一种定量核磁共振氢谱测定杜仲胶含量的方法
阅读说明：本技术 一种定量核磁共振氢谱测定杜仲胶含量的方法 (Method for measuring content of gutta-percha by quantitative nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum ) 是由 赵红波 柴晓飞 吕印美 杨丽 王岳华 董昭苹 董淑杰 崔丽华 徐晓婷 孟庆春 于 2021-07-06 设计创作，主要内容包括：本发明属于分析技术领域,具体涉及一种定量核磁共振氢谱测定杜仲胶含量的方法。通过设定特定的测定过程中参数,排除溶剂中杂质及溶剂本身氢峰的干扰,以及被测组分和杂质之间的信号干扰,通过纵向弛豫时间T1值设定核磁共振波谱仪的脉冲倾倒角和弛豫时间,再用所述核磁共振波谱仪测定待测溶液的核磁氢谱。最终使得测定积分准确,检测结果重现性好。该方法快捷并且不需要目标测试物的标准品做外标,只需要高纯度的对照品作为参比即可。本发明能够快速、准确、稳定的测定杜仲胶含量。克服了常规运用提纯后直接称量的误差。本发明具有成本低,操作简单,结果准确,在测试样品时无需杜仲胶标准品,重复性好等优点,可快速评价杜仲提取物中杜仲胶的含量。(The invention belongs to the technical field of analysis, and particularly relates to a method for determining the content of gutta-percha by quantitative nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum. The method comprises the steps of eliminating the interference of impurities in a solvent and hydrogen peaks of the solvent and the signal interference between a detected component and the impurities by setting parameters in a specific detection process, setting a pulse flip angle and a relaxation time of a nuclear magnetic resonance spectrometer by a longitudinal relaxation time T1 value, and detecting a nuclear magnetic hydrogen spectrum of a solution to be detected by the nuclear magnetic resonance spectrometer. Finally, the determination integration is accurate, and the detection result has good reproducibility. The method is quick, and only a high-purity reference substance is needed as a reference, and a standard substance of a target test substance is not needed to be used as an external standard. The method can rapidly, accurately and stably determine the content of the gutta-percha. The error of direct weighing after conventional application and purification is overcome. The method has the advantages of low cost, simple operation, accurate result, no need of a gutta-percha standard substance during sample testing, good repeatability and the like, and can quickly evaluate the content of the gutta-percha in the eucommia ulmoides extract.)
