具体实施方式

本发明总体上涉及低甲烷水稻，并且尤其涉及能够减少稻田甲烷排放的水稻植物材料。

本发明基于以下发现：水稻植物与产甲烷菌之间的相互作用基于有机酸，特别是延胡索酸和Krebs循环的其它有机酸，诸如水稻植物根部分泌的苹果酸。分泌的有机酸(诸如延胡索酸和/或苹果酸)又被产甲烷菌用作产甲烷菌繁殖的底物。因此，通过减少水稻植物根部的特别是延胡索酸盐的分泌，与水稻根部结合的土壤中存在的产甲烷菌的量显著减少，产甲烷菌的甲烷排放也同样显著减少。因此，水稻根部的延胡索酸分泌的减少是获得导致稻田的甲烷排放减少的低甲烷水稻的有效手段。

因此，本发明的方面涉及产生低甲烷水稻的方法。所述方法包括对水稻植物材料进行修饰，以减少水稻植物材料根部或获自水稻植物材料的水稻植物根部的有机酸分泌。在该实施方案中，水稻植物材料或水稻植物根部分泌的有机酸的量等于或小于不存在所述修饰的相应野生型水稻植物根部分泌的有机酸的量的90％。水稻植物材料或水稻植物的根部的有机酸分泌减少导致与水稻植物材料或水稻植物的根部结合的存在的产甲烷菌的甲烷排放减少。

在一个实施方案中，修饰水稻植物材料包括修饰水稻植物材料以减少水稻植物材料根部或水稻植物根部的延胡索酸和/或苹果酸(优选延胡索酸)分泌。

产甲烷菌是在缺氧条件下产生甲烷作为代谢副产物的微生物。它们是原核生物，并且属于古细菌域。与水稻相关的常见产甲烷菌属于甲烷鬃菌科、甲烷八叠球菌科、甲烷杆菌目和甲烷微菌目。

根据各种实施方案，可实现水稻植物根部的有机酸分泌，诸如延胡索酸盐分泌和/或苹果酸盐分泌减少。

在一个实施方案中，参与Krebs循环(也称为柠檬酸循环(CAC)或三羧酸循环(TCA))的酶被下调。在具体实施方案中，酶选自由以下组成的组：柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、延胡索酸酶和苹果酸脱氢酶。

因此，在一个实施方案中，修饰水稻植物材料包括下调水稻植物材料中参与Krebs循环的酶。在具体的实施方案中，所述酶优选地选自由以下组成的组：柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、延胡索酸酶和苹果酸脱氢酶。

柠檬酸合酶(E.C.2.3.3.1)催化来自乙酰辅酶A(乙酰CoA)的二碳乙酸残基与一分子四碳草酰乙酸的缩合反应，形成六碳柠檬酸：乙酰CoA+草酰乙酸+H₂O→柠檬酸+CoA-SH。

异柠檬酸脱氢酶(IDH)(EC 1.1.1.42和EC 1.1.1.41)是催化异柠檬酸氧化脱羧，产生阿尔法-酮戊二酸(α-酮戊二酸)和CO₂的酶的酶。

α-酮戊二酸脱氢酶(EC 1.2.4.2、EC 2.3.1.61和EC 1.8.1.4)，也称为酮戊二酸脱氢酶复合物(OGDC)，是催化以下反应的酶复合物：α-酮戊二酸+NAD⁺+CoA→琥珀酰-CoA+CO₂+NADH。该复合物由三个成分组成：酮戊二酸脱羧酶(OGDH)(EC 1.2.4.2)、二氢硫辛酰琥珀酰转移酶(DLST)(EC 2.3.1.61)和二氢硫辛酰脱氢酶(DLD)(EC 1.8.1.4)。

琥珀酸脱氢酶(EC 1.3.5.1)，也称为琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase)(SDH)、琥珀酸辅酶Q还原酶(SQR)或呼吸复合物II，催化琥珀酸氧化为延胡索酸，同时将泛醌还原为泛醇。

