一种用于改善骨性关节炎的组合物、制剂及其制备方法
阅读说明：本技术 一种用于改善骨性关节炎的组合物、制剂及其制备方法 (Composition and preparation for improving osteoarthritis and preparation method thereof ) 是由 李爱民 吴晓磊 赵芳 李永强 赵明明 李颖 邢岩 于 2021-07-16 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种用于改善骨性关节炎的组合物、制剂及其制备方法,该组合物由以下重量份的原料制成：雨生红球藻粉2-50份、姜黄1-25份、水解II型胶原蛋白1-25份。所述制剂含有该组合物以及药学可接受的辅料,所述辅料为40-120份选自异麦芽酮糖醇、乳糖、玫瑰茄粉、无水柠檬酸、甜菊糖苷和三氯蔗糖中的一种或多种。本发明还提供了所述制剂的制备方法和用途。本发明的组合物及该组合物制成的制剂为天然原料,经科学配伍,具有消炎镇痛、改善关节肿胀、促进软骨再生、修复机械性炎症损伤、改善运动行为的功效。(The invention provides a composition for improving osteoarthritis, a preparation and a preparation method thereof, wherein the composition is prepared from the following raw materials in parts by weight: 2-50 parts of haematococcus pluvialis powder, 1-25 parts of turmeric and 1-25 parts of hydrolyzed II type collagen. The preparation contains the composition and pharmaceutically acceptable auxiliary materials, wherein the auxiliary materials comprise 40-120 parts of one or more selected from isomalt, lactose, roselle powder, anhydrous citric acid, stevioside and sucralose. The invention also provides a preparation method and application of the preparation. The composition and the preparation prepared from the composition are natural raw materials, and have the effects of diminishing inflammation, easing pain, improving joint swelling, promoting cartilage regeneration, repairing mechanical inflammation injury and improving sports behaviors through scientific compatibility.)
技术领域
本发明属于保健食品
技术领域
，具体涉及一种用于改善骨性关节炎的组合物及其应用。背景技术