技术领域
本发明属于分析技术领域，具体涉及一种定量核磁共振氢谱测定杜仲胶含量 的方法。
背景技术
杜仲是中国特有的名贵经济树种，除了含有大量的药用成份以外，在叶子、 树皮、果皮等组织中还含有大量的杜仲胶，是世界上适用范围最广的重要胶原植 物。杜仲胶属于硬性橡胶，是反式异戊二烯的高聚体，其组成与天然橡胶相同， 而且有一些相似性状，被称为天然橡胶的姊妹。杜仲胶绝缘性良好，耐酸碱、耐 磨擦、耐腐蚀，可以硫化制得高弹性体，也可以控制交联度产生新材料，如形状 记忆功能材料，还是制造海底电缆以及飞机轮胎等的重要原料。由于杜仲胶坚柔 耐磨，对人体副作用较小，也被用来做人造关节。总之，通过硫化改性或与其他 材料共混及深度加工，杜仲胶可开发出一系列覆盖塑料、橡胶领域的新型功能材 料和工业材料，有着广泛的用途。它独有“橡胶-塑料二重性”的发现，开拓了杜仲胶的应用领域。它的综合开发利用，已经引起国家有关部门的广泛关注。
目前，杜仲胶含量的测定主要采用重量法，即杜仲胶含量(％)＝(精胶重/ 样品重)×100％，认为经过一系列提取后，得到的就是杜仲胶，不含有其它物质， 无任何可靠的依据来证明提取后的物质完全是杜仲胶。目前还没有方法能够精确 快速测定杜仲胶含量。
发明内容
为了克服现有技术的缺点，本发明提供了一种定量核磁共振氢谱测定杜仲胶 含量的方法。通过设定特定的测定过程中参数，排除溶剂中杂质及溶剂本身氢峰 的干扰，以及被测组分和杂质之间的信号干扰，通过纵向弛豫时间T1值设定核 磁共振波谱仪的脉冲倾倒角和弛豫时间，再用所述核磁共振波谱仪测定待测溶液 的核磁氢谱。最终使得测定积分准确，检测结果重现性好。该方法快捷并且不需 要目标测试物的标准品做外标，只需要高纯度的对照品作为参比即可。本发明能 够快速、准确、稳定的测定杜仲胶含量。克服了常规运用提纯后直接称量的误差。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
(1)精确称取待测杜仲胶样品和内标物1,3,5-三甲氧基苯置于洁净干燥的 核磁管中，加入氘代溶剂于核磁管中，密封好后放置通风橱中，样品完全溶解后， 进行1H NMR测试。
其中，杜仲胶(以待测杜仲胶样品预估的杜仲胶质量计)：1,3,5-三甲氧基 苯：氯仿＝(12～37.5)mg：(8～15)mg：(0.4～0.6)ml，以保证待测物与内标 物的定量峰相差不大，并能在溶剂中完全溶解且使浓度出峰适中，减少测定误差
优选的，杜仲胶(以待测杜仲胶样品中预估杜仲胶质量计)与内标物1,3,5- 三甲氧基苯的质量比为1.5～2.5:1，此比例范围内所得结果具有良好的线性关 系；
杜仲胶的是一种聚合物，其化学结构式如式I所示，其在一般溶剂中的溶解 性不是很好，甚至不溶解，因此采用定量核磁氢谱技术时需要特定的溶剂溶解， 保证称取的内标物和样品要完全溶解于氘代试剂中。发明人经研究发现在一定的 时间内氘代氯仿、氘代苯、氘代丙酮、氘代邻二氯苯可以很好的溶解杜仲胶且对 样品目标定量信号峰无干扰。考虑到更优的溶解度、信号峰干扰和成本问题，本 发明中优选采用氘代氯仿。
(2)调整仪器参数：
设置核磁共振波谱仪的参数，共振频率为400MHz，脉冲倾倒角30°～90°,测 定温度23±2℃，采集时间3s,采样次数NS＝16～32次,弛豫时间D1＝15～30s， 匀场、采样，得到的图谱进行相位调整和基线校正；