延胡索酸酶(EC 4.2.1.2)，也称为延胡索酸酶水合酶，是催化延胡索酸可逆水合/脱水为苹果酸的酶。

苹果酸脱氢酶(MDH)(EC 1.1.1.37)是通过使用NAD⁺至NADH的还原可逆地催化苹果酸氧化为草酰乙酸的酶。

在另一个特定的实施方案中，酶是柠檬酸合酶。

在另一个实施方案中，参与Krebs循环的多种，即至少两种酶(诸如上面提及的酶中的至少两种)被下调。

酶的下调可以在转录水平、翻译水平、后加工水平和/或酶或蛋白质水平进行。

转录水平的下调意味着编码酶的基因的转录相对于无任何下调的在野生型水稻材料中观察到的转录水平被下调。例如，下调可通过用与野生型启动子相比在水稻材料中具有较低活性的较弱启动子替换编码酶的基因的野生型或天然启动子或通过诱导型启动子来实现。此类启动子的非限制性但说明性实例包括植物转录启动子，诸如SUSIBA2启动子和WRI1启动子。在转录水平进行酶下调的替代或额外方式是去除与编码酶的基因的野生型启动子相关联的任何增强子元件的至少一部分，从而降低野生型启动子的活性以及编码酶的基因的转录。

因此，在一个实施方案中，下调酶包括用与基因的启动子相比在水稻植物材料中具有较低活性的启动子替换编码所述酶的基因的启动子。

可通过抑制或干扰编码酶的基因转录后获得的mRNA分子的翻译来实现翻译水平的下调。这种翻译抑制或干扰的典型实例通过使用RNA干扰(RNAi)来实现。RNAi基于使用RNA分子通过中和目标mRNA分子来抑制翻译。此种RNAi可使用与在编码酶的基因转录中获得的mRNA分子互补，从而能够与其碱基配对的RNA分子(诸如微RNA)来实现。

因此，在一个实施方案中，下调酶包括使用RNAi和与信使核糖核酸(mRNA)分子互补，从而能够与其碱基配对的RNA分子干扰所述mRNA分子的翻译，所述mRNA分子在编码酶的基因转录后获得。

加工后水平的下调意味着在如前文所述的从编码酶的基因转录后获得的mRNA分子的翻译到获得存在于水稻细胞中正确位置以催化其相关化学反应的全功能酶的过程中的任何干扰。例如，此种下调可以涉及干扰酶从胞质溶胶(发生翻译的地方)到所述酶在其中催化其相关化学反应的细胞器(诸如线粒体)的转运。下调的另一个实例是对氨基酸序列的翻译后加工(以获得功能性酶)的任何抑制。

在蛋白质或酶水平上的下调可通过添加所述酶的抑制剂来实现，所述酶的抑制剂能够与所述酶结合，从而与所述酶的靶分子竞争，即阻止或至少抑制靶分子与所述酶的结合。酶抑制剂的另一个实例是这样的抑制剂，所述抑制剂能够在与酶分子结合后诱导酶分子的构象状态发生变化，并且其中这种变化导致酶的酶促活性降低。

另一种减少水稻植物的有机酸分泌的方法是筛选植物根部的有机酸分泌(诸如延胡索酸分泌和/或分泌苹果酸分泌)低的水稻植物。这种筛选可在可用的水稻植物当中进行。在另一个实施方案中，可以通过例如甲磺酸乙酯(EMS)诱导的诱变产生具有低有机酸分泌的水稻突变体群体。在这种情况下，可用EMS处理水稻植物的种子，然后种植和选择以建立稳定的水稻种群。然后可监测稳定的水稻种群的根部有机酸分泌，诸如延胡索酸分泌和/或苹果酸分泌，并可选择显示出根部的有机酸分泌相对于野生型水稻减少的水稻种群，并任选地将其进行杂交。

