021附近，填充硝酸纤维素膜102上的微孔，使之后包被的捕获抗体更多的附着于硝酸纤维素膜102表面，从而使后期捕获的胶体金纳米颗粒更多地停留在硝酸纤维素膜102表面而增强显色效果，增强肉眼可视效果。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。