一种氟虫腈半抗原及其合成方法、人工抗原、抗体和用途
阅读说明：本技术 一种氟虫腈半抗原及其合成方法、人工抗原、抗体和用途 (Fipronil hapten, synthetic method thereof, artificial antigen, antibody and application ) 是由 冯艳武 卫大群 郭志雄 葛怀娜 韦吉杨 仇雅婷 孙惠洁 于 2021-10-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种氟虫腈半抗原及其合成方法、人工抗原、抗体和用途,属于生物化工技术领域。本发明提供了一种氟虫腈半抗原,其合成方法包括以下步骤：S1.将氟虫腈结构类似物与氯甲酸苯酯反应,合成中间体I；S2.将所述中间体I与氨基丙酸叔丁酯反应,合成中间体II；S3.将所述中间体II在酸性条件下脱叔丁基,合成氟虫腈半抗原。本发明合成的人工抗原能够最大程度地保留氟虫腈的基本结构,能够用于制备较高特异性与灵敏度的抗体,将制备的抗体用于酶联免疫试剂盒检测氟虫腈时,具有特异性好、灵敏度和精密度高的优点。(The invention discloses a fipronil hapten, a synthetic method thereof, an artificial antigen, an antibody and application, and belongs to the technical field of biochemical engineering. The invention provides a fipronil hapten, and a synthetic method thereof comprises the following steps: s1, reacting fipronil structural analogues with phenyl chloroformate to synthesize an intermediate I; s2, reacting the intermediate I with tert-butyl aminopropionate to synthesize an intermediate II; and S3, removing tert-butyl from the intermediate II under an acidic condition to synthesize the fipronil hapten. The artificial antigen synthesized by the invention can furthest reserve the basic structure of fipronil, can be used for preparing antibodies with higher specificity and sensitivity, and has the advantages of good specificity, high sensitivity and high precision when the prepared antibodies are used for detecting the fipronil by an enzyme linked immunosorbent assay kit.)
技术领域
本发明是一种氟虫腈半抗原及其合成方法、人工抗原、抗体和用途，属于生物化工技术领域。
背景技术
氟虫腈，商品名锐劲特，是一种苯基吡唑类杀虫剂、杀虫谱广，对害虫以胃毒作用为主，兼有触杀和一定的内吸作用，其作用机制在于阻碍昆虫γ-氨基丁酸控制的氯化物代谢，因此对蚜虫、叶蝉、飞虱、鳞翅目幼虫、蝇类和鞘翅目等重要害虫有很高的杀虫活性，对作物无药害。该药剂可施于土壤，也可叶面喷雾。施于土壤能有效防治玉米根叶甲、金针虫和地老虎。叶面喷洒时，对小菜蛾、菜粉蝶、稻蓟马等均有高水平防效，且持效期长。
虽然氟虫腈防治害虫效果很好，但是其对环境极其不友好，会对农作物周围的蝴蝶、蜻蜓等造成影响，对鱼、虾、蜜蜂、家蚕高毒。并且现有动物实验研究表明，短期摄取大量氟虫腈会对神经系统造成不良影响，长期摄取氟虫腈可能会损害肝脏、甲状腺和肾脏。因此我国规定2009年10月1日起禁用氟虫腈，目前仅可用于家庭卫生害虫。
