一种简便快速分离荔枝霜疫霉菌的方法
阅读说明：本技术 一种简便快速分离荔枝霜疫霉菌的方法 (Method for simply, conveniently and rapidly separating peronophythora litchi ) 是由 陈庆河 杨成东 贾斯蒂 于 2021-07-22 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种简便快速分离荔枝霜疫霉菌的方法,包括如下步骤：(1)荔枝病组织的选择和消毒；(2)制备V8蔬菜培养基,加入氨卞青霉素、咪鲜胺和恶霉灵,加入促生剂,混匀,得选择性培养基,所述促生剂由β-谷甾醇母液、荔枝皮研出液和水混合而成；(3)病组织置于选择性培养基中培养,挑取菌丝,镜检,接种至新的选择性培养基中培养；(4)从菌落上切下菌丝块,加入荔枝皮研出液浸泡后,置于新的V8蔬菜培养基中培养,得荔枝霜疫霉菌。本发明分离得到的荔枝霜疫霉菌不仅活性好,还具有较好的致病力,操作简单,分离率高,易于成功,可实现荔枝霜疫霉菌的高效分离。(The invention provides a method for simply, conveniently and quickly separating peronophythora litchi, which comprises the following steps: (1) selecting and disinfecting litchi diseased tissues; (2) preparing a V8 vegetable culture medium, adding ampicillin, prochloraz and hymexazol, adding a growth promoter, and mixing uniformly to obtain a selective culture medium, wherein the growth promoter is prepared by mixing beta-sitosterol mother liquor, litchi rind ground liquid and water; (3) culturing the diseased tissue in a selective culture medium, picking hyphae, performing microscopic examination, and inoculating to a new selective culture medium for culturing; (4) cutting mycelium blocks from the bacterial colonies, adding litchi rind grinding liquid, soaking, and culturing in a new V8 vegetable culture medium to obtain peronophythora litchi. The peronophythora litchi strain obtained by separation has the advantages of good activity, better pathogenicity, simple operation, high separation rate and easy success, and can realize the high-efficiency separation of the peronophythora litchi strain.)
技术领域
本发明涉及植物病原菌分离技术领域，特别涉及一种简便快速分离荔枝霜疫霉菌的方法。
背景技术
