具体实施方式

本发明提供了所述具有豇豆蚜杀虫活性的柚子油的制备方法，包括以下步骤：

1)将柚子籽剪碎，用体积浓度85％～100％的乙醇水溶液浸泡，将所得浸泡液加热回流提取，得到提取液；

2)去除所述提取液的溶剂，得到浸膏；

3)将所述浸膏用水悬浮，得到的浸膏悬浮水溶液用石油醚萃取，收集石油醚层，去除溶剂，得到柚子油。

本发明将柚子籽剪碎，用体积浓度85％～100％的乙醇水溶液浸泡，将所得浸泡液加热回流提取，得到提取液。

本发明对柚子籽的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的柚子种类的柚子籽即可。在本发明实施例中，所述柚子籽为沙田柚柚子籽。所述柚子籽优选为风干的柚子籽。所述风干的柚子籽的含水率不高于5％。本发明对所述柚子籽的剪碎程度没有特殊限制，采用本领域所熟知的剪碎程度即可，例如剪碎后的柚子籽的粒径不大于3mm。

在本发明中，所述乙醇水溶液的体积浓度优选为90％～95％，更优选为95％。所述柚子籽和乙醇水溶液的料液比为1g：(1～1.25)ml。所述浸泡的时间优选为10～14h，更优选为12h。本发明对所述浸泡的温度没有特殊限制，采用本领域所熟知的浸泡的温度即可，例如室温。所述加热回流的温度优选为78～82℃，更优选为80℃。所述加热回流的时间优选为1.5～3h，更优选为2～2.5h。

在本发明中，浸泡后的柚子籽优选再次用体积浓度85％～100％的乙醇水溶液浸泡，所得浸泡液加热回流提取，所得提取液合并。所述浸泡和加热回流的方案与上述一致，在此不做赘述。

得到提取液后，本发明去除所述提取液的溶剂，得到浸膏。

在本发明中，所述去除所述浸出液的溶剂方法优选包括减压浓缩。本发明对所述浓缩的方案没有特殊限制，采用本领域所熟知的浓缩方案即可，例如减压浓缩。所述减压浓缩的压力为0.1Mpa，所述减压浓缩的温度优选为42～47℃，更优选为45℃。所述减压浓缩的时间为3～5h，更优选为4h。

得到浸膏后，本发明将所述浸膏用水悬浮，得到的浸膏水悬浮溶液用石油醚萃取，收集石油醚层，去除溶剂，得到柚子油。

本发明对水的加入量没有特殊限制，以充分混匀浸膏为宜。在本发明实施例中，90g的浸膏用800mL的水溶解。所述浸膏水溶液和石油醚的体积比为1:(0.9～1.1)，更优选为1:1。本发明对所述萃取的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的萃取方法即可。所述去除溶剂的方法优选包括减压浓缩本发明对所述浓缩的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的浓缩方案即可，例如减压浓缩。所述减压浓缩的压力为0.1Mpa，所述减压浓缩的温度优选为42～47℃，更优选为45℃。所述减压浓缩的时间为3～5h，更优选为4h。

采用本发明提供的制备方法，所述柚子油的得率为4.9％以上(按照干柚子籽重量计算)。将制备的柚子油采用GC-MS法测定，气相色谱检测条件：载气：高纯氦气；色谱柱：HP-5(30.00m×0.25mm×0.25μm)；柱温：80℃；程序升温：以4℃/min的速度从80℃升到280℃(50min)，在280℃时保持7分钟(57min)；不分流；载气流速：1mL/min；进样量：1μL。质谱检测条件：离子源：EI；质量扫描范围:40-550amu；离子源温度：230℃。称取2mg柚子籽PE相加入0.5mL正戊烷溶解于样品瓶中，按照以上气相色谱和质谱的测定条件设定方法测定。检测结果表明，所述柚子油包括以下活性成分：D-柠檬烯、(E)﹣2﹣癸烯醛、(E,Z)﹣2,4﹣癸二烯醛、(Z,Z)﹣2,4﹣癸二烯醛、十四烯、β﹣石竹烯、雅榄蓝烯、十六烯、(Z,E)﹣6，9﹣十七二烯、8﹣十七烷烯、十八烯、圆柚酮、植酮、棕榈酸甲酯、棕榈酸、棕榈酸乙酯、亚油酸甲酯、10﹣十八烯酸甲酯、亚油酸、亚油酸乙酯和油酸乙酯。本发明所述柚子油优选包括以下质量含量的活性成分：22.86％D-柠檬烯、1.18％(E)﹣2﹣癸烯醛、7.77％(E,Z)﹣2,4﹣癸二烯醛、12.40％(Z,Z)﹣2,4﹣癸二烯醛、0.64％十四烯、1.47％β﹣石竹烯、3.38％雅榄蓝烯、0.65％十六烯、1.28％(Z,E)﹣6,9﹣十七二烯、0.83％8﹣十七烷烯、0.71％十八烯、1.18％圆柚酮、0.71％植酮、1.11％棕榈酸甲酯、15.79％棕榈酸、2.42％棕榈酸乙酯、1.05％亚油酸甲酯、0.52％10﹣十八烯酸甲酯、20.21％亚油酸、1.88％亚油酸乙酯和1.97％油酸乙酯。