氟虫腈是一种生态环境毒副作用较大的农药，需要对其进行严格的监控。影响政府监管或管理效果最重要的因素是对氟虫腈的检测手段，目前氟虫腈的检测还主要是针对蔬菜、环境中的杀虫剂氟虫腈检测，方法主要有高效液相法和液相色谱质联用法，这些方法特异性强、灵敏度高，但是操作繁琐、仪器昂贵，不适用于大批量样品的筛选检测。免疫检测法在抗原抗体的定性定量方面具有独特的优势，其操作简便快速、成本低、分析样本量大。
CN101100456A公开了氟虫腈人工半抗原及合成方法、抗原和抗体及用途，将制备的氟虫腈抗原制备用于ELISA方法检测时，氟虫腈的最低检测限可达7.6μg/L，批内平均变异系数为4.6%，乙硫氟虫腈的交叉反应率为6.4%，氟虫脲的交叉反应率为0.44%。
CN101100457A公开了氟虫腈半抗原化合物、合成方法及其用途，将制备的抗原用于ELISA方法检测时，氟虫腈的最低检测限可达4.8μg/L。
CN101100486A公开了氟虫腈人工抗原、抗体及其用途，将制备的氟虫腈人工抗原用于ELISA方法检测时，氟虫腈的最低检测限为4.8μg/L，批内平均变异系数为5.7%，乙硫氟虫腈的交叉反应率为3.2%，氟虫脲的交叉反应率为0.13%。
利用上述方法制备的氟虫腈半抗原或氟虫腈人工抗原用于ELISA方法检测氟虫腈时，其灵敏度、特异性和精密度仍有待提高。
发明内容
针对现有技术存在不足，本发明的目的是提供一种氟虫腈半抗原及其合成方法、人工抗原、抗体和用途，所合成的氟虫腈半抗原能够最大程度地保留氟虫腈的基本结构，能够用于制备较高特异性与灵敏度的抗体，将制备的抗体用于酶联免疫试剂盒检测氟虫腈时，具有特异性好、灵敏度和精密度高的优点。
为了上述目的，本发明提供了一种氟虫腈半抗原，氟虫腈半抗原的结构式为：
。
本发明还提供了上述氟虫腈半抗原的合成方法，包括以下步骤：
S1.将氟虫腈结构类似物与氯甲酸苯酯反应，合成中间体I，所述中间体I的结构式如下所示：
；
S2.将所述中间体I与氨基丙酸叔丁酯反应，合成中间体II，所述中间体II的结构式如下所示：
；
S3.将所述中间体II在酸性条件下脱叔丁基，得到氟虫腈半抗原。
优选的，步骤S1中，所述氟虫腈结构类似物与氯甲酸苯酯在丙酮中反应，反应温度为0℃-40℃，氟虫腈结构类似物与氯甲酸苯酯投料摩尔比为1:1.0-1.2。
优选的，步骤S2中，还加入有DBU和三乙胺。
优选的，步骤S2中，所述中间体II、氨基丙酸叔丁酯、DBU、三乙胺的投料摩尔比为1:5:0.1:10，反应溶剂为四氢呋喃，反应温度50℃-80℃。
优选的，步骤S3具体为，将所述中间体II溶于二氯甲烷，然后加入三氟乙酸，室温反应脱叔丁基得到氟虫腈半抗原。
优选的，步骤S3中，每mmol中间体II中加入10-20mL三氟乙酸和10-20mL二氯甲烷。
本发明还提供了一种氟虫腈人工抗原，利用上述的氟虫腈半抗原与载体蛋白偶联得到，或利用上述合成方法合成的氟虫腈半抗原与载体蛋白偶联得到，氟虫腈人工抗原的结构式为：
其中为载体蛋白。
优选的，所述载体蛋白为牛血清蛋白，鸡卵血清蛋白、血蓝蛋白中的一种或几种。
本发明还提供了一种氟虫腈人工抗原的合成方法，将氟虫腈半抗原用DMF溶解，加入NHS、EDC盐酸盐，室温反应16-24h，得到氟虫腈半抗原活性酯溶液；称取载体蛋白溶于硼酸盐缓冲溶液中，将上述氟虫腈半抗原活性酯溶液缓慢滴入，室温反应5-24h后透析，得到氟虫腈人工抗原；
或者，将氟虫腈半抗原用DMF溶解，加入正丁胺、氯甲酸异丁酯反应，得到氟虫腈半抗原的活性混合酸酐溶液；称取载体蛋白溶于硼酸盐缓冲溶液中，将上述氟虫腈半抗原的活性混合酸酐溶液缓慢滴入，室温反应5-24h后透析，得到氟虫腈人工抗原。
优选的，所述氟虫腈半抗原与NHS、EDC盐酸盐的摩尔比为1:1.0-2.0:1.0-2.0，所述氟虫腈半抗原与正丁胺、氯甲酸异丁酯的摩尔比为1:1.2:1.2，反应时间为1h。
本发明还提供一种氟虫腈特异性抗体，利用上述的氟虫腈人工抗原免疫动物所得到的，能与氟虫腈发生特异免疫反应的单克隆或多克隆抗体。
本发明还提供一种氟虫腈半抗原的用途，利用上述的氟虫腈半抗原，或利用上述合成方法合成的氟虫腈半抗原在氟虫腈残留量检测中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明所合成的氟虫腈半抗原能够最大程度地保留氟虫腈的基本结构，并且合成纯度较高。
（2）本发明合成的人工抗原能够用于制备较高特异性与灵敏度的抗体，将制备的抗体用于酶联免疫试剂盒检测氟虫腈时，具有特异性好、灵敏度和精密度高的优点，能够对氟虫腈进行快速检测。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
以下实施例描述了一种氟虫腈半抗原和氟虫腈人工抗原的合成方法，氟虫腈半抗原的合成路线如下所示：