荔枝霜疫霉菌(Peronophythora litchii Chen ex Ko et al)引起的荔枝霜疫病(曾称荔枝霜疫霉病或荔枝霜霉病)严重威胁着我国荔枝产业的健康发展，是荔枝生产及采后危害最为严重、影响最为广泛的病害。该病可侵染嫩叶、嫩枝、花穗及果实，引起大量花穗和果实腐烂。一般年份可造成10％-30％的产量损失，流行年份可造成80％的产量损失，在广东、广西、福建，海南等地发生尤为严重。为了对荔枝霜疫病进行相关研究，通过分离而获得纯的荔枝霜疫霉菌是必要的。荔枝病果组织中常常带有其他杂菌，按常规方法进行分离组织病原菌时，由于这些杂菌的生长较荔枝霜疫霉菌迅速，杂菌的菌丝常将荔枝霜疫霉菌覆盖，而细菌也会抑制荔枝霜疫霉病菌的生长；此外，荔枝霜疫霉在无性阶段的孢囊梗为有限生长而似霜霉菌，而有性阶段及能在人工培养基上生长等性状又与疫霉菌相同。因此，采用常规分离真菌的方法并不能够很好地分离荔枝霜疫霉菌，且操作繁琐、不易成功。
发明内容
鉴以此，本发明的目的在于提出一种简便快速分离荔枝霜疫霉菌的方法，通过控制选择性培养基的组分及配比，不仅有效地分离纯化出荔枝霜疫霉菌，而且菌株具有较高的活性和较好的致病力。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种分离荔枝霜疫霉菌的方法，包括如下步骤：
(1)取荔枝病果，切下破损部分作为病组织，消毒；
(2)按重量份数计，取8～12份V8蔬菜汁，加入85～95份水，灭菌冷却后，得V8蔬菜培养基，加入0.01～0.02份氨卞青霉素、0.01～0.02份咪鲜胺和0.01～0.02份恶霉灵，混匀，得选择性培养基；
(3)切取病组织内果皮的病健交界处组织，置于选择性培养基中，22～28℃培养2-4d，挑取菌丝，镜检，接种至新的选择性培养基，22～28℃培养3-5d，得菌落；
(4)从菌落上切下菌丝块，置于新的V8蔬菜培养基中，22～28℃培养1-2d，得荔枝霜疫霉菌。
进一步说明，所述消毒为用水冲洗后，加入体积浓度70～80％乙醇溶液浸泡0.5～1min，无菌水冲洗3-5次，吸干表面水分。
进一步说明，所述选择性培养基还包括促生剂4～8份，该促生剂在V8蔬菜培养基灭菌冷却后加入。
进一步说明，所述促生剂按质量百分比，由β-谷甾醇母液10～15％、荔枝皮研出液40～50％和余量为水混合而成。
进一步说明，所述β-谷甾醇母液是由按质量比为10～15：1～2的β-谷甾醇和二氯甲烷混合所得。
进一步说明，所述荔枝皮研出液是由荔枝皮加入pH值6.5～7.5、0.18～0.2M的磷酸缓冲溶液研磨过滤而得；所述荔枝皮与磷酸缓冲溶液的料液质量比为2～3：4～5。
进一步说明，所述步骤(4)中，所述菌丝块由菌落边缘呈放射状单菌丝的尖端切下，所述菌丝块的长度为≤0.5cm。
进一步说明，所述步骤(4)中，所述菌丝块还包括浸泡处理，将从菌落边缘呈放射状单菌丝的尖端切下菌丝块，加入荔枝皮研出液浸泡5～10min后，取出，置于新的V8蔬菜培养基中培养。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：(1)本发明通过采用一定比例的氨卞青霉素、咪鲜胺和恶霉灵组合得到的选择性培养基，并结合特定的分离步骤，可使荔枝霜疫霉菌集中释放大量游动孢子，短期内可获得大量的荔枝霜疫霉菌游动孢子，且有效地抑制了细菌和真菌的污染几率，大大提高了分离纯化的效率。本发明具有取材容易、成本低、操作步骤简单、分离效率高等优点，本发明为荔枝霜疫病的研究提供了技术保证。
(2)本发明在选择性培养基中加入促生剂，通过采用磷酸缓冲液制备荔枝皮研出液，不仅有利于提高荔枝皮成分的提取，还可调节促生剂的酸碱平衡值，并维持细胞体液的稳定性，促进荔枝皮研出液的酶活性，分解生成活性小分子；由荔枝皮研出液与β-谷甾醇母液的科学配制获得的促生剂，可促进荔枝霜疫霉菌的孢囊梗分叉，并增强荔枝霜疫霉菌发芽孔的萌发能力和增粗芽管，可提高荔枝霜疫霉菌菌丝的覆盖能力和生物活性，进一步提高分离纯化的效率。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
V8蔬菜汁为美国Campbell Soup Company公司生产的V8原味混合蔬菜汁。
实施例1
一种分离荔枝霜疫霉菌的方法，包括如下步骤：
(1)取荔枝病果，切下破损部分作为病组织，用水冲洗后，加入体积浓度70％乙醇溶液浸泡0.5min，无菌水冲洗3次，吸干表面水分；
