应用微流控技术制备纳米颗粒、制备方法及装置和用途
阅读说明：本技术 应用微流控技术制备纳米颗粒、制备方法及装置和用途 (Preparation method, device and application of nanoparticles by applying microfluidic technology ) 是由 王志祥 王新 王凯叶 于 2021-06-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了应用微流控技术制备纳米颗粒、制备方法及装置和用途,该纳米颗粒,粒径为175～225nm,粒径分散度为15～30％,电位为-25～-5MV。方法如：将紫胶完全溶于极性溶剂中,然后将药物CAPE溶于其中,制得内相溶液；将阿拉伯树胶溶于去离子水中,制得外水相溶液；将内相溶液包裹在外水相溶液中,采用一步法装置制备纳米颗粒溶液；将纳米颗粒溶液旋蒸去除溶液内的溶剂,干燥,即得。本发明制备的纳米颗粒负载CAPE药物,具有良好的可分散性和稳定性,在胃部保护包封的CAPE结构与活性,并在肠道部位特异性释放包封的CAPE。(The invention discloses a method and a device for preparing nano particles by applying a microfluidic technology and application thereof, wherein the nano particles have the particle size of 175-225 nm, the dispersion degree of the particle size of 15-30 percent and the potential of-25-5 MV. The method comprises the following steps: completely dissolving lac in polar solvent, and dissolving CAPE in the polar solvent to obtain inner phase solution; dissolving arabic gum in deionized water to obtain external water phase solution; wrapping the inner phase solution in the outer water phase solution, and preparing a nanoparticle solution by adopting a one-step device; and (4) performing rotary evaporation on the nanoparticle solution to remove the solvent in the solution, and drying to obtain the nano-particle. The nanoparticle loaded CAPE drug prepared by the invention has good dispersibility and stability, protects the structure and activity of the encapsulated CAPE in the stomach, and specifically releases the encapsulated CAPE in the intestinal tract.)
技术领域
本发明涉及纳米颗粒、制备方法及装置，特别涉及应用微流控技术制备纳米颗粒、制备方法及装置和用途。
背景技术