骨性关节炎又称退行性骨关节病，是一种慢性骨科疾病，常见于中老年人，病变部位常见于手、膝、髋、足和脊柱，临床表现主要为局部红肿热痛及功能障碍、关节疼痛、肿胀、变形等。骨性关节炎的发病与地域和种族无关，与年龄、肥胖、炎症、创伤及遗传因素等均可能有联系，根据不同致病机理，形成了自由基学说、基因学说、慢性炎症学说、肥胖致病学说等。据统计，我国65岁以上中老年人群中约80％患有骨性关节炎，该病的发生率随年龄的增长而升高，尤其多见于肥胖的老年人。随着人口老龄化，关节炎发病率逐年上升，仅次于心脏病，被称为“不死的癌症”，是严重影响中老年人身体健康及生活质量的医学问题和社会问题。
目前，临床上主要采用非手术疗法和手术疗法两种手段。非手术疗法包括以抗炎止痛消炎、润滑营养关节为主的西医药物治疗，此外还有中医内服和外用治疗、针灸治疗、推拿治疗、针刀治疗、体育疗法及中西医综合治疗等多种疗法。手术疗法包括关节成形术，截骨术和人工关节表面置换术等。近年来，非手术疗法和手术疗法治疗骨性关节炎虽有所进展，但存在着治疗费用高、副作用明显、创伤大、患者痛苦、诊疗周期长且疗效差等问题。因此，急需开发一款功能食品来代替药品，以日常保养辅助治疗，来满足中老年人群缓解关节肿胀、疼痛的需求。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于改善骨性关节炎的组合物及其应用。该组合物选自天然原料，科学配伍，通过动物实验表明该组合物具有降低关节肿胀度、促进软骨再生、修复机械性损伤炎症、改善运动和缓解疼痛作用。
具体来说，本发明提供了如下技术方案。
一种用于改善骨性关节炎的组合物，由以下重量份的原料制成：雨生红球藻粉2-50份、姜黄1-25份、水解II型胶原蛋白1-25份。
如上所述的用于改善骨性关节炎的组合物，优选地，所述组合物由以下重量份的原料制成：雨生红球藻粉2-10份、姜黄1-5份、水解II型胶原蛋白1-5份。
如上所述的一种用于改善骨性关节炎的组合物，优选地，所述组合物中雨生红球藻粉、姜黄、水解II型胶原蛋白的重量比为2：1：1。
另一方面，本发明提供一种用于改善骨性关节炎的制剂，该制剂含有如上所述的组合物以及药学可接受的辅料。
如上所述的制剂，优选地，所述制剂为蜜丸、颗粒剂、片剂、胶囊剂、散剂及口服液中任一种口服剂型。
如上所述的制剂，优选地，所述制剂为片剂。
如上所述的制剂，优选地，所述辅料为40-120重量份选自异麦芽酮糖醇、乳糖、玫瑰茄粉、草莓粉、抹茶粉、无水柠檬酸、甜菊糖苷和三氯蔗糖中的一种或多种。
如上所述的制剂，优选地，所述辅料为70-90重量份选自异麦芽酮糖醇、乳糖、玫瑰茄粉、草莓粉、抹茶粉、无水柠檬酸、甜菊糖苷和三氯蔗糖中的一种或多种。
如上所述的制剂，优选地，所述辅料为86.6重量份选自异麦芽酮糖醇、乳糖、玫瑰茄粉、草莓粉、抹茶粉、无水柠檬酸、甜菊糖苷和三氯蔗糖中的一种或多种。
又一方面，本发明提供所述的制剂的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)将姜黄、水解II型胶原蛋白和辅料按照所述配比进行混合，加入制粒机中制成颗粒；
(2)将步骤(1)所得颗粒与雨生红球藻粉混合，并通过18目筛；
(3)将步骤(2)所得混合物制成所需剂型。
如上所述的制备方法，优选地，步骤(3)包括：将步骤(2)所得混合物与硬脂酸镁混合，进一步压片后得所述用于改善骨性关节炎的制剂。
如上所述的制备方法，优选地，所述硬脂酸镁为1.0-5.0份。
如上所述的制备方法，优选地，所述硬脂酸镁为2.0-3.0份。
本发明的用于改善骨性关节炎的组合物是以雨生红球藻粉、姜黄和水解II型胶原蛋白为原料。其中，
雨生红球藻中富含虾青素，且为目前已知自然界中天然虾青素含量最高的生物。虾青素(astaxanthin)又名虾黄素、虾黄质，是一种含氧类胡萝素衍生物。虾青素分子结构中具有共轭双键链和不饱和酮基，非常容易与自由基反应，因此具有极强的抗氧化活性，被誉为“超级抗氧化剂”。研究表明，虾青素具有抗氧化、提高免疫力、抗骨质疏松等作用，可有效调控关节软骨细胞代谢，增强细胞活性，延缓凋亡，对关节软骨细胞的氧化损伤及炎性有逆转作用，从而改善关节炎症状。