(2)按重量计，取V8蔬菜汁80g，加入水850g，灭菌冷却后，得V8蔬菜培养基，加入氨卞青霉素0.1g、咪鲜胺0.1g和恶霉灵0.1g，加入促生剂40g，混匀，得选择性培养基；其中，该促生剂，按质量百分比计，由β-谷甾醇母液10％、荔枝皮研出液40％和余量为水混合而成，即β-谷甾醇母液4g、荔枝皮研出液16g和水20g。
β-谷甾醇母液是由按质量比为10：1的β-谷甾醇10g和二氯甲烷1g混合搅拌溶解所得；荔枝皮研出液是按荔枝皮与磷酸缓冲溶液的料液质量比为2：4，将荔枝皮40g加入pH值6.5、0.18M的磷酸缓冲溶液80g研磨过滤而得；
(3)切取病组织内果皮的病健交界处组织，置于选择性培养基中，26℃培养2d，挑取菌丝，镜检，接种至新的选择性培养基，26℃培养3d，得菌落；
(4)从菌落边缘呈放射状单菌丝的尖端切下菌丝块，菌丝块的长度为≤0.5cm，加入荔枝皮研出液浸泡，使荔枝皮研出液完全覆盖菌丝块，浸泡5min后，取出，置于新的V8蔬菜培养基中，26℃培养1d，得荔枝霜疫霉菌。
实施例2
一种分离荔枝霜疫霉菌的方法，包括如下步骤：
(1)取荔枝病果，切下破损部分作为病组织，用水冲洗后，加入体积浓度70％乙醇溶液浸泡1min，无菌水冲洗3次，吸干表面水分；
(2)按重量计，取V8蔬菜汁120g，加入水950g，灭菌冷却后，得V8蔬菜培养基，加入氨卞青霉素0.2g、咪鲜胺0.2g和恶霉灵0.2g，加入促生剂80g，混匀，得选择性培养基；其中，该促生剂，按质量百分比计，由β-谷甾醇母液15％、荔枝皮研出液50％和余量为水混合而成，即β-谷甾醇母液12g、荔枝皮研出液40g和水28g。
β-谷甾醇母液是由质量比为15：2的β-谷甾醇15g和二氯甲烷2g混合搅拌溶解所得；荔枝皮研出液是按荔枝皮与磷酸缓冲溶液的料液质量比为2：5，将荔枝皮80g加入pH值6.5、0.18M的磷酸缓冲溶液200g研磨过滤而得；
(3)切取病组织内果皮的病健交界处组织，置于选择性培养基中，26℃培养2d，挑取菌丝，镜检，接种至新的选择性培养基，26℃培养3d，得菌落；
(4)从菌落边缘呈放射状单菌丝的尖端切下菌丝块，菌丝块的长度为≤0.5cm，加入荔枝皮研出液浸泡，使荔枝皮研出液完全覆盖菌丝块，浸泡5min后，取出，置于新的V8蔬菜培养基中，26℃培养1d，得荔枝霜疫霉菌。
实施例3
一种分离荔枝霜疫霉菌的方法，包括如下步骤：
(1)取荔枝病果，切下破损部分作为病组织，用水冲洗后，加入体积浓度70％乙醇溶液浸泡0.8min，无菌水冲洗3次，吸干表面水分；
(2)按重量计，取V8蔬菜汁100g，加入水900g，灭菌冷却后，得V8蔬菜培养基，加入氨卞青霉素0.15g、咪鲜胺0.15g和恶霉灵0.15g，加入促生剂70g，混匀，得选择性培养基；其中，该促生剂，按质量百分比计，由β-谷甾醇母液14％、荔枝皮研出液45％和余量为水混合而成，即β-谷甾醇母液9.8g、荔枝皮研出液31.5g和水28.7g。
β-谷甾醇母液是由按质量比为11：1的β-谷甾醇11g和二氯甲烷1g混合搅拌溶解所得；荔枝皮研出液是按荔枝皮与磷酸缓冲溶液的料液质量比为3：5，将荔枝皮90g加入pH值7.5、0.18M的磷酸缓冲溶液150g研磨过滤而得；
(3)切取病组织内果皮的病健交界处组织，置于选择性培养基中，26℃培养2d，挑取菌丝，镜检，接种至新的选择性培养基，26℃培养5d，得菌落；
(4)从菌落边缘呈放射状单菌丝的尖端切下菌丝块，菌丝块的长度为≤0.5cm，加入荔枝皮研出液浸泡，使荔枝皮研出液完全覆盖菌丝块，浸泡10min后，取出，置于新的V8蔬菜培养基中，26℃培养1d，得荔枝霜疫霉菌。
对比例1
根据实施例3的一种分离荔枝霜疫霉菌的方法，其区别在于：选择性培养基的原料重量不同，氨卞青霉素0.3g、咪鲜胺0.25g和恶霉灵0.3g。
对比例2
根据实施例3的一种分离荔枝霜疫霉菌的方法，其区别在于：促生剂的用量不同，促生剂100g，按质量百分比计，由β-谷甾醇母液14％、荔枝皮研出液45％和余量为水混合而成，即β-谷甾醇母液14g、荔枝皮研出液45g和水41g。
对比例3