本发明提供了一种适用豇豆蚜的杀虫剂，以所述柚子油或所述制备方法制备得到的柚子油为活性成分。与空白对照组相比，低剂量(0.25μg/aphid)的柚子油即可实现杀灭豇豆蚜的作用，高剂量(2.5μg/aphid)的柚子油或杀虫剂在作用12h时杀虫率达到60％，持续作用72h，杀虫率逐渐增高，最高达到100％。

本发明对所述杀虫剂的剂型没有特殊限制，采用本领域所熟知的杀虫剂的剂型即可，例如，乳化剂。所述柚子油乳化剂中乳化剂的种类包括吐温80或吐温20。在本发明实施例中，所述乳化剂优选为含体积浓度0.1％吐温80-柚子油乳化剂。本发明对所述杀虫剂的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的杀虫剂制备方案即可。

本发明提供了所述柚子油或所述适用豇豆蚜的杀虫剂在防治豇豆蚜中的应用。实验表明，与空白对照组相比，柚子油或杀虫剂给药12h即可显著性提高杀虫效率，且药物作用72h时杀虫效果最佳。

本发明提供了所述柚子油或所述适用豇豆蚜的杀虫剂在降低蚜虫蛋白酶活性中的应用。所述蚜虫蛋白酶优选包括乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肽硫转移酶和过氧化物酶。试验表明，柚子油或杀虫剂作用豇豆蚜24h时对乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肽硫转移酶和过氧化物酶的活性影响最大，且酶活性的变化与剂量呈正相关。

下面结合实施例对本发明提供的一种具有豇豆蚜杀虫活性的柚子油及其杀虫剂和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

柚子油的制备方法

1、材料种类及来源：

柑橘属芸香科沙田柚于2019年9月从江西省赣州市南康区一个果园采摘，然后将其果皮、果肉去掉，挑选柚子籽，再将柚子籽自然风干后称重为502.395g再用剪刀剪碎，储藏于4℃冰箱备用。

2、柚子油的提取流程：

总浸膏的提取：将已剪碎的柚子籽250g放入1000mL圆底烧瓶中加入300mL 95％的乙醇水溶液浸泡一晚，然后80℃加热回流2h，倒出提取液于一个干净圆底烧瓶里用旋转蒸发仪在45℃下减压浓缩至乙醇全部去除，得到浸膏。再向已经回流一次的柚子籽里加入300mL 95％乙醇水溶液，回流2h后，将浸出液减压浓缩后得到浸膏，剩下的柚子籽也同样操作，得到总浸膏90.7282g(即粗提物)。

总浸膏的萃取：将提取的总浸膏倒入2000mL烧杯中加入800mL蒸馏水，用力搅拌至均匀悬浮液状态，然后将其倒入2000mL分液漏斗中，再加入等量(V_水溶液:V_石油醚＝1:1)的石油醚萃取，快速振荡后静置6h，待分层后，下层液体放出，上层石油醚有机相从上端倒出，下层水溶液继续用石油醚萃取两次，上层石油醚萃取相倒入圆底烧瓶用旋转蒸发仪减压浓缩去除溶剂后，即得到柚子籽油24.7082g。