姜黄为姜科植物姜黄(Curcuma longa L.)的干燥根茎，味辛、苦，性温，归脾、肝经。主要功效为破血行气，通经止痛，用于胸胁刺痛，胸痹心痛，痛经经闭，癥痕，风湿肩臂疼痛，跌扑肿痛。姜黄作为一种药材在中国和印度有着悠久的使用历史，目前已被证明具有抗炎、抗氧化、消除氧自由基、保护肝脏、抗纤维化、抗肿瘤、抗抑郁和防止阿尔茨海默氏病等多种药理作用。在现代，姜黄被广泛应用于运动员比赛后产生的肌肉疼痛和关节损伤，减轻下肢不适症状和延缓系统性炎症。
水解II型胶原蛋白(软骨胶原蛋白)是以禽类的胸软骨、腿软骨、喉骨为原料，用酶解法生产的以蛋白肽和粘多糖为主要成分或以蛋白肽为主要成分的粉末状或颗粒状产品。其主要功能有两方面，一为软骨组织提供张力和承受力，避免软骨组织撕裂，二为软骨细胞黏附提供基础。
然而，上述原料单独用于骨性关节炎的治疗中，效果并不显著。本发明将雨生红球藻粉雨生红球藻粉、姜黄及水解II型胶原蛋白联合使用，其中雨生红球藻粉起到抗氧化、消炎的作用，并增强软骨细胞代谢，改善关节炎症状；姜黄辅助改善炎症，减轻疼痛，缓解下肢不适症状；水解II型胶原蛋白修复关节软骨组织，增加关节润滑。各组分相互配合协同作用，可显著改善关节炎的相关症状，具有消炎镇痛、改善关节肿胀、促进软骨再生、修复机械性炎症损伤、改善运动行为的功效。
具体实施方式
实施例1 用于改善骨性关节炎的组合物及制剂(一)
1.以重量份计，组合物的配方如下：雨生红球藻粉5份、姜黄5份、水解II型胶原蛋白5份。
2.利用上述组合物进一步制作用于改善骨性关节炎的制剂，步骤如下：
(1)将所有容器设备洗净、杀菌、消毒后备用；
(2)将乳糖40.7份、异麦芽酮糖醇40.2份、玫瑰茄粉5.0份、无水柠檬酸0.5份和三氯蔗糖0.2份混合，得到辅料；
(3)将姜黄、水解II型胶原蛋白和步骤(2)所得辅料按照重量比进行混合；
(4)将步骤(3)所得混合物加入一步制粒机中，将粉末制成颗粒；
(5)将步骤(4)所得颗粒和雨生红球藻粉混合，并通过18目筛；
(6)将步骤(5)所得颗粒与硬脂酸镁3.0份混合，在高速旋转式压片机上进行压片，即得。
实施例2 用于改善骨性关节炎的组合物及制剂(二)
1.以重量份计，组合物配方如下：雨生红球藻粉9份、姜黄3份、水解II型胶原蛋白3份。
2.利用上述组合物进一步制作用于改善骨性关节炎的制剂，步骤如下：
(1)将所有容器设备洗净、杀菌、消毒后备用；
(2)将乳糖40.7份、异麦芽酮糖醇40.2份、玫瑰茄粉5.0份、无水柠檬酸0.5份和三氯蔗糖0.2份混合，得到辅料；
(3)将姜黄、水解II型胶原蛋白和步骤(2)所得辅料按照重量比进行混合；
(4)将步骤(3)所得混合物加入一步制粒机中，将粉末制成颗粒；
(5)将步骤(4)所得颗粒和雨生红球藻粉混合，并通过18目筛；
(6)将步骤(5)所得颗粒与硬脂酸镁3.0份混合，在高速旋转式压片机上进行压片，即得。
实施例3 用于改善骨性关节炎的组合物及制剂(三)
1.以重量份计，组合物的配方如下：雨生红球藻粉10份、姜黄5份、水解II型胶原蛋白5份。
2.利用上述组合物进一步制作用于改善骨性关节炎的制剂，步骤如下：
(1)将所有容器设备洗净、杀菌、消毒后备用；
(2)将乳糖40.7份、异麦芽酮糖醇40.2份、玫瑰茄粉5.0份、无水柠檬酸0.5份和三氯蔗糖0.2份混合，得到辅料；
(3)将姜黄、水解II型胶原蛋白和步骤(2)所得辅料按照重量比进行混合；
(4)将步骤(3)所得混合物加入一步制粒机中，将粉末制成颗粒；
(5)将步骤(4)所得颗粒和雨生红球藻粉混合，并通过18目筛；
(6)将步骤(5)所得颗粒与硬脂酸镁3.0份混合，在高速旋转式压片机上进行压片，即得。
对比例1 用于改善骨性关节炎的制剂(四)