经T1实验，得到物质的T1值为6S，D1≥2.5T1，D1＝15～30s，弛豫时间 (D1)要足够长使原子核完全弛豫，从而使被积分的信号强度与原子核数目成正比， 但D1值越大，采集样品时间越长，优选D1＝15s；所述脉冲倾倒角为30°～90°， 采用90°脉冲时，灵敏度较好，但分析时间较长，核磁快速定量的优越性得不到 体现，采用30°脉冲较小的倾倒角时，据T1值就能获得准确的分析结果，且可 以缩短分析时间，提高分析效率，因此优选脉冲倾倒角为30°。
(3)对杜仲胶样品和1,3,5-三甲氧基苯的定量峰进行积分，杜仲胶定量峰 选取δ5.12的质子峰；1,3,5-三甲氧基苯的量峰选取δ6.09的质子峰，分别积 分多次，当积分结果相对标准偏差＜1％时取平均值，根据积分结果采用下式计算：
式中：
ws是样品含杜仲胶的质量分数；
wi是内标物的质量分数；
As和ns分别是样品的定量峰的积分面积和定量峰包含的质子数；
Ms是样品的单个集团的分子质量，ms是样品的称样质量；
Ai和ni分别是内标物的定量峰的积分面积和定量峰包含的质子数；
Mi是内标物的分子质量；
mi是内标物的称样质量。
为避免加入样品中新的杂质干扰信号分析，内标物纯度应越高越好，本发明 中选择纯度为99.7％的1,3,5-三甲氧基苯。
根据相位调整和基线校正的可变化性和人为差异，优选定量峰积分面积为每 一个信号5次积分的平均值，可依据积分的稳定性进行次数增减。
与现有技术相比，本发明有益效果如下：
本发明首次运用核磁共振氢谱对杜仲胶(杜仲提取物)含量进行计算。克服 了常规运用提纯后直接称量的误差。
定量核磁共振氢谱的原理是含有H的有机化合物NMR波谱信号与原子个数成 正比，因此在实验参数设定时，需要被测物与内标物上的共振峰与其对应的结构 形式相近。氢的选择需要排除溶剂中杂质及溶剂本身氢峰的干扰，以及被测组分 和杂质之间的信号干扰，否则导致积分不准确，检测结果重现性差不准确。同时 定量核磁共振氢谱，不同的位置的峰对应不同的弛豫时间和脉冲倾倒角，因此需 要对定量峰选择合适的弛豫时间和脉冲倾倒角。本发明通过测定杜仲胶目标峰在 氘代试剂中的纵向弛豫时间T1值，确定脉冲倾倒角及弛豫时间等参数对测定结 果的影响，最终采用脉冲倾倒角为30°，弛豫时间为15s，使计算结果准确性高， 又节省时间，保证高效性。
本发明采用所述化合物的参与计算的δ5.12的质子峰(为杜仲胶双键位置 质子化学位移)及δ6.09(内标物双键质子化学位移)，避免氘代试剂及其它杂 质峰干扰，保证结果的准确性。
本发明优选采用氘代氯仿作为溶剂，既保证了样品的溶解性又避免氘代试剂 在计算峰位置处的干扰峰，提高谱图分辨率，又节省成本。
本发明采用内标物为纯度为99.7％的1,3,5-三甲氧基苯，及样品据(杜仲胶 含量来计算)与内标物称样量质量比控制在本发明限定的范围，保证了两者在核 磁氢谱分离度好减少计算峰的干扰性，从而提高检测结果的准确性。
附图说明
图1为1,3,5-三甲氧基苯的化学结构式；
图2为实施例1中的核磁共振氢谱；
图3为实施例2中的核磁共振氢谱；
图4为实施例3中的核磁共振氢谱；
图5为实施例4中的核磁共振氢谱；
图6为实施例5中的核磁共振氢谱；
图7为实施例6中的核磁共振氢谱；
图8为实施例7中的核磁共振氢谱；
图9为实施例8中的核磁共振氢谱；
图10为实施例9中的核磁共振氢谱。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明进行详细说明，但不用来限制本发明的范围：
本发明使用的仪器是BrukerAvance 400MHz核磁共振波谱仪。
实施例1
按重量法预估杜仲胶含量为93％的样品，精确称取18.2mg杜仲提取物粗品 和8.0mg内标物1,3,5-三甲氧基苯置于洁净干燥的核磁管中，加入0.5mL氘代 氯仿溶剂于核磁管中，密封好后放置通风橱中2h，样品完全溶解后，晃动核磁 管使其内部溶液均匀，进行1H NMR测试。在以上实验条件下设置仪器参数，匀 场、采样，得到图谱后进行相位调整和基线校正，对杜仲胶样品和1,3,5-三甲 氧基苯的定量峰进行积分，分别积分5次，当积分结果相对标准偏差＜1％时取平 均值，根据积分结果用下式计算：