将制备的柚子籽油采用GC-MS法测定，具体内容如下：

1)气相色谱检测条件

使用安捷伦7890B气相色谱仪和安捷伦质量检测器(安捷伦科技公司，加州SantaClara，USA)；载气：高纯氦气；色谱柱：HP-5(30.00m×0.25mm×0.25μm)；柱温：以每分钟4℃速度从80℃升到280℃(50min)，在280℃时保持7分钟(57min)；不分流；载气流速：1mL/min；进样量：1μL。

2)质谱检测条件

离子源：EI；扫描范围:40-550；离子源温度：230℃。

称取2mg柚子油加入0.5mL正戊烷溶解于样品瓶中，按照以上气相色谱和质谱的测定条件设定方法进行测定。然后将0.1mL C7–C40正构烷烃混合物溶解到0.5mL正戊烷中，用GC-MS设备并在上述相同条件下进行分析。最后通过NITS(NIST，2010年版，美国商务部，美国马里兰州盖瑟斯堡)对柚子油的成分进行了鉴定，运用科瓦茨指数(Kovats index)公式I，计算出实际保留指数(RI)，并结合文献比较分析。

RI＝100Z+100[TR(x)-TR(z)]/[TR(z+1)-TR(z)] 公式I

其中，Z和Z+1分别为目标化合物(X)流出前后的正构烷烃所含碳原子的数目，TR(x)表示目标化合物x保留时间，TR(z)表示目标化合物x流出前的正构烷烃的保留时间，TR(z+1)表示目标化合物x流出后的正构烷烃的保留时间)。

GC-MS测定图谱见图1。从GC﹣MS检测图谱可以看出：南康甜柚籽的PE相中含有21个特征明显峰，说明含有21个不同的有机化合物，通过计算保留指数与文献对比和NIST﹣MS检索确定化合物的结构，其化合物分别是D-柠檬烯、(E)﹣2﹣癸烯醛、(E,Z)﹣2,4﹣癸二烯醛、(Z,Z)﹣2,4﹣癸二烯醛、十四烯、β﹣石竹烯、雅榄蓝烯、十六烯、(Z,E)﹣6，9﹣十七二烯、8﹣十七烷烯、十八烯、圆柚酮、植酮、棕榈酸甲酯、棕榈酸、棕榈酸乙酯、亚油酸甲酯、10﹣十八烯酸甲酯、亚油酸、亚油酸乙酯、油酸乙酯。其中D﹣柠檬烯、(Z,Z)﹣2,4﹣癸二烯醛、棕榈酸、亚油酸含量较高(相对含量达10％以上)，其他成分含量相对较少，具体信息见表1。

表1本发明制备的柚子油活性成分信息

实施例2

柚子油的制备方法

1、材料种类及来源：

柑橘属芸香科沙田柚于2019年9月从江西省赣州市南康区一个果园采摘，然后将其果皮、果肉去掉，挑选柚子籽，再将柚子籽自然风干后称重为502.395g再用剪刀剪碎，储藏于4℃冰箱备用。

2、柚子油的提取流程：

总浸膏的提取：将已剪碎的柚子籽30g放入100mL圆底烧瓶中加入35mL 90％的乙醇水溶液浸泡一晚，然后82℃加热回流2.5h，倒出浸出液于一个干净圆底烧瓶里用旋转蒸发仪在45℃下减压浓缩至乙醇全部取出，得到浸膏。再向已经回流一次的柚子籽里加入30mL 90％乙醇水溶液，回流2h后，将浸出液减压浓缩后得到浸膏，剩下的柚子籽也同样操作，得到总浸膏9.813g(即粗提物)。

总浸膏的萃取：将提取的总浸膏倒入200mL烧杯中加入80mL蒸馏水，用力搅拌至水溶液状态，然后将其倒入200mL分液漏斗中，再加入等量(V_水溶液:V_石油醚＝1:1)的石油醚萃取，快速振荡后静置7h，待分层后，下层液体放出，上层石油醚有机相从上端倒出，下层水溶液继续用石油醚萃取两次，上层石油醚萃取相倒入圆底烧瓶用旋转蒸发仪减压浓缩去除溶剂后，即得到柚子籽油2.4812g。采用实施例1的测定方法，对所述柚子籽油进行活性成分测定，结果同实施例1，包含21种同样化合物。

实施例3

豇豆蚜柚子油乳化剂的制备方法

将实施例1制备的柚子油配制成杀虫剂，先用移液枪吸取9.9mL柚子油于20mL玻璃瓶中，再加入0.1mL的吐温-80乳化剂后超声溶解(超声温度为：25℃，时间为10min)，配成1％吐温80-柚子油乳化剂。