咖啡酸苯乙酯(CAPE)是一种从蜂胶中提取的具有生物活性的类黄酮化合物，结构中含有0-二羟基(儿茶酚)苯基结构。CAPE具有广泛的生物特性，因其在抗肿瘤、抗氧化、抗炎症和抗菌活性等方面表现出独特的生理、药理作用，己成为蜂胶活性成分研究的一大热点。然而，CAPE溶解度很低，其水溶性差，生物性能差，且已有研究证明，CAPE在大鼠血浆中易被血浆酶快速分解，水解为咖啡酸，导致其半衰期缩短，这限制了它们在食品和制药工业中的应用。CAPE的疏水性质和口服生物利用度低，限制了其体内和体外的药效，开发一种药物载体系统来提高疏水药物的生物利用度和稳定性，并在人体内目标区域释放吸收，具有重要意义和市场价值。
目前已报道的关于负载CAPE递送体系主要有微乳液、微囊类、固体分散体以及脂质体包封。但是这些方法的共同缺点是：1.制备耗时长，载体材料易于降解，实验不确定因素多。2.体系不稳定，分散性不高、包封率低，载药效率有待提高。3.包合物载体有些尚未被批准用于食品应用。因此，有必要设计一种高效的且具有生物相容性的口服给药系统，以便在在生产、加工和储存中和暴露于GIT内的不稳定条件(pH和基质效应)时保持稳定，同时还应解决载体材料安全、易降解、可食用等问题，进一步实现靶向给药吸收的目标。在不同的行业，特别是食品行业，对新型和食品级生物聚合物的需求不断增长。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供具有核壳结构、良好的可分散性、稳定性和包封率的PH响应型复合纳米颗粒。
本发明另一目的是提供所述纳米颗粒的制备方法及专用装置。
技术方案：本发明所述的应用微流控技术制备纳米颗粒，为复合纳米颗粒，粒径为100～250nm，粒径分散度为15～30％，电位为-25～-5MV。
所述的应用微流控技术制备纳米颗粒在包封肠道靶向药物以及生物、食品等方面的应用。
进一步地，所述纳米颗粒在胃部保护包封的CAPE结构与活性，并在肠道部位特异性释放包封的CAPE。
一种制备所述的应用微流控技术制备纳米颗粒的装置，包括内相毛细管、外相毛细管、方形管、收集管、进样针头、两个铁管和一个载玻片，方形管固定于载玻片中心位置，内相毛细管插入方形管中，进样针头固定在在内相毛细管与方形管接口处，两个铁管分别套在内、外相毛细管粗端，收集管(即外相毛细管)插入方形管用于收集毛细管中的产物，上述为一步法，采用二步法的时候外相毛细管与收集管分开设置。
左侧圆柱毛细管尖端插入方形管用于通入内相，方形毛细管和圆柱毛细管之间固定一个进样针头用于通入外相，收集管尖端从方形管另一端(右侧)插入，右侧圆柱毛细管用于收集产物。优选的，所述内相毛细管外径960μm，内径550μm，尖端口径20～100μm；收集管外径960μm，内径550μm，尖端口径150～400μm；方形管外径1.4mm，内径1.1mm；优选的，进样针头为18G点胶针头。
所述装置的制作方法如下：
将已被打磨的两根毛细管放置在倒置显微镜的观察平台上，通过显微镜目镜以及显微镜连接的电脑端JIFEI显微镜专用测量软件，观察两根毛细管尖端粗细是否达到实验要求。先将方形管固定于载玻片中心位置，再把内相毛细管尖端插入方形管中(内相毛细管另一端伸出载玻片2cm左右)，从显微镜目镜下观察将内相毛细管尖端调整至方形管左右中间部位，通过JIFEI测量软件放大观察方形管内情况，调整内相毛细管尖端与方形管上下距离，使之等距离宽度。再将外相毛细管尖端从方形管右侧插入，调整内相毛细管与外相毛细管在微观条件下的距离，控制两根毛细管尖端左右间距为300μm左右。优选地，将已进样针头缓慢放置在内相毛细管与方形管接口处，要求针头中间与两管接口垂直对齐，且放置完毕后不影响方形管内部内相与外相毛细管左右距离等上述要求。再用AB胶左右固定进样针头、内相毛细管和方形管，待到胶水冷却固化后，再用AB胶封住方形管与外相毛细管右侧接口。最后，用两个小铁管分别套在左右毛细管粗端，以保持装置平衡稳定和保护毛细管，用AB胶固定两个铁管，至此，微流控一步法单乳液装置搭置完成。