采用与实施例3相似的方法，只是组合物用雨生红球藻粉20份代替。制备步骤如下：
(1)将所有容器设备洗净、杀菌、消毒后备用；
(2)将乳糖40.7份、异麦芽酮糖醇40.2份、玫瑰茄粉5.0份、无水柠檬酸0.5份和三氯蔗糖0.2份混合，得到辅料；
(3)将步骤(2)所得辅料和雨生红球藻粉20份混合；
(4)将步骤(3)所得混合物加入一步制粒机中，将粉末制成颗粒，并通过18目筛；
(5)将步骤(4)所得颗粒与硬脂酸镁3.0份混合，在高速旋转式压片机上进行压片，即得。
对比例2 用于改善骨性关节炎的制剂(五)
采用与实施例3相似的方法，只是组合物用姜黄20份代替。制备步骤如下：
(1)将所有容器设备洗净、杀菌、消毒后备用；
(2)将乳糖40.7份、异麦芽酮糖醇40.2份、玫瑰茄粉5.0份、无水柠檬酸0.5份和三氯蔗糖0.2份混合，得到辅料；
(3)将姜黄20份和部分步骤(2)所得辅料进行混合；
(4)将步骤(3)所得混合物加入一步制粒机中，将粉末制成颗粒，并通过18目筛；
(5)将步骤(4)所得颗粒与硬脂酸镁3.0份混合，在高速旋转式压片机上进行压片，即得。
对比例3 用于改善骨性关节炎的制剂(六)
采用与实施例3相似的方法，只是组合物用水解II型胶原蛋白20份代替。制备步骤如下：
(1)将所有容器设备洗净、杀菌、消毒后备用；
(2)将乳糖40.7份、异麦芽酮糖醇40.2份、玫瑰茄粉5.0份、无水柠檬酸0.5份和三氯蔗糖0.2份混合，得到辅料；
(3)将水解II型胶原蛋白20份和部分步骤(2)所得辅料进行混合；
(4)将步骤(3)所得混合物加入一步制粒机中，将粉末制成颗粒，并通过18目筛；
(5)将步骤(4)所得颗粒与硬脂酸镁3.0份混合，在高速旋转式压片机上进行压片，即得。
试验例1 软骨再生功效评价
一、实验材料
1.受试动物
转基因软骨荧光斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后2天，共270尾，每实验组为30尾，以上斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中，实验动物使用许可证号为：SYXK(浙)2012-0171。饲养管理符合国际AAALAC认证的要求。
2.受试药物
实施例1～3和对比例1～3得到的用于改善骨性关节炎的制剂。使用前用蒸馏水配置成需要浓度。
3.实验分组及每日给药量
空白对照组
模型对照组：乙酸地塞米松，临用时用100％DMSO配制成25mmol/L的母液。
阳性对照组：硫酸软骨素1000μg/mL，临用时用超纯水配制成需要浓度。
受试药组：实施例1组：实施例1制剂62.5μg/mL
实施例2组：实施例2制剂62.5μg/mL
实施例3组：实施例3制剂62.5μg/mL
对比例1组：对比例1制剂62.5μg/mL
对比例2组：对比例2制剂62.5μg/mL
对比例3组：对比例3制剂62.5μg/mL
4.模型制作
用25μmol/L地塞米松处理转基因软骨荧光斑马鱼建立斑马鱼软骨损伤模型。
二、实验方法
随机选取270尾受精后2天转基因软骨荧光斑马鱼于六孔板中，每孔均处理30尾斑马鱼，用地塞米松诱发斑马鱼建立软骨损伤模型。分别水溶给予实施例1～3和对比例1～3的制剂，阳性对照药硫酸软骨素1000μg/mL浓度，同时设置正常对照组(养鱼用水处理斑马鱼)和模型对照组，每孔容量为3mL。供试品分别与地塞米松共同处理72h后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼在荧光显微镜下拍照并采集数据，分析统计斑马鱼软骨荧光强度，根据荧光强度的统计学分析结果评价供试品对斑马鱼软骨损伤再生的作用。统计学处理结果用mean±SE表示，软骨再生作用计算公式如下：