实施例4

豇豆蚜触杀活性的测定

试验采用微量点滴法测定了柚子油对豇豆蚜(成虫，采集于赣南师范大学校内菜园)触杀活性，先称取柚子油50mg，将其用1％的吐温﹣80溶解并且稀释成不同浓度梯度(50mg/mL、40mg/mL、20mg/mL、10mg/mL、5mg/mL)制成杀虫剂，用微量点滴仪将0.05μL药液(对照组用1％吐温﹣80)滴在豇豆蚜的前胸背板上，每个浓度点滴30只供试豇豆蚜，平行重复3次，点滴完成后用毛笔转接至装有新鲜豆角的培养皿中(内垫直径为12.5cm的滤纸，并加少量蒸馏水保湿)置于温度25±2℃、相对湿度70±5％、光照时间L：D＝14h：10h的光照培养箱内喂养。于药后12h、24h、48h和72h观察结果，在解剖镜下用软毛笔轻触豇豆蚜虫体，不动者和不能正常反应者视为死亡，同时按照公式II计算其校正死亡率。

死亡率(％)＝死亡虫数/供试虫数×100 公式II。

结果见图2。结果表明，杀虫剂对豇豆蚜的触杀活性比较明显，而且随着试药浓度越大作用时间越长死亡率越高，则杀虫效果越好，到72h时，死亡率已达80％以上。

实施例5

豇豆蚜胃毒活性的测定

试验采用叶碟法测定柚子油对豇豆蚜(成虫)胃毒活性，先将新鲜豆角分别放入已配制的杀虫剂(50mg/mL、40mg/mL、20mg/mL、10mg/mL、5mg/mL)中浸5s后取出，自然风干，放入装有滤纸(蒸馏水保湿)的培养皿(直径为12.5cm)中。然后将饥饿12h后的豇豆蚜放入培养皿中，每皿放30头，试验3次重复。以1％吐温80-H₂O为对照组，用相同方法处理对照组，在12h、24h、36h、48h、72h后记录豇豆蚜的死亡情况，并按照公式III计算其校正死亡率。

死亡率(％)＝死亡虫数/供试虫数×100 公式III

结果见图3。实验结果表明，PE相对豇豆蚜效果比较明显，刚开始作用时间短效果不明显，作用时间越长，可能试药到达胃部导致蚜虫死亡，随试药浓度增大，死亡率也增加。可见，不管是通过触杀还是胃毒方式，柚子油杀虫剂都对豇豆蚜有良好的杀虫效果。

实施例6

柚子油的杀虫机理研究

1.酶液的制备：采用微量点滴法将浓度为LD30(1.10μg/mL)、LD50(1.75μg/mL)的药液分别处理大小一致的无翅豇豆蚜(成虫)，对照组用1％吐温80处理，然后用毛笔将处理过的蚜虫转至装有新鲜豆角的培养皿中，分别在4h、8h、12h、24h后，称取11mg存活的蚜虫,再将蚜虫放入预冷的研钵中，加入NaH₂PO₄﹣Na₂HPO₄缓冲溶液(0.01mol/L，pH＝7.4),在冰浴中匀浆，然后将匀浆液在4℃、4000r/min离心10min后，取上清液作为酶液。该酶液用于测定蚜虫体内总蛋白含量的测定、乙酰胆碱酯酶活性的测定、谷胱甘肽-S-转移酶的测定和过氧化物活性的测定。

2.豇豆蚜体内蛋白的测定

用考马斯亮蓝法测定蚜虫体内总蛋白质含量，先称取0.01g牛血清蛋白加入5mLPBS(0.01mol/L,pH＝7.4)溶解配制成母液，再将母液用PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)稀释成不同浓度(1mg/mL、0.8mg/mL、0.6mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL)。在96孔板中分别加入270μL0.01％考马斯亮蓝G-250和10μL不同浓度的牛血清蛋白，25℃下温育5min,然后立即在酶标仪下595nm、25℃下测定OD值。根据不同牛血清蛋白的浓度与OD值制作标准曲线，再用相同方法测定蚜虫体内蛋白质含量。