进一步地，所述内相毛细管采用拉针仪制备，使用拉针仪设备将毛细管烧拉成两到三节，再通过用磨针仪将拉针仪烧拉后以备实验所需的两根毛细管尖端分别打磨至40-60μm、200-400μm，作为内相毛细管。其中内相毛细管尖端内径优选40-60μm，收集管尖端内径优选200-400μm，两管间距优选300μm。
进一步地，所述外相毛细管采用拉针仪制备，使用拉针仪设备将毛细管烧拉成两到三节，再通过用磨针仪将拉针仪烧拉后以备实验所需的两根毛细管尖端分别打磨至40-60μm、200-400μm，作为外相毛细管。
进一步地，所述进样针头下端接口处设置两个小孔，用于后续固定毛细管与方形管。
所述的应用微流控技术制备纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1，将紫胶完全溶于极性溶剂中，然后将药物CAPE溶于其中，制得内相溶液；
步骤S2，将阿拉伯树胶溶于去离子水中，制得外水相溶液；
步骤S3，将步骤S1获得的内相溶液包裹在步骤S2获得的外水相溶液中，采用一步法装置制备纳米颗粒溶液；优选地，将步骤S3制得的纳米颗粒收集在事先已准备好的去离子水中，以防止破乳；
步骤S4，将步骤S4的纳米颗粒溶液旋蒸去除溶液内的乙醇，冷冻干燥，获得所述纳米颗粒。具体地，将已制得的纳米颗粒溶液转置于烧瓶内，用旋转蒸发器蒸发去除乙醇，旋转蒸发器温度控制在50℃，转速40～50r/min，因溶液内乙醇含量较低，可蒸发5～8min即可除尽乳液中的有机溶剂。
上述方法具体地，将装有内相和外相的注射器分别固定在两个注射泵上，通过聚四氟乙烯软管将微流控装置的入口与注射器相连，然后调节内相流速和外相流速，在微流控装置中，内相溶液沿着中央通道流动，在交叉口处被外部水相以较高流速挤压成细流，通过聚焦后的细流宽度极窄，乙醇与水快速混合，紫胶-阿拉伯树胶和CAPE共同沉淀析出，且CAPE被包裹在紫胶-阿拉伯树胶基质内，形成包裹CAPE的纳米颗粒。
步骤S1的内相溶液中紫胶含量为0.5％～0.4％(w/v)，CAPE含量为0.01％～0.1％(w/v)；极性溶剂为乙醇水溶液；步骤S2的外水相溶液中阿拉伯树胶的的含量为0.1％～2.5％。
步骤S1与步骤S2内水相溶剂与外水相溶剂比，即溶剂：抗溶剂比为1:5～1:20。
上述技术方案所用原料原理如下：
1、以紫胶和阿拉伯树胶作为主要材料，制备具有核壳结构的PH响应型复合纳米颗粒。紫胶是一种来自昆虫的天然可生物降解树脂，在医药领域有很长的使用历史，它也被批准作为食品添加剂。阿拉伯树胶为一种天然可食用性胶体，其水溶性高、价廉易得，具有良好的生物相容性和可降解性，近年来，紫胶和阿拉伯树胶在营养食品和营养补充剂方面受到越来越多的关注；
2、由于紫胶的不溶于水却溶于乙醇特性，因此可以更好地用于微流控沉淀上，使用乙醇为良溶剂，溶解紫胶和CAPE药物，在微流控装置中，良溶剂与不良溶剂去离子水混合，在微通道交叉口处被外部水相以较高流速挤压成细流，通过聚焦后的细流宽度极窄，乙醇与水快速混合，紫胶和CAPE共同沉淀析出，且CAPE被包裹在紫胶基质内，形成包裹CAPE的纳米颗粒。紫胶的这一特性更符合微流控技术的方便快捷和控制灵活等优点。
3、紫胶耐酸，但在PH>7.0的碱性溶液中表现出良好的溶解性。在pH<7的情况下，紫胶几乎不溶于水，因此是形成不溶性但分散的胶体颗粒的很好的起始原料，有助于制得的纳米颗粒顺利通过胃，来到肠道特定部位(PH6.8～7.4)释放药物。紫胶的天然易降解性比其他化学复合物的胶体材料更安全、无毒副作用，更加贴近满足食品口服材料的要求；
4、所用溶剂和材料均经过FDA(美国食品及药物管理局)和CFDA(国家食品药品监督管理总局)认证且可食用，整个体系绿色无害，所制备的纳米颗粒及其分散液生物相容性良好，在食品、化妆品和医药等领域有广泛的应用前景。