两组间比较用T-TEST检验进行统计学分析，多组间比较用GraphPad 5.0软件用One-way ANOVE方差分析和Dunnett’s T-检验进行统计学分析。
表1.制剂处理后斑马鱼软骨荧光强度分析结果
与模型对照组比较，**p＜0.01，***p＜0.001
表1结果显示：模型对照组斑马鱼软骨荧光强度(1151238像素)与正常对照组(2062489像素)比较p＜0.001，表明模型建立成功；阳性对照药硫酸软骨素1000μg/mL浓度组斑马鱼软骨荧光强度为2149074像素，与模型对照组比较p＜0.001，其对斑马鱼软骨损伤再生作用为87％，说明硫酸软骨素对斑马鱼软骨损伤再生具有明显的促进作用。
实施例1、实施例2、实施例3组斑马鱼软骨荧光强度分别为1756001、1774004和2060217像素，与模型对照组比较p＜0.01和p＜0.001，软骨损伤再生促进作用分别为53％、54％和79％，提示实施例1～3制剂在本实验浓度下对斑马鱼软骨损伤再生具有明显的促进作用，其中实施例3效果优于实施例1和实施例2。
与模型对照组比较，对比例1～3组对软骨再生促进作用分别为18％、11％和13％，提示在本实验浓度条件下，仅含有雨生红球藻粉、姜黄或水解II型胶原蛋白的制剂对软骨再生促进作用不明显。
试验例2 机械性损伤炎症的治疗作用评价
一、实验材料
1.受试动物
野生型AB品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后3天，共240尾，每实验组为30尾，以上斑马鱼均饲养条件同上所述。
2.受试药物
实施例1～3和对比例1～3得到的用于改善骨性关节炎的制剂。使用前用蒸馏水配置成需要浓度。
3.实验分组及每日给药量
空白对照组
模型对照组
受试药组：实施例1组：实施例1制剂62.5μg/mL
实施例2组：实施例2制剂62.5μg/mL
实施例3组：实施例3制剂62.5μg/mL
对比例1组：对比例1制剂62.5μg/mL
对比例2组：对比例2制剂62.5μg/mL
对比例3组：对比例3制剂62.5μg/mL
4.模型制作
选取3dpf野生型AB系斑马鱼，用手术刀沿与躯干垂直方向切除整个尾鳍，建立斑马鱼组织再生模型。
二、实验方法
随机选取240尾受精后3天(3dpf)野生型AB品系斑马鱼，采用手术切断尾鳍的方法建立斑马鱼组织再生模型。分别水溶给予实施例1～3和对比例1～3制剂，同时设置正常对照组和模型对照组。供试品处理结束后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼在解剖显微镜下拍照并保存图片，利用Image-J高级图像处理软件统计分析斑马鱼尾鳍再生长度(L)，以尾鳍再生长度的统计学分析结果评价供试品对组织的修复作用。统计学处理结果采用mean±SE表示。供试品修复作用的计算公式如下：
用方差分析和Dunnett’s T-检验进行统计学分析。
表2.制剂对斑马鱼机械性损伤炎症的修复作用结果
与模型对照组比较：**p＜0.01，***p＜0.001
表2结果显示：模型对照组斑马鱼尾鳍再生长度(206像素)与正常对照组(367像素)比较p＜0.001，表明模型建立成功。
实施例1、实施例2和实施例3组尾鳍再生长度分别为242、251和253像素，与模型对照组比较p＜0.01和p＜0.001，对尾鳍修复作用分别为22％、28％和29％。提示在本实验浓度条件下，实施例1～3制剂对斑马鱼尾鳍具有明显的修复作用。
与模型对照组比较，对比例1～3组对斑马鱼机械性损伤炎症的修复作用分别为2％、7％和3％，提示在本实验浓度条件下，仅含有雨生红球藻粉、姜黄或水解II型胶原蛋白的制剂对斑马鱼机械性损伤炎症的修复作用不明显。
试验例3 运动行为的改善作用评价
一、实验材料
1.受试动物