减少水稻植物根部的有机酸分泌(诸如延胡索酸分泌和/或苹果酸分泌)的另一种方法是抑制有机酸(诸如延胡索酸和/或苹果酸)从根部分泌(即将延胡索酸和/或苹果酸从水稻植物根部的细胞中转运出来)。这种抑制可以以与前面论述的酶促下调类似的方式进行。例如，参与将延胡索酸和/或苹果酸从线粒体转运到胞质溶胶和液泡中，然后从水稻根细胞转运到细胞周围环境中的一种或多种蛋白质可被下调。

可以组合任何上面公开的减少有机酸分泌的替代方案。此外，任何上面公开的减少有机酸分泌的替代方案(包括其任何组合)也可与如图11A中所示的和本文中进一步公开的水稻SUSIBA1启动子中的阴转录因子(蔗糖应答区)或其部分的缺失组合。阴转录因子的这种缺失导致碳从根部重新分配到穗中。因此，根中可用于产生有机酸，尤其是延胡索酸的碳较少，从而导致延胡索酸分泌减少。

在一个实施方案中，修饰水稻植物材料包括缺失水稻植物材料中的SUSIBA1启动子中的蔗糖应答区或其部分。

水稻SUSIBA1启动子存在于编码SUSIBA2转录因子的基因组核苷酸序列的野生型版本的内含子中。至少部分蔗糖应答区的不存在意味着任何反式激活因子或复合物都不能高效地与蔗糖应答区结合，从而不能高效地激活SUSIBA1启动子。因此，无论水稻植物材料中的糖水平如何，水稻植物材料中都不会产生SUSIBA1转录因子或仅产生少量SUSIBA1转录因子。水稻植物材料中SUSIBA1转录因子的不存在或低含量反过来意味着SUSIBA2转录因子将在与SUSIBA2启动子(更详细地说是与SUSIBA2启动子中的至少一个W盒)的结合方面胜过SUSIBA1转录因子。这将反过来导致SUSIBA2启动子的激活和SUSIBA2转录因子在水稻植物材料中的进一步产生。水稻植物材料中高水平的SUSIBA2转录因子和低水平的SUSIBA1转录因子诱导水稻植物材料中的上述碳重新分配。关于水稻SUSIBA1和SUSIBA2基因、启动子及其转录因子的更多信息，参考WO 2018/182493，其教导据此通过引用并入。

本发明的另一方面涉及减少稻田甲烷排放的方法。所述方法包括缺失水稻植物材料中的SUSIBA1启动子中的蔗糖应答区。所述方法还包括在稻田中栽培水稻植物材料或获自所述水稻植物材料的水稻植物。

本发明的另一方面涉及减少稻田甲烷排放的方法。所述方法包括将碳从水稻植物的根部重新分配到水稻植物的穗中。所述方法还包括在稻田中栽培水稻植物。在该实施方案中，碳的重新分配导致根部的有机酸产生和分泌减少，从而导致稻田中的与根部结合的土壤中存在的产甲烷菌的甲烷排放减少。

在一个实施方案中，“水稻植物材料”是水稻植物。在另一个实施方案中，水稻植物材料是水稻细胞，包括多个此类水稻细胞。在进一步的实施方案中，水稻植物材料是水稻植物组织或器官，包括但不限于表皮；地面组织；维管组织，诸如木质部或韧皮部；分生组织，诸如顶端分生组织、侧生分生组织或居间分生组织；永久性组织，诸如单纯永久性组织(simple permanent tissue)，包括例如薄壁组织、厚角组织、厚壁组织或表皮、复杂的永久性组织，包括例如木质部、韧皮部或者专用或分泌组织。在又一个实施方案中，水稻植物材料是水稻种子。

在一个实施方案中，水稻植物材料不是野生稻的植物材料。因此，水稻植物材料优选为栽培稻的植物材料。在一个实施方案中，水稻植物材料是水稻(oryza sativa)植物材料或光稃稻(Oryza glaberrima)植物材料。