氟虫腈人工抗原的合成路线如下所示：
实施例1
一种氟虫腈半抗原的合成方法，包括以下步骤：
S1.将氟虫腈结构类似物与氯甲酸苯酯反应，合成中间体I，具体为：
称取4.37g氟虫腈结构类似物溶于丙酮中，冰浴降温，缓慢滴加1.88g氯甲酸苯酯，完毕，升至25℃反应过夜。将反应液浓缩，得到[5-氰基-2-（2,6-二氯-4-三氟甲基-苯基）-4-甲亚砜基-2H-吡唑-3-基]-氨基甲酸苯酯（中间体I）。该中间体I可不经纯化，直接进行下步反应。
S2.将所述中间体I与氨基丙酸叔丁酯反应，合成中间体II，具体为：
将0.50g中间体I溶于30mL四氢呋喃中，依次加入0.01g DBU（1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯），1.21mL三乙胺，0.73g 3-氨基丙酸叔丁酯，反应液升温至65℃反应12h，降至室温，真空浓缩除去四氢呋喃，30mL乙酸乙酯和30mL水分液，水相用乙酸乙酯30mL萃取3次，合并有机相，用30mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，残余物上样硅胶柱层析（体积比乙酸乙酯:石油醚=1:2），得到3-{3-[5-氰基-2-(2,6-二氯-4-三氟甲基-苯基)-4-甲亚砜基-2H-吡唑-3-基]-脲基}-丙酸叔丁酯（中间体II）。
S3.将所述中间体II在酸性条件下脱叔丁基，合成氟虫腈半抗原，具体为：
称取0.55g中间体II溶于20mL二氯甲烷中，加入20mL三氟乙酸室温搅拌2h，反应液浓缩，残余物上样硅胶柱层析（体积比甲醇:二氯甲烷＝1:20），得到白色固体3-{3-[5-氰基-2-(2,6-二氯-4-三氟甲基-苯基)-4-甲亚砜基-2H-吡唑-3-基]-脲基}-丙酸（氟虫腈半抗原），合成的氟虫腈半抗原的纯度为99.9%。
一种氟虫腈人工抗原的合成方法，具体为：
称取氟虫腈半抗原10mg溶于200μL DMF中，加入7.7mg EDC盐酸盐，2.8mg NHS，室温搅拌16h得活性酯溶液。称取50mg BSA溶于4mL 硼酸盐缓冲溶液中，将活性酯溶液滴入BSA溶液中，室温反应15h。透析3天，完成后取出透析液，冻干得氟虫腈BSA人工抗原，-40℃保存。
实施例2
具体同实施例1，所不同的是：
合成氟虫腈半抗原时，步骤S1中，称取4.40g氟虫腈结构类似物溶于丙酮中，冰浴降温，缓慢滴加1.73g氯甲酸苯酯，完毕，升至40℃反应过夜。
合成氟虫腈半抗原时，步骤S2中，将0.50g中间体I溶于30mL四氢呋喃中，依次加入0.01g DBU，1.21mL三乙胺，0.73g 3-氨基丙酸叔丁酯，反应液升温至50℃反应12h。
合成氟虫腈半抗原时，步骤S3中，称取0.55g中间体II溶于10mL二氯甲烷中，加入10mL三氟乙酸室温搅拌2h。合成的氟虫腈半抗原的纯度为99.6%。
合成氟虫腈人工抗原时，称取氟虫腈半抗原10mg溶于200μL DMF中，加入7.7mgEDC盐酸盐，2.8mg NHS，室温搅拌20h得活性酯溶液。称取50mg BSA溶于4mL 硼酸盐缓冲溶液中，将活性酯溶液滴入BSA溶液中，室温反应24h。
实施例3
具体同实施例1，所不同的是：
合成氟虫腈半抗原时，步骤S1中，称取4.50g氟虫腈结构类似物溶于丙酮中，冰浴降温，缓慢滴加1.61g氯甲酸苯酯，完毕，0℃反应过夜。
合成氟虫腈半抗原时，步骤S2中，将0.50g中间体I溶于30mL四氢呋喃中，依次加入0.01g DBU，1.21mL三乙胺，0.73g 3-氨基丙酸叔丁酯，反应液升温至80℃反应12h。
合成氟虫腈半抗原时，步骤S3中，称取0.55g中间体II溶于15mL二氯甲烷中，加入15mL三氟乙酸室温搅拌2h。合成的氟虫腈半抗原的纯度为99.7%。
合成氟虫腈人工抗原时，称取氟虫腈半抗原10mg溶于200μL DMF中，加入7.7mgEDC盐酸盐，2.8mg NHS，室温搅拌24h得活性酯溶液。称取50mg BSA溶于4mL 硼酸盐缓冲溶液中，将活性酯溶液滴入BSA溶液中，室温反应5h。
实施例4
具体同实施例1，所不同的是：
合成氟虫腈人工抗原时，称取氟虫腈半抗原10mg溶于200μL DMF中，加入7.7mgEDC盐酸盐，2.8mg NHS，室温搅拌过夜得活性酯溶液。称取100mg BSA溶于8mL 硼酸盐缓冲溶液中，将活性酯溶液滴入BSA溶液中，室温过夜。透析3天，完成后取出透析液，冻干得到氟虫腈BSA人工抗原，-40℃保存。
实施例5
具体同实施例1，所不同的是：