野生型AB品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后3天，共270尾，每实验组为30尾，以上斑马鱼均饲养条件同上所述。
2.受试药物
实施例1～3和对比例1～3得到的用于改善骨性关节炎的制剂。使用前用蒸馏水配置成需要浓度。
3.实验分组及每日给药量
空白对照组
模型对照组
阳性对照组：硫酸软骨素1000μg/mL
受试药组：实施例1组：实施例1制剂62.5μg/mL
实施例2组：实施例2制剂62.5μg/mL
实施例3组：实施例3制剂62.5μg/mL
对比例1组：对比例1制剂62.5μg/mL
对比例2组：对比例2制剂62.5μg/mL
对比例3组：对比例3制剂62.5μg/mL
5.模型制作
用50μmol/L地塞米松处理3dpf野生型AB品系斑马鱼，建立斑马鱼软骨损伤模型。
二、实验方法
随机选取270尾受精后3天(3dpf)野生型AB品系斑马鱼于六孔板中，每孔均处理30尾斑马鱼，用地塞米松诱导斑马鱼建立软骨损伤模型。分别水溶给予实施例1～3和对比例1～3制剂，阳性对照药硫酸软骨素1000μg/mL浓度，同时设置正常对照组(养鱼用水处理斑马鱼)和模型对照组，每孔(实验组)容量为3mL。供试品处理72h后，每组随机选取10尾斑马鱼置于96孔板中，每孔1尾，每孔容量为200μL，利用运动/行为分析仪记录1h内的斑马鱼运动情况。分析统计斑马鱼的总运动距离(D)，以总运动距离的统计学分析结果评价供试品对地塞米松诱导的软骨损伤斑马鱼的运动行为的改善作用。统计学处理结果用mean±SE表示。运动改善作用计算公式如下：
用方差分析和Dunnett’s T-检验进行统计学分析。
表3.制剂对斑马鱼运动改善作用结果
与模型对照组比较：*p＜0.05，***p＜0.001
表3结果显示：模型对照组斑马鱼运动距离(3929mm)与正常对照组(5728mm)比较p＜0.001，表明模型建立成功。阳性对照药硫酸软骨素1000μg/mL浓度组斑马鱼运动距离为5652mm，与模型对照组比较p＜0.05，运动改善作用为44％，说明硫酸软骨素对地塞米松诱导的斑马鱼运动改善作用明显。
实施例1、实施例2和实施例3组斑马鱼运动距离分别为5494、5746、6464mm，运动改善作用分别为40％、46％、65％。提示实施例2和实施例3制剂对地塞米松诱导的斑马鱼具有明显的运动改善作用，其中实施例3效果优于实施例1和实施例2。
与模型对照组比较，对比例1～3组对斑马鱼运动改善作用分别为14％、2％和12％，提示在本实验浓度条件下，仅含有雨生红球藻粉、姜黄或水解II型胶原蛋白的制剂对斑马鱼运动改善作用不明显。
试验例4 镇痛作用评价
一、实验材料
1.受试动物
野生型AB品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后3天，共270尾，每实验组为30尾，以上斑马鱼均饲养条件同上所述。
2.受试药物
实施例1～3和对比例1～3得到的用于改善骨性关节炎的制剂。使用前用蒸馏水配置成需要浓度。
3.实验分组及每日给药量
空白对照组
模型对照组
阳性对照组：阿司匹林50μg/mL
受试药组：实施例1组：实施例1制剂62.5μg/mL
实施例2组：实施例2制剂62.5μg/mL
实施例3组：实施例3制剂62.5μg/mL
对比例1组：对比例1制剂62.5μg/mL
对比例2组：对比例2制剂62.5μg/mL
对比例3组：对比例3制剂62.5μg/mL
6.模型制作
用冰乙酸以水溶给药方式处理野生型AB品系斑马鱼，建立斑马鱼疼痛模型。
二、实验方法