如本文中所用，“有机酸分泌的减少”，诸如延胡索酸分泌的减少，表示与相应的对照或野生型水稻植物相比根据所述实施方案的水稻植物的根部的有机酸(诸如延胡索酸)分泌显著减少。在各种实施方案中，根据实施方案的水稻植物的根部分泌的有机酸诸如延胡索酸的量可以等于或小于90％，优选等于或小于85％，等于或小于80％，等于或小于75％，等于或小于70％，等于或小于65％，等于或小于60％，等于或少于55％、等于或少于50％、等于或少于45％、等于或少于40％、等于或少于35％、等于或少于30％、等于或少于25％、等于或少于20％、等于或少于15％、等于或少于10％、甚至等于或少于5％的对照或野生型水稻植物的根部分泌的有机酸诸如延胡索酸的量。

在一个特定的实施方案中，根据实施方案的水稻植物的根部分泌的延胡索酸盐的量比水稻品种日本晴的根部分泌的延胡索酸的量少2.5至5.0倍。

实施例

实施例1

SUSIBA2水稻(Su等人(2015))是低甲烷水稻，其产生超过50％的饱满谷粒数，其中谷粒中的淀粉含量从77％升高到86％。重要的是，SUSIBA2水稻显著减少了稻田的甲烷排放，这与产甲烷菌的生长显著减少相关联。然而，水稻甲烷减少背后的机制尚不清楚。在这些实施例中，核糖核酸(RNA)测序(RNAseq)、微生物脱氧核糖核酸(DNA)测序(DNAseq)、核磁共振(NMR)、定量聚合酶链式反应(qPCR)和气相色谱(GC)用于监测SUSIBA2水稻与产甲烷菌之间的相互作用。结果表明，SUSIBA2水稻与产甲烷菌之间的相互作用是有机酸，主要是由SUIBA2水稻分泌的延胡索酸。在水稻栽培过程中，SUSIBA2水稻从第6周左右开始通过减少根系生长从而为产甲烷菌提供更少的物理栖息地，并通过分泌更少的延胡索酸来减少甲烷排放，所述延胡索酸可以转化为用于产甲烷菌生长的底物。

材料和方法

植物材料和生长条件

日本晴(Oryza sativa L.ssp.Japonica)(在本文中缩写为Nipp)品种的水稻植物和SUSIBA2水稻按照Su等人(2015)进行栽培。

RNAseq

按照Su等人(2015)进行总RNA分离。用于RNA分离的根样品来自如图1中指示的第6周的水平位置1(H.Position 1)或垂直位置1(V.Position 1)。在SciLifeLab,BMC,UppsalaUniversity进行RNAseq和生物信息学。

微生物DNAseq

从植物人工气候室水稻土壤和稻田土壤中分离微生物DNA是按照Su等人(2015)进行的。在BMC,Uppsala University进行DNAseq。

NMR

用于NMR分析的样品来自水稻栽培期间不同时间点的垂直位置1-3(图1)。按照Coulomb等人(2015)和Rohnisch等人(2018)进行样品制备和NMR分析。

qPCR

以与Su等人(2015)中所述相同的方式对产甲烷菌测定和水稻基因表达进行定量PCR。

GC分析

按照Su等人(2015)进行确定甲烷浓度的气相色谱分析。

结果

在植物人工气候室条件下栽培SUSIBA2水稻和对照水稻日本晴(Nipp)，并在第4周、第6周、第8周、第13周和成熟阶段在栽培期间进行跟踪(图1)。对来自水稻根际区域不同空间位点(即，水平位置1-3和垂直位置1-3)的样品进行了各种实验，以分析SUSIBA2水稻与产甲烷菌之间的相互作用。

根表型分型

在水稻栽培期间跟踪了水稻根的形态学变化。在种植后第4周，SUSIBA2水稻的根系尺寸与野生型对照日本晴相同或比其略大(图2)。有趣的是，第6周后SUSIBA2水稻的根比日本晴生长得更慢，并在第7周变得明显小于日本晴(图2B)。在第7周后，由于根系尺寸较大，很难跟踪根系尺寸发育，但SUSIBA2水稻的根系尺寸比日本晴小。