式中：ws是样品含杜仲胶的质量分数，wi是内标物的质量分数，As和ns分别 是样品的定量峰的积分面积和定量峰包含的质子数，Ms是样品的单个集团的分 子质量，ms是样品的称样质量，Ai和ni分别是内标物的定量峰的积分面积和定量 峰包含的质子数，Mi是内标物的分子质量，mi是内标物的称样质量。
核磁共振采集条件：核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，脉冲为30°，D1为15s，采集累加次数为32次，测试温度为23±2℃，测定样品的NMR谱图。
如图4所示，在1H NMR谱中，As＝1.00,Ai＝0.61，根据公式计算出杜仲胶 样品中杜仲胶含量为87.56％，重复5次，标准误差为0.17％，相对标准偏差为 0.18％。
实施例2
按重量法预估杜仲胶含量为93％的样品，精确称取17.9mg杜仲提取物粗品 和10.1mg内标物1,3,5-三甲氧基苯置于洁净干燥的核磁管中，加入0.5mL氘 代氯仿溶剂于核磁管中，密封好后放置通风橱中2h，样品完全溶解后，晃动核 磁管使其内部溶液均匀，进行1H NMR测试。在以上实验条件下设置仪器参数， 匀场、采样，得到图谱后进行相位调整和基线校正，对杜仲胶样品和1,3,5-三 甲氧基苯的定量峰进行积分，分别积分5次，当积分结果相对标准偏差＜1％时取 平均值，根据积分结果用下式计算：
式中：ws是样品含杜仲胶的质量分数，wi是内标物的质量分数，As和ns分别 是样品的定量峰的积分面积和定量峰包含的质子数，Ms是样品的单个集团的分 子质量，ms是样品的称样质量，Ai和ni分别是内标物的定量峰的积分面积和定量 峰包含的质子数，Mi是内标物的分子质量，mi是内标物的称样质量。
核磁共振采集条件：核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，脉冲为30°，D1为20s，采集累加次数为28次，测试温度为23±2℃，测定样品的NMR谱图。
如图5所示，在1H NMR谱中，As＝1.00,Ai＝0.78，根据公式计算出杜仲胶 样品中杜仲胶含量为87.89％，重复5次，标准误差为0.17％，相对标准偏差为 0.20％。
实施例3
按重量法预估杜仲胶含量为93％的样品，精确称取12.4mg杜仲提取物粗品 和15.0mg内标物1,3,5-三甲氧基苯置于洁净干燥的核磁管中，加入0.5mL氘 代氯仿溶剂于核磁管中，密封好后放置通风橱中2h，样品完全溶解后，晃动核 磁管使其内部溶液均匀，进行1H NMR测试。在以上实验条件下设置仪器参数， 匀场、采样，得到图谱后进行相位调整和基线校正，对杜仲胶样品和1,3,5-三 甲氧基苯的定量峰进行积分，分别积分5次，当积分结果相对标准偏差＜1％时取 平均值，根据积分结果用下式计算：
式中：ws是样品含杜仲胶的质量分数，wi是内标物的质量分数，As和ns分别 是样品的定量峰的积分面积和定量峰包含的质子数，Ms是样品的单个集团的分 子质量，ms是样品的称样质量，Ai和ni分别是内标物的定量峰的积分面积和定量 峰包含的质子数，Mi是内标物的分子质量，mi是内标物的称样质量。
核磁共振采集条件：核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，脉冲为30°，D1为30s，采集累加次数为16次，测试温度为23±2℃，测定样品的NMR谱图。
如图6所示，在1H NMR谱中，As＝1.00,Ai＝1.68，根据公式计算出杜仲胶 样品中杜仲胶含量为87.48％，重复5次，标准误差为0.19％，相对标准偏差为 0.20％。
实施例4
按重量法预估杜仲胶含量为93％的样品，精确称取37.1mg杜仲提取物粗品 和15.0mg内标物1,3,5-三甲氧基苯置于洁净干燥的核磁管中，加入0.5mL氘 代氯仿溶剂于核磁管中，密封好后放置通风橱中2h，样品完全溶解后，晃动核 磁管使其内部溶液均匀，进行1H NMR测试。在以上实验条件下设置仪器参数， 匀场、采样，得到图谱后进行相位调整和基线校正，对杜仲胶样品和1,3,5-三 甲氧基苯的定量峰进行积分，分别积分5次，当积分结果相对标准偏差＜1％时取 平均值，根据积分结果用下式计算：