5、选择用微流控共沉淀法制备纳米制剂，通过沉淀法加上微流控技术(微流控纳米沉淀法)，在管道内以载体材料和药物沉淀来来制备纳米微粒。采用流动聚焦型玻璃毛细管微流控装置，制备简单，造价低，控制灵活，无润湿性影响，无需改性。利用微流控的可调可控制性以及流体的连续剪切力制得具有各种精确结构的纳米颗粒。本发明制备的纳米颗粒负载CAPE药物，具有良好的可分散性和稳定性。内水相材料内的紫胶，由于其含有部分羧基基团，在水中电离可以阻止纳米颗粒的聚集，因此无需采用表面活性剂来稳定颗粒，简化了工艺流程，另外，有些表面活性剂对人体有一定的刺激性，通常难以去除，影响材料的生物相容性。
有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下显著优势：
1、该纳米颗粒系统具有粒径小、分散性高、稳定性高、比表面积大等特性，能够显著提高所包载药物的稳定性，改善难溶性药物的水分散性，控制药物释放以及提高药物的靶向效率等，同时选择的载体药物灵活多变，可以兼具降低毒性、减少副作用，具有靶向性等诸多特点。纳米颗粒在生物医学领域得到了广泛的研究，被认为是特定部位药物输送和靶向治疗的理想载体。
2、采用流动聚焦型玻璃毛细管微流控装置，制备简单，造价低，控制灵活，无润湿性影响，无需改性，且制备条件温和，不会影响CAPE的结构与性能，可通过调节泵的进样流速精确设计与控制纳米颗粒粒径大小和改善药物的分散性，并且具有可连续性，操作方便简洁，在未来的食品和生物药物制剂制备中具有广泛的应用价值。
附图说明
图1为本发明纳米颗粒制备装置结构示意图，其中W1为内相溶液，W2为外水相溶液；
图2为本发明微流体装置细节放大图；
图3为CAPE纳米颗粒红外光谱图，其中，CAPE为咖啡酸苯乙酯，GA为阿拉伯胶，BlankNPS为空白纳米颗粒，NPS为载药纳米颗粒；
图4为GA浓度对纳米颗粒粒径和Zeta电位的影响结果图，其中GA为阿拉伯树胶；
图5为溶剂与抗溶剂比(SAS)对纳米颗粒粒径的影响结果图，SAS为乙醇与去离子水的比例；
图6为紫胶浓度对纳米颗粒粒径的影响结果图；
图7为不同试剂浓度对纳米颗粒包封率的影响结果图，A图为GA浓度对纳米颗粒包封率的影响结果图，其中，GA为阿拉伯树胶；B图为不同CAPE浓度对纳米颗粒包封率的影响结果图；C图为不同SAS比例对纳米颗粒包封率的影响结果图，其中，SAS为乙醇与去离子水的比例；D图为不同紫胶浓度对纳米颗粒包封率的影响结果图；
图8为纳米颗粒扫描电镜图，其中A图为阿拉伯树胶浓度为0.8％制备的纳米颗粒，B图为阿拉伯树胶浓度为0.6％制备的纳米颗粒，C图和D图为0.8％NPS的局部放大图；其中，A图和B图中比例尺为10μm(0.1mm)，C图和图D图中比例尺分别为5μm(0.05mm)和2μm(0.02mm)；
图9为纳米颗粒透射电镜图，其中，A图中比例尺为200nm，B图中比例尺为500nm；
图10为纳米颗粒稳定性结果图，其中，A图为模仿胃液(PH1.2)下三种体系随时间变化的降解度结果图，其中，第一体系是游离的CAPE，第二体系是CAPE与紫胶，第三体系是CAPE+紫胶+阿拉伯树胶；B图为模仿胃液(PH1.2)下不同GA浓度对NPS粒径的影响随天数时间变化的影响结果图，其中GA为阿拉伯树胶；
图11为纳米颗粒在胃肠液中随时间累积释放CAPE的结果图；
图12为内外相毛细管内部放大图。
具体实施方式
实验材料：
咖啡酸苯乙酯(规格及纯度≥99％)；紫胶(规格及纯度≥95％)；阿拉伯树胶(纯度≥99％)；乙醇(分析级，纯度≥99.7％)；浓盐酸(分析纯，Hcl,ω％：36.0-38.0)；磷酸二氢钾(含量≥99.5％，)；氢氧化钠(含量≥96％)。
实验仪器
ICX41显微镜；2F04M高速相机；TYD01-01-CE注射泵；MZY-US系列超纯水机；XH-C旋涡混合器；ZGCJ-3磁力搅拌器；旋转蒸发器；FDU-1110冷冻干燥机；MS-H280-Pro磁力加热搅拌器；ZD-85恒温振荡器；H1850离心机；安东帕激光粒度仪(Litesizer 500)；FE28-standard PH计；S-3400N扫描电子显微镜；日立HT7700透射电镜；PC-100拉针仪；EG-401磨针仪；UV-1800紫外可见光分光光度计；FT/IR-4100型傅里叶变换红外光谱仪。