甲烷排放

在水稻栽培过程中测量了甲烷排放。第6周后，与野生型对照水稻日本晴相比，SUSIBA2水稻的甲烷排放显著减少(图3)。

产甲烷菌测定

根据Edwards等人(2015)的方案，水稻根和根际区域的土壤分为四个部分：土壤、根际、根面和内圈(图4A)。产甲烷菌测定表明，在所有四个部分中，SUSIBA2水稻中的七个组中的产甲烷菌均少于日本晴中的产甲烷菌(图4B、图5和图6)。有趣的是，作为稻田中对于甲烷排放最重要或主要的产甲烷菌的除MET和Met外的微生物群在根际和内圈的部分中无法被检测到。水稻栽培过程中的垂直位置的检查表明，从种植后第4周开始，在所有深度上，SUSIBA2水稻的7个群中的产甲烷菌均少于日本晴中的产甲烷菌(图7)。

根系分泌物的NMR分析

通过NMR分析对来自SUSIBA2水稻和日本晴的根系分泌物进行了分析。水稻根系分泌物之间的延胡索酸的量存在显著差异(图8)。从第6周开始，日本晴水稻比SUSIBA2水稻分泌更多的延胡索酸。分泌的延胡索酸可以转化为底物，用于在根际周围繁殖产甲烷菌。

水稻根转录组的RNAseq分析

RNAseq分析用于检测SUSIBA2水稻根中600个被显著(P<0.05)上调的基因和889个被下调的基因(9A)。在被下调的基因当中，检查了所有延胡索酸合成相关基因。显著下调的基因之一是编码柠檬酸合酶(E.C.2.3.3.1)(Krebs循环的一种限速酶)的基因(图9B)。

水稻根际周围的微生物的DNAseq

DNAseq结果表明对不同水稻品种之间的总群落组成影响不大，说明了SUSIBA2水稻没有引起土壤微生物群落的任何重大变化。植物人工气候室样品与田间样品之间的主要差异实际上已经显示出来。结果还表明，产甲烷菌相对于细菌群落的总相对丰度非常低，低于1％，这是该类型群落的正常情况。产甲烷菌仍然占古菌群落的60％。此外，与qPCR分析一致，与日本晴水稻相比，SUSIBA2水稻的产甲烷菌的相对丰度显著较低(图10)。

结论

实验表明，SUSIBA2水稻与产甲烷菌之间的相互作用是有机酸，并且主要是延胡索酸。如在SUSIBA2水稻中观察到的甲烷排放减少是由于种植后第6周左右延胡索酸的该分泌减少所致。分泌的延胡索酸可被转化为用于产甲烷菌繁殖的底物。因此，延胡索酸分泌的减少减少了产甲烷菌的底物量。此外，在种植后第6周左右，SUSIBA2水稻开始减少根系的生长，从而为产甲烷菌的生长提供更少的物理栖息地。

实施例2

从地下生物质到地上生物质的碳分配可用于减少地下根部的延胡索酸分泌，这限制了水稻根际中产甲烷群落的生长。

材料和方法

成簇的规律间隔性短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)的缺失在Biogle Genome Editing Center,China进行，以缺失日本晴水稻的水稻SUSIBA1启动子中的阴转录因子(蔗糖应答区)(Lu等人(2017)；Jin等人(2017))。按照Jin等人(2017)进行了相关基因表达的qPCR分析。

结果

利用CRISPR/Cas技术成功地缺失了水稻中的阴阳系统中的阴转录因子(蔗糖应答区)(Jin等人(2017))，以获得更大的穗(图11)。穗尺寸增加意味着更多的碳被重新分配到穗，这继而导致从地下根部到延胡索酸部分的碳更少。当SUSIBA2水稻和日本晴水稻用延胡索酸处理时，所有产甲烷菌群均繁殖(图12)，表明延胡索酸可以转化为用于产甲烷菌生长的底物。

在RNAseq实验(图9)中，由于日本晴基因组序列数据库中缺乏注释，仅发现编码柠檬酸合酶的基因被下调，而未发现Krebs循环中其它酶的基因。当使用qPCR分析两种其它限速酶(异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶)的基因以及延胡索酸积累中的关键酶的基因时，所有所分析的基因在SUSIBA2水稻根中均被下调，表明这些基因可被用作用于筛选低根延胡索酸水稻的探针。