合成氟虫腈人工抗原时，称取氟虫腈半抗原10mg溶于200μL DMF中，加入7.7mgEDC盐酸盐，2.8mg NHS，室温搅拌过夜得活性酯溶液。称取20mg BSA溶于1mL 硼酸盐缓冲溶液中，将活性酯溶液滴入BSA溶液中，室温过夜。透析3天，完成后取出透析液，冻干得到氟虫腈BSA人工抗原，-40℃保存。
实施例6
具体同实施例1，所不同的是：
合成氟虫腈人工抗原时，称取10mg半抗原溶于200μLDMF中，冰浴冷却，然后加入5.2μL正丁胺，在加入2.9μL氯甲酸异丁酯，继续冰浴反应1h得氟虫腈半抗原活性酸酐溶液。称取10mg OVA溶于1mL硼酸盐缓冲溶液中（PH=8.7），将半抗原活性酸酐溶液缓慢滴入OVA蛋白缓冲溶液中。完毕，室温避光反应4h，反应液于4℃冰箱透析三天，得到氟虫腈OVA人工抗原。
实施例7
具体同实施例1，所不同的是：
合成氟虫腈人工抗原时，称取10mg半抗原溶于200μL DMF中，冰浴冷却，然后加入5.2μL正丁胺，在加入2.9μL氯甲酸异丁酯，继续冰浴反应1h得氟虫腈半抗原活性酸酐溶液。称取50mg BSA溶于4mL硼酸盐缓冲溶液中（PH=8.7）中，将半抗原活性酸酐溶液缓慢滴入BSA蛋白缓冲溶液中。完毕，室温避光反应4h，反应液于4℃冰箱透析三天，得到氟虫腈BSA人工抗原。
对比例1
采用公告号为CN101100456A的专利中实施例2的方法制备的氟虫腈人工抗原。
对比例2
采用公告号为CN101100457A的专利中实施例4的方法制备的氟虫腈人工抗原。
对比例3
采用公告号为CN101100486A的专利中实施例1的方法制备的氟虫腈人工抗原。
试验例1 制备用于检测氟虫腈的酶联免疫试剂盒
a）氟虫腈单克隆抗体制备
动物免疫：将实施例1-7和对比例1-3得到的氟虫腈人工抗原注入到Balb/c（8周）小鼠体内，免疫剂量为100μg/只，使其产生抗血清。
细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌氟虫腈单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
细胞冻存和复苏：将单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×106个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
单克隆抗体的生产与纯化：采用动物体内诱生单克隆抗体方法，7天后采集腹水。用protein G纯化柱进行腹水纯化，-20℃保存。
b）酶标二抗的制备
以山羊作为免疫动物，以氟虫腈单克隆抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到氟虫腈抗抗体。将氟虫腈抗抗体与辣根过氧化物酶（HRP）进行偶联得到酶标二抗。
c）酶标板的制备
用包被缓冲液（pH为9.6碳酸盐）将包被原稀释成1μg/mL，每孔加入100μL，4℃避光孵育16h，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤1次，静置30s，拍干，然后在每孔中加入200μL封闭液，37℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。
d）检测氟虫腈的酶联免疫试剂盒的组建
组建检测氟虫腈的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：
1）包被氟虫腈偶联抗原的酶标板；
2）氟虫腈标准品浓缩液溶液6瓶（浓缩液溶剂甲醇），浓度分别为0μg/L，5μg/L，15μg/L，45μg/L，135μg/L，405μg/L，使用时用0.02mol磷酸盐缓冲液（pH值为7.2）以9:1体积比稀释成标准品溶液，稀释后浓度分别为0μg/L，0.5μg/L，1.5μg/L，4.5μg/L，13.5μg/L，40.5μg/L；
3）辣根过氧化物酶标记的氟虫腈抗抗体；
4）底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；
5）终止液为2mol/L硫酸；
6）洗涤液为pH值为7.2，含有0.01％吐温-20、3g/L叠氮化钠防腐剂、0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；
7）复溶液为pH值为7.0、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。
试验例2 氟虫腈试剂盒特异性检测