式中：ws是样品含杜仲胶的质量分数，wi是内标物的质量分数，As和ns分别 是样品的定量峰的积分面积和定量峰包含的质子数，Ms是样品的单个集团的分 子质量，ms是样品的称样质量，Ai和ni分别是内标物的定量峰的积分面积和定量 峰包含的质子数，Mi是内标物的分子质量，mi是内标物的称样质量。
核磁共振采集条件：核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，脉冲为60°，D1为15s，采集累加次数为32次，测试温度为23±2℃，测定样品的NMR谱图。
如图7所示，在1H NMR谱中，As＝1.00,Ai＝0.56，根据公式计算出杜仲胶 样品中杜仲胶含量为87.72％，重复5次，标准误差为0.19％，相对标准偏差为 0.20％。
实施例5
按重量法预估杜仲胶含量为93％的样品，精确称取12.1mg杜仲提取物粗品 和8.0mg内标物1,3,5-三甲氧基苯置于洁净干燥的核磁管中，加入0.5mL氘代 氯仿溶剂于核磁管中，密封好后放置通风橱中2h，样品完全溶解后，晃动核磁 管使其内部溶液均匀，进行1H NMR测试。在以上实验条件下设置仪器参数，匀 场、采样，得到图谱后进行相位调整和基线校正，对杜仲胶样品和1,3,5-三甲 氧基苯的定量峰进行积分，分别积分5次，当积分结果相对标准偏差＜1％时取平 均值，根据积分结果用下式计算：
式中：ws是样品含杜仲胶的质量分数，wi是内标物的质量分数，As和ns分别 是样品的定量峰的积分面积和定量峰包含的质子数，Ms是样品的单个集团的分 子质量，ms是样品的称样质量，Ai和ni分别是内标物的定量峰的积分面积和定量 峰包含的质子数，Mi是内标物的分子质量，mi是内标物的称样质量。
核磁共振采集条件：核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，脉冲为60°，D1为20s，采集累加次数为28次，测试温度为23±2℃，测定样品的NMR谱图。
如图8所示，在1H NMR谱中，As＝1.00,Ai＝0.92，根据公式计算出杜仲胶 样品中杜仲胶含量为87.31％，重复5次，标准误差为20％，相对标准偏差为0.21％。
实施例6
按重量法预估杜仲胶含量为93％的样品，精确称取37.5mg杜仲提取物粗品 和8.1mg内标物1,3,5-三甲氧基苯置于洁净干燥的核磁管中，加入0.5mL氘代 氯仿溶剂于核磁管中，密封好后放置通风橱中2h，样品完全溶解后，晃动核磁 管使其内部溶液均匀，进行1H NMR测试。在以上实验条件下设置仪器参数，匀 场、采样，得到图谱后进行相位调整和基线校正，对杜仲胶样品和1,3,5-三甲 氧基苯的定量峰进行积分，分别积分5次，当积分结果相对标准偏差＜1％时取平 均值，根据积分结果用下式计算：
式中：ws是样品含杜仲胶的质量分数，wi是内标物的质量分数，As和ns分别 是样品的定量峰的积分面积和定量峰包含的质子数，Ms是样品的单个集团的分 子质量，ms是样品的称样质量，Ai和ni分别是内标物的定量峰的积分面积和定量 峰包含的质子数，Mi是内标物的分子质量，mi是内标物的称样质量。
核磁共振采集条件：核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，脉冲为60°，D1为30s，采集累加次数为16次，测试温度为23±2℃，测定样品的NMR谱图。
如图9所示，在1H NMR谱中，As＝1.00,Ai＝0.30，根据公式计算出杜仲胶 样品中杜仲胶含量为87.48％，重复5次，标准误差为0.18％，相对标准偏差为 0.21％。
实施例7
按重量法预估杜仲胶含量为93％的样品，精确称取13.9mg杜仲提取物粗品 和12.3mg内标物1,3,5-三甲氧基苯置于洁净干燥的核磁管中，加入0.5mL氘 代氯仿溶剂于核磁管中，密封好后放置通风橱中2h，样品完全溶解后，晃动核 磁管使其内部溶液均匀，进行1H NMR测试。在以上实验条件下设置仪器参数， 匀场、采样，得到图谱后进行相位调整和基线校正，对杜仲胶样品和1,3,5-三 甲氧基苯的定量峰进行积分，分别积分5次，当积分结果相对标准偏差＜1％时取 平均值，根据积分结果用下式计算：