实施例1：玻璃微流体装置的搭建
玻璃微流体装置为自制一步法制备单乳液装置，包括内相毛细管1、外相毛细管3、方形管2、进样针头4、两个铁管5和载玻片6。使用拉针仪设备将一根长毛细管烧拉成两到三节，再通过用磨针仪将拉针仪烧拉后以备实验所需的两根毛细管尖端分别打磨至40-60μm，200-400μm，作为内相毛细管1和外相毛细管3。具体的，将已被打磨的两根毛细管放置在倒置显微镜的观察平台上，通过显微镜目镜以及显微镜连接的电脑端JIFEI显微镜专用测量软件，观察两根毛细管尖端粗细是否达到实验要求。先将方形管2固定于载玻片6中心位置，再把内相毛细管尖端插入方形管中(内相毛细管1另一端伸出载玻片2cm左右)，从显微镜目镜下观察将内相毛细管1尖端调整至方形管2左右中间部位，通过JIFEI测量软件放大观察方形管内情况，调整内相毛细管1尖端与方形管2上下距离，使之等距离宽度。再将外相毛细管3尖端从方形管2右侧插入，调整内相毛细管与外相毛细管在微观条件下的距离，控制两根毛细管尖端左右间距为300μm左右。优选地，将已进样针头缓慢放置在内相毛细管1与方形管2接口处，要求针头中间与两管接口垂直对齐，且放置完毕后不影响方形管内部内相与外相毛细管左右距离等上述要求。再用AB胶左右固定进样针头、内相毛细管和方形管，待到胶水冷却固化后，再用AB胶封住方形管与外相毛细管右侧接口。最后，用两个小铁管5分别套在左右毛细管粗端，以保持装置平衡稳定和保护毛细管，用AB胶固定两个铁管5，至此，微流控一步法单乳液装置搭置完成。如图2所示。整个操作过程在倒置显微镜平台上进行，确保两根毛细管在方形管的中心线上。
实施例2：纳米颗粒的制备
(1)两相溶液的制备
称取一部分CAPE(0.01～0.1％w/v)和紫胶(0.5～4.0％w/v)溶于1ml乙醇中，放置于磁力搅拌器上搅拌至完全溶解(若搅拌溶解不完全可使用旋涡混合器助溶)，制得内水相溶液，将阿拉伯树胶(0～2.5％w/v)溶于去离子水中，将溶液置于旋涡混合器上使阿拉伯树胶快速溶解，制得外水相溶液，其中乙醇与水比例为(1：5、1:10、1:15以及1:20)。
(2)纳米颗粒的制备
将内水相溶液吸入1ml的一次性无菌医用注射器，同时用5ml一次性无菌医用注射器吸取外水相溶液，将装有内相和外相的注射器分别固定在两个注射泵上，通过聚四氟乙烯软管将微流控装置的进样口与注射器相连。具体的，连接完注射器与微流控装置后，通过调节内水相和外水相注射泵的注入流速、注射器型号等参数，使得内水相与外水相可以同时流入装置内。具体的，在微流控装置中，内相溶液沿着中央通道流动，如图2所示，在交叉口处被外部水相以较高流速挤压成细流，通过聚焦后的细流宽度极窄，乙醇与水快速混合，紫胶-阿拉伯树胶和CAPE共同沉淀析出，且CAPE被包裹在紫胶-阿拉伯树胶基质内，形成包裹CAPE的纳米颗粒，内水相与外水相汇集后形成的细流最终流入收集管，具体的，若无特殊说明，内水相流速为25μL/min，外水相流速为250μL/min。微流控装置末端软管另一处放置干净无污染的接收瓶，接收自收集管流出的纳米颗粒溶液。收集完后将已制得的纳米颗粒溶液转置于烧瓶内，用旋转蒸发器蒸发去除乙醇，旋转蒸发器温度控制在50℃，转速40～50r/min，因溶液内乙醇含量较低，可蒸发5～8min即可除尽乳液中的有机溶剂。
(3)傅立叶红外光谱分析
利用红外光谱分析纳米颗粒的化学结构，400～4000cm-1范围内扫描CAPE、阿拉伯树胶、空白纳米颗粒和载药纳米颗粒的固体样品，获得其FT-IR光谱。