分别配置乙硫氟虫腈、氟虫脲、氟甲腈、氟虫腈亚砜、氟虫腈硫醚不同浓度标准曲线0μg/L，0.5μg/L，1.5μg/L，4.5μg/L，13.5μg/L，40.5μg/L，使用实施例1-7和对比例1-3制备的氟虫腈试剂盒检测，通过吸光光度值得出乙硫氟虫腈、氟虫脲、氟甲腈、氟虫腈亚砜、氟虫腈硫醚的IC50值，交叉反应率的计算方式如下：
表1乙硫氟虫腈、氟虫脲、氟甲腈、氟虫腈亚砜、氟虫腈硫醚的交叉反应率
由表1可以看出，与对比例1-3相比，实施例1-7制备的氟虫腈试剂盒测得的乙硫氟虫腈、氟虫脲、氟甲腈、氟虫腈亚砜、氟虫腈硫醚的交叉反应率明显较小，说明实施例1-7制备的氟虫腈试剂盒检测氟虫腈的特异性较高，实施例1-6制备的氟虫腈人工抗原特异性较强。
试验例3 氟虫腈试剂盒精密度检测
（1）用试剂盒进行检测
加标准溶液/样本50μL到对应的微孔中，再加入抗体50μL/孔，最后加入酶标二抗50μL/孔轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应45min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μL/孔，充分洗涤4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头轻轻戳破)。加入底物液A液50μL/孔，再加底物液B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中显色15min。加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪检测波长450nm，参比波长620nm，测定每孔OD值。
（2）检测结果分析
标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值除以第一个标准品（0标准）的吸光度值，再乘以100％，得到标准品或样本的百分吸光度值。以标准品百分吸光率为纵坐标，以氟虫腈标准品浓度（μg/L）的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中氟虫腈的实际浓度。
从实施例1制备的3个不同试剂盒批次中各抽取10个试剂盒，每个酶标板随即抽取10个微孔测定标准溶液（含1μg/L氟虫腈）的吸光光度值，计算变异系数。实验重复三次结果，结果如表2所示。
表2 实施例1制备的氟虫腈试剂盒测试的标准溶液浓度和变异系数
实施例2-7制备的氟虫腈试剂盒测定标准溶液（含1μg/L氟虫腈）的变异系数与实施例1的变异系数相近，由表2可以看出，实施例1制备的氟虫腈试剂盒测定标准溶液（含1μg/L氟虫腈）的变异系数为2.1%-2.2%。
从实施例1和对比例2-3制备的3个不同试剂盒批次中各抽取10个试剂盒，每个酶标板随即抽取10个微孔测定标准溶液（含5μg/L氟虫腈）的吸光光度值，计算变异系数。实验重复三次结果，结果如表3所示。
表3 实施例1和对比例2-3制备的氟虫腈试剂盒测试的标准溶液浓度和变异系数
实施例2-7制备的氟虫腈试剂盒测定标准溶液（含5μg/L氟虫腈）的变异系数与实施例1的变异系数相近，由表3可以看出，实施例1三个批次制备的氟虫腈试剂盒的变异系数分别为0.9%、0.9%、0.8%，说明与对比例2-3相比，实施例1-7制备的氟虫腈试剂盒能够有效提高氟虫腈含量检测的准确度。
从实施例1和对比例1制备的3个不同试剂盒批次中各抽取10个试剂盒，每个酶标板随即抽取10个微孔测定标准溶液（含8μg/L氟虫腈）的吸光光度值，计算变异系数。实验重复三次结果，结果如表4所示。
表4 实施例1和对比例1制备的氟虫腈试剂盒测试的标准溶液浓度和变异系数
实施例2-7制备的氟虫腈试剂盒测定标准溶液（含8μg/L氟虫腈）的变异系数与实施例1的变异系数相近，由表4可以看出，实施例1三个批次制备的氟虫腈试剂盒的变异系数分别为0.6%、0.5%、0.6%，说明与对比例1相比，实施例1-7制备的氟虫腈试剂盒能够有效提高氟虫腈含量检测的准确度。
试验例4 氟虫腈试剂盒灵敏度检测
对实施例1-7和对比例1-3制备的氟虫腈试剂盒进行最低检出限检测，结果如表5所示。
表5 实施例1-7和对比例1-3制备的氟虫腈试剂盒的最低检出限检测结果
由表5可以看出，与对比例1-3相比，实施例1-7制备的氟虫腈试剂盒的最低检出限较低，为0.1μg/L，说明实施例1-7制备的氟虫腈试剂盒的灵敏度较高。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。