式中：ws是样品含杜仲胶的质量分数，wi是内标物的质量分数，As和ns分别 是样品的定量峰的积分面积和定量峰包含的质子数，Ms是样品的单个集团的分 子质量，ms是样品的称样质量，Ai和ni分别是内标物的定量峰的积分面积和定量 峰包含的质子数，Mi是内标物的分子质量，mi是内标物的称样质量。
核磁共振采集条件：核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，脉冲为90°，D1为15s，采集累加次数为32次，测试温度为23±2℃，测定样品的NMR谱图。
如图10所示，在1H NMR谱中，As＝1.00,Ai＝1.22，根据公式计算出杜仲 胶样品中杜仲胶含量为88.13％，重复5次，标准误差为0.18％，相对标准偏差为 0.19％。
实施例8
按重量法预估杜仲胶含量为93％的样品，精确称取15.9mg杜仲提取物粗品 和13.1mg内标物1,3,5-三甲氧基苯置于洁净干燥的核磁管中，加入0.5mL氘 代氯仿溶剂于核磁管中，密封好后放置通风橱中2h，样品完全溶解后，晃动核 磁管使其内部溶液均匀，进行1H NMR测试。在以上实验条件下设置仪器参数， 匀场、采样，得到图谱后进行相位调整和基线校正，对杜仲胶样品和1,3,5-三 甲氧基苯的定量峰进行积分，分别积分5次，当积分结果相对标准偏差＜1％时取 平均值，根据积分结果用下式计算：
式中：ws是样品含杜仲胶的质量分数，wi是内标物的质量分数，As和ns分别 是样品的定量峰的积分面积和定量峰包含的质子数，Ms是样品的单个集团的分 子质量，ms是样品的称样质量，Ai和ni分别是内标物的定量峰的积分面积和定量 峰包含的质子数，Mi是内标物的分子质量，mi是内标物的称样质量。
核磁共振采集条件：核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，脉冲为90°，D1为20s，采集累加次数为28次，测试温度为23±2℃，测定样品的NMR谱图。
如图9所示，在1H NMR谱中，As＝1.00,Ai＝1.14，根据公式计算出杜仲胶 样品中杜仲胶含量为87.81％，重复5次，标准误差为0.19％，相对标准偏差为 0.19％。
实施例9
按重量法预估杜仲胶含量为93％的样品，精确称取12.9mg杜仲提取物粗品 和13.6mg内标物1,3,5-三甲氧基苯置于洁净干燥的核磁管中，加入0.5mL氘 代氯仿溶剂于核磁管中，密封好后放置通风橱中2h，样品完全溶解后，晃动核 磁管使其内部溶液均匀，进行1H NMR测试。在以上实验条件下设置仪器参数， 匀场、采样，得到图谱后进行相位调整和基线校正，对杜仲胶样品和1,3,5-三 甲氧基苯的定量峰进行积分，分别积分5次，当积分结果相对标准偏差＜1％时取 平均值，根据积分结果用下式计算：
式中：ws是样品含杜仲胶的质量分数，wi是内标物的质量分数，As和ns分别 是样品的定量峰的积分面积和定量峰包含的质子数，Ms是样品的单个集团的分 子质量，ms是样品的称样质量，Ai和ni分别是内标物的定量峰的积分面积和定量 峰包含的质子数，Mi是内标物的分子质量，mi是内标物的称样质量。
核磁共振采集条件：核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，脉冲为90°，D1为30s，采集累加次数为16次，测试温度为23±2℃，测定样品的NMR谱图。
如图10所示，在1H NMR谱中，As＝1.00,Ai＝1.47，根据公式计算出杜仲 胶样品中杜仲胶含量为87.14％，重复5次，标准误差为0.20％，相对标准偏差为 0.19％。
上述虽然结合附图对发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术 人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围 内。
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