实施例3

地杆菌属(Geobacter)物种对环境很重要，部分原因是它们能够通过还原细胞外电子受体(诸如Fe(III)和Mn(IV)氧化物、腐殖质、U(VI)和石墨电极)来厌氧地氧化乙酸。一些地杆菌属物种，包括硫还原地杆菌，也能够使用三羧酸(TCA)循环中间体延胡索酸作为电子受体以及使用乙酸作为供体。已经证明硫还原地杆菌只有一种酶FrdCAB，其在体内作为延胡索酸还原酶起作用。

材料和方法

下午3点从植物人工气候室收集来自日本晴(Nipp)和SUSIBA2的四株独立植物的距离上相5cm的近端区域处(图1中的垂直位置1)的根部的根际部分的样品，然后将样品用于使用用于土壤生物的DNA分离试剂盒(用于土壤的FastDNA SPIN试剂盒；MPBiomedicals,LLC)分离土壤DNA。然后对DNA进行定量并调整为相同的浓度。使用硫还原地杆菌的经克隆的16S rRNA基因片段的标准品，利用引物G.Sulf923F:TGACATCCACGGAACCCTCC(SEQ ID NO:1)；G.Sulf1399R:GACGCTGCCTCCATTGCTG(SEQ ID NO:2)进行qPCR定量。计算硫还原地杆菌的丰度并将其转化为每克干土壤样品的DNA拷贝数。用于硫还原地杆菌的qPCR程序如下：95℃7分钟，然后40个循环：95℃10秒、60℃40秒以及72℃40秒。所有解链曲线都是从55℃至95℃，每秒升高0.05℃。

结果

qPCR分析表明，日本晴根中的与根际部分(参见图4A)相缔合的地杆菌属的组，即硫还原地杆菌比SUSIBA2水稻中的显著更多(图14)。这意味着日本晴水稻比SUSIBA2水稻分泌更多的延胡索酸，这导致更多的硫还原地杆菌为产甲烷菌生成乙酸。因此，与SUSIBA2水稻相比，对照日本晴水稻分泌更多的延胡索酸，这刺激硫还原地杆菌产生更多的乙酸。更多的乙酸(作为产甲烷底物)富集产甲烷菌以释放更多的甲烷。

上文描述的实施方案应被理解为是本发明的几个说明性实例。本领域的技术人员应当理解，可以在不背离本发明的范围的情况下对实施方案做出各种修改、组合和变化。具体地说，在技术上可行的情况下，不同实施方案中的不同的局部解决方案可组合在其它配置中。

参考文献

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Edwards et al.(2015)Structure,variation,and assembly of the root-associated microbiomes of rice,The Proceedings of the Nationa/ Academy ofSciences of the United States of America 112：E911-E920

Lu et al.(2017)Genome-wide Targeted Mutagenesis in Rice Using theCRISPR/Cas9 System,Molecular Plant 10：1242-1245

Jin et al.(2017)A Dual-Promoter Gene Orchestrates the Sucrose-Coordinated Synthesis of Starch and Fructan in Barley，Molecular Plant 10：1556-1570

Rohnisch et al.(2018)A QuA：An Automated Quantification Algorithm forHigh-Throughput NMR-Based Metabolomics and lts Application in Human Plasma，Analytical Chemistry 90：2095-2102

Su et al.(2015)Expression of barley SUSIBA2 transcription factoryields high-starch low-methane rice，Nature 523：602-606

序列表

<110> 孙传信(SUN, Chuanxin)

<120> 低甲烷水稻

<130> HSJ102768P.WOP

<150> US 62/825,626

<151> 2019-03-28

<160> 2

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列( Artificial Sequence)

<220>

<223> 正向qPCR引物

<400> 1

tgacatccac ggaaccctcc 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列( Artificial Sequence)

<220>

<223> 反向qPCR引物

<400> 2

gacgctgcct ccattgctg 19