随机选取270尾3dpf野生型AB品系斑马鱼于六孔板中，水溶给予实施例1～3和对比例1～3制剂，阳性对照药阿司匹林50μg/mL浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔斑马鱼为30尾，每孔容量为3mL，给予供试品1h后，用0.005％冰乙酸诱导建立斑马鱼疼痛模型，之后立即用行为分析仪观察记录各实验组斑马鱼在30min内的低速运动的次数(N)，并与模型对照组比较进行统计分析，以统计学意义评价供试品对斑马鱼的镇痛作用，按以下公式计算镇痛作用：
用方差分析和Dunnett’s T-检验进行统计学分析。
表4.制剂对冰乙酸诱导的斑马鱼镇痛作用
与模型对照组比较，**p＜0.01，***p＜0.001
表4结果显示：模型对照组斑马鱼运动次数为2163次，与正常对照组(326次)比较p＜0.001，表明模型建立成功。阳性对照品阿司匹林在50μg/mL浓度下斑马鱼运动次数为1329次，与模型对照组比较p＜0.001，镇痛作用为39％，说明阿司匹林能缓解冰乙酸诱导的斑马鱼疼痛。
实施例1、实施例2和实施例3组斑马鱼运动次数分别为1329、1100和875次，与模型对照组比较均p＜0.001，其镇痛作用分别为39％、49％和60％，表明在本实验浓度条件下实施例1-3的制剂对斑马鱼疼痛有明显的缓解作用，且实施例3效果优于实施例1和实施例2。
与模型对照组比较，对比例1～3组对冰乙酸诱导的斑马鱼镇痛作用分别为14％、12％和8％，提示在本实验浓度条件下，仅含有雨生红球藻粉、姜黄或水解II型胶原蛋白的制剂对斑马鱼镇痛作用不明显。
试验例5 关节肿胀功效评价
一、实验材料
1.受试动物
ICR小鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK京2016-0006，合格证号：1100112011019354。雄性60只，雄性体质量(24±1)g。许可证号：SYXK(京)2017-0020，室温(22±2)℃，相对湿度60％RH。
2.受试药物
实施例1～3和对比例1～3得到的用于改善骨性关节炎的制剂。使用前用蒸馏水配置成需要浓度。
氨糖软骨素，由美国Schiff公司提供，生产批号：20190219。
角叉菜胶，北京金诺欣成化工有限公司。
3.实验分组及每日给药量
模型对照组
阳性对照组：氨糖软骨素0.67g/kg
受试药组：实施例1组：实施例1制剂80mg/kg
实施例2组：实施例2制剂80mg/kg
实施例3组：实施例3制剂80mg/kg
对比例1组：对比例1制剂80mg/kg
对比例2组：对比例2制剂80mg/kg
对比例3组：对比例3制剂80mg/kg
二、实验方法
采用雄性ICR小鼠，每组10只。实验设9个组：模型对照组、阳性对照组氨糖软骨素、实施例1～3和对比例1～3制剂。灌胃给予受试物9天，末次给予受试物30分钟后，左腿膝关节腔内注射1％角叉菜胶，50μL/只，2小时后用游标卡尺测量左右膝关节横向直径(mm)，按以下公式计算膝关节肿胀度和关节肿胀抑制率(％)。
关节肿胀度(％)＝100×(左腿膝关节直径-右腿膝关节直径)/右腿膝关节直径
关节肿胀抑制率(％)＝100×(模型对照组关节肿胀度-实验组关节肿胀度)/模型组关节肿胀度
计量资料数据用平均值±标准误(mean±standard error)表示，各组间差异比较采用t检验。
表5 制剂对小鼠关节肿胀的影响
与对照组比较，**p＜0.01
表5结果显示：与模型对照组比较，实施例1、实施例2和实施例3组的小鼠关节肿胀抑制率分别为31.5％、46.0％、45.3％，表明实施例1、实施例2和实施例3制剂具有一定的改善小鼠关节肿胀的作用。
与模型对照组比较，对比例1～3组对小鼠关节肿胀的抑制率分别为13.7％、8.4％和6.0％，提示在本实验浓度条件下，仅含有雨生红球藻粉、姜黄或水解II型胶原蛋白的制剂对小鼠关节肿胀的抑制作用不明显。
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