根据实施例3的一种分离荔枝霜疫霉菌的方法，其区别在于：选择性培养基的原料不同，将利福平替换氨卞青霉素，即，利福平0.15g、咪鲜胺0.15g和恶霉灵0.15g。
对比例4
根据实施例3的一种分离荔枝霜疫霉菌的方法，其区别在于：促生剂的组分配比不同，促生剂70g，按质量百分比计，由β-谷甾醇母液5％、荔枝皮研出液45％和余量为水混合而成，即β-谷甾醇母液3.5g、荔枝皮研出液31.5g和水35g。
对比例5
根据实施例3的一种分离荔枝霜疫霉菌的方法，其区别在于：促生剂的组分配比不同，促生剂70g，按质量百分比计，β-谷甾醇母液5％、荔枝皮研出液30％和余量为水，即β-谷甾醇母液3.5g、荔枝皮研出液21g和水45.5g。
对比例6
根据实施例3的一种分离荔枝霜疫霉菌的方法，其区别在于：荔枝皮研出液制备方法不同，按荔枝皮与水的料液质量比为3：5，将荔枝皮90g加入水150g研磨过滤而得。
一、实验测试
实验方法：在菌落边缘呈放射状单菌丝的尖端取饼型，接种至V8蔬菜培养基，25℃培养2d后，测定菌落直径，菌落直径＝2d菌落直径-0d菌落直径；在培养基中加入5mL灭菌的去离子水，吸取500uL置于新的V8蔬菜培养基上，采用涂布法均匀地涂平，25℃培养3d后，加入5mL灭菌的去离子水，轻摇，制成孢子囊悬浮液，采用血球计数板测孢子量，重复测3次；取20uL孢子囊悬浮液，接种至荔枝皮上，25℃培养2d，测定发病率，发病率＝病果数/总果数×100％，测定病斑的直径大小，共设6个实验组，每组30个荔枝，实验结果如表1。
表1
经上表可知，本发明实施例1～3对荔枝霜疫霉菌的分离率在90％以上，荔枝霜疫霉菌对荔枝的致病率100％，病斑直径16.23～15.98mm，表明本发明通过采用一定比例的氨卞青霉素、咪鲜胺和恶霉灵组合得到的选择性培养基，并结合特定的分离步骤，实现荔枝霜疫霉菌的高效分离。
对比例1～6分离的荔枝霜疫霉菌分离率为75～82.5％，其分离得到的荔枝霜疫霉菌活性较弱，造成荔枝病斑的直径较短，病斑直径为12.78～15.18mm，致病力一般。表明本发明通过科学配制选择性培养基，加入一定比例的氨卞青霉素、咪鲜胺和恶霉灵组合，并结合特定的促生剂组分配比，可实现离得到的荔枝霜疫霉菌不仅具有较好的活性，而且还有较好的致病力，操作简单，分离率高，易于成功。
实施例4
一种分离荔枝霜疫霉菌的方法，包括如下步骤：
(1)取荔枝病果，切下破损部分作为病组织，用水冲洗后，加入体积浓度75％乙醇溶液浸泡0.8min，无菌水冲洗5次，吸干表面水分；
(2)按重量计，取V8蔬菜汁100g，加入水900g，灭菌冷却后，得V8蔬菜培养基，加入氨卞青霉素0.15g、咪鲜胺0.15g和恶霉灵0.15g，加入促生剂70g，混匀，得选择性培养基；其中，该促生剂，按质量百分比计，由β-谷甾醇母液14％、荔枝皮研出液45％和余量为水混合而成，即β-谷甾醇母液9.8g、荔枝皮研出液31.5g和水28.7g。
β-谷甾醇母液是由按质量比为12：1的β-谷甾醇12g和二氯甲烷1g混合搅拌溶解所得；荔枝皮研出液是按荔枝皮与磷酸缓冲溶液的料液质量比为3：5，将荔枝皮90g加入pH值7、0.2M的磷酸缓冲溶液150g研磨过滤而得；
(3)切取病组织内果皮的病健交界处组织，置于选择性培养基中，26℃培养4d，挑取菌丝，镜检，接种至新的选择性培养基，26℃培养4d，得菌落；
(4)从菌落边缘呈放射状单菌丝的尖端切下菌丝块，菌丝块的长度为≤0.5cm，加入荔枝皮研出液浸泡，使荔枝皮研出液完全覆盖菌丝块，浸泡8min后，取出，置于新的V8蔬菜培养基中，尖端间距5cm，26℃培养2d，得荔枝霜疫霉菌。
经实验结果表明，荔枝霜疫霉菌分离率98.75％，菌落直径26.9mm，孢子量7.9×106/cm2，发病率100％，病斑直径16.44mm。
综上所述，本发明通过采用一定比例的氨卞青霉素、咪鲜胺和恶霉灵组合得到的选择性培养基，并结合特定的分离步骤，可提高荔枝霜疫霉菌的分离纯化率，操作步骤简单，取材容易，且分离得到的荔枝霜疫霉菌不仅活性高，还具有较好的致病力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种海洋硅藻的人工培育方法和应用