3.豇豆蚜体内乙酰胆碱酯酶(AchE)活性测定

配制底物碘化乙酰硫代胆碱(AchE)浓度为0.02mol/L，显色剂5,5'﹣二硫代双2﹣硝基苯甲酸(DTNB)浓度为0.001mol/L，在96孔板中依次加入50μL酶液、150μL底物和50μL显色剂，立即用酶标仪在30℃、415nm下每间隔30s测定一次，共测定30min。对照组用50μL对照酶(用1％吐温80处理蚜虫的体内酶)代替50μL实验组酶，空白对照组用50μL、0.04mol/LPBS缓冲液(pH＝8)代替50μL酶，酶活力用20分钟内OD值的变化来表示，即：酶活力＝ΔOD/20min。

4.豇豆蚜体内谷胱甘肽-硫-转移酶(GST)酶活性测定

配制底物谷胱甘肽(GSH)浓度6mmol/L,显色剂1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)浓度为1.2mmol/L(先称取0.0242gCDNB用1mL无水乙醇溶解，然后用0.1mol/L、pH＝7.6的PBS稀释至1.2mmol/L)。在96孔板中依次加入10μL酶液、100μL谷胱甘肽(GSH)和100μL1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)，迅速用酶标仪在30℃、340nm下每间隔30s测定一次OD值，共测定30min。对照组用10μL对照酶(用1％吐温80处理蚜虫的体内酶)代替10μL实验组酶，其他试剂用量相同，酶活力用20分钟内OD值的变化表示，即：酶活力＝ΔOD/20min。

5.豇豆蚜过氧化物酶(POD)活性测定

取300μL分析纯的愈创木酚于烧杯中加入50mLNaH₂PO₄﹣Na₂HPO₄缓冲溶液(0.05mol/L，pH＝6.4)后放在磁力搅拌器上加热至愈创木酚完全溶解，再加入50μL磷酸缓冲溶液配制成0.3％的愈创木酚，配制0.3％的H₂O₂(用0.05mol/L,pH＝6.4的磷酸缓冲溶液溶解)。在96孔板中依次加入50μL酶液、150μL0.3％的愈创木酚和50μL0.3％的过氧化氢(H₂O₂)，迅速用酶标仪在30℃、470nm下每间隔30s测定一次OD值，共测定30min。对照组用50μL对照酶(用1％吐温80处理蚜虫的体内酶)代替50μL实验组酶，其他试剂用量相同，过氧化物酶活力用20分钟内OD值的变化表示,即：酶活力＝ΔOD/20min。

豇豆蚜体内总蛋白的测定结果见图4。从图4可以看出：用杀虫剂处理过的豇豆蚜体内总蛋白含量总体比对照组总蛋白含量低，而且总蛋白含量随用药浓度增大而减少，到24h时实验组总蛋白含量都比对照组低很多且当用药浓度为LD₅₀(1.75μg/只)时，总蛋白含量减少的最多。

豇豆蚜体内乙酰胆碱酯酶活性的测定结果见图5。用杀虫剂处理过的豇豆蚜体内乙酰胆碱酯酶活性均比对照组低，实验组体内酶活性先上升后降低变化趋势，但总体还是低于对照组酶活性。到24h时实验组的乙酰胆碱酯酶活性降低的最多，而且试药浓度越大乙酰胆碱酯酶活性降低得越多。

豇豆蚜体内谷胱甘肽-硫-转移酶活性的测定结果见图6。从图6中能看出谷胱甘肽硫转移酶整体随时间变化酶活力降低，开始作用时间短，酶活力变化不明显，当试药浓度为1.75μg/mL作用时间达到24h时酶活降低得非常显著，说明PE相对谷胱甘肽硫转移酶的影响很大。

豇豆蚜体内过氧化物酶活性测定结果见图7。从图7中可以看出，随着时间的增加，低浓度试药1.10μg/mL作用时，随着作用时间的增加，过氧化物酶活力逐渐降低，至24h时酶活力降至最低。而高浓度试药1.75μg/mL处理时，作用4h后过氧化物酶活力可能已经降至最低，高浓度试药作用时间短，酶活力抑制效果明显。

可以看出，本发明制备的柚子油杀虫机理为通过降低豇豆蚜体内乙酰胆碱酯酶、过氧化物酶、谷胱甘肽硫转移酶活性，从而降低豇豆蚜体内总蛋白含量，进而达到杀虫目的。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。