结果讨论：如图3所示，1：3460cm-1处是CAPE由于苯酚的羟基(-OH)伸缩振动产生特征峰，而对于阿拉伯树胶，3299cm-1的强吸收峰是羟基的伸缩振动；2：2923cm-1处的强吸收峰对应于阿拉伯树胶上的烷基(C-H)的伸缩振动；3：1593cm-1处的吸收峰是由于CAPE酚芳环上的C-C伸展而产生峰，以及1592cm-1处的峰是由于阿拉伯树胶链中的-COOH不对称伸缩振动导致的；4：1413cm-1处的峰是由于阿拉伯树胶链中的-COOH对称伸缩振动，同时CAPE谱图中的966cm-1处的吸收峰是由于CAPE酚芳环上的C-O伸展而产生峰。CAPE在3460cm-1、1593cm-1和966cm-1处的强特征峰在空白纳米颗粒和载药纳米颗粒包峰中消失，证明了CAPE已成功包封进纳米颗粒中以及纳米颗粒的形成是通过CAPE的酚芳环与外包材之间的相互作用实现的。除此之外，GA在3299cm-1、和1592cm-1处的特征峰在空白纳米颗粒分别偏移至3297cm-1和1458cm-1；而在载药纳米颗粒中分别偏移至3276cm-1和1458cm-1，由此，可以说明纳米颗粒与GA相互作用，引起GA二级结构的改变。而GA在2923cm-1和1413cm-1处的吸收峰，在形成空白NPS和载药NPS之后各分裂出了两个峰，增加了2844cm-1和1458cm-1两个新峰，新谱带的出现证实了纳米颗粒中CAPE与阿拉伯树胶的成功结合。
实施例3：纳米颗粒的表征
(1)纳米颗粒粒径的表征：考察使用的物料参数对纳米颗粒粒径和电位的影响。
在上述对纳米颗粒制备的条件不变的情况下，分别考察阿拉伯树胶浓度、紫胶浓度以及溶剂与抗溶剂比对纳米颗粒粒径和电位的影响，使用安东帕激光粒度仪(Litesizer500)测粒径分布和Zeta电位。
结果讨论：如附图4、5、6所示，通过进行不同组的单因素实验，结果发现，用不同浓度组的阿拉伯树胶浓度制备的纳米颗粒的粒径与电位测量结果显示，阿拉伯胶浓度自0.8％w/v之后，粒径与电位有大幅增长，而在0～0.8％w/v内，无明显增长变化，因此猜测阿拉伯树胶0.8％w/v为一个临界浓度；而紫胶与SAS的单因素实验内，则直观地显示出，在1％的紫胶浓度与1:10的SAS比例下制备的纳米颗粒粒径最小。并且在阿拉伯树胶单因素实验内，我们发现在0.1％～0.8％GA浓度内制备出的纳米颗粒，经DLS(动态光散射)显示纳米颗粒水合粒径在175～225nm，粒径分散度为15～30％，电位为-25～-5MV，尺寸均一，单分散性好，重复性高；同样在紫胶与SAS单因素实验内发现制备出的1％紫胶浓度和1:10的SAS比例纳米颗粒粒径在175～225nm。因此，综上考虑，可以得出制备纳米颗粒的最优组条件是0.8％GA浓度，1％紫胶浓度和1:10的SAS比例的结论。
(2)纳米颗粒的包封量与回收率
称取一部分CAPE(0.01～0.1％w/v)和紫胶(0.5～4.0％w/v)溶于1ml乙醇中，放置于磁力搅拌器上搅拌至完全溶解(若搅拌溶解不完全可使用旋涡混合器助溶)，制得内水相溶液，将阿拉伯树胶(0～2.5％w/v)溶于去离子水中，将溶液置于旋涡混合器上使阿拉伯树胶快速溶解，制得外水相溶液，其中乙醇与水比例为(1：5、1:10、1:15以及1:20)，将已制备好的两相溶液按照例2的方法制备纳米颗粒。将已制得的纳米颗粒溶液转置于烧瓶内，用旋转蒸发器蒸发去除乙醇，旋转蒸发器温度控制在50℃，转速40～50r/min，因溶液内乙醇含量较低，可蒸发5～8min即可除尽乳液中的有机溶剂。具体的，将去除有机试剂的纳米颗粒溶液放置于离心机中，以10000rpm转速离心10min，并用相应的离子水溶液清洗纳米颗粒，离心操作重复三次。使用UV-1800紫外可见光分光光度计测量CAPE吸光度，建立CAPE浓度标准曲线如下：
以乙醇溶液做溶剂：Y＝0.0721X-0.0159 R2＝0.9995
取离心后的上清液溶液，使用紫外可见光分光光度计测定上清液的吸光度，依据CAPE浓度标准曲线计算出相应的浓度。通过已测定的纳米颗粒溶液游离的CAPE含量、NPS负载的CAPE总质量以及冻干后的NPS质量和初始药物材料总量，由以下公式计算得到包封效率和回收率。
包封率(EE)计算公式：
回收率(RY)计算公式：
其中，
M：加入CAPE的总质量；
m：游离在外水相中的CAPE质量；
W1:冻干后NPS总质量；
W2：初始药物材料总质量。
通过以上方法得出纳米粒子负载CAPE的包封率，并如附图7A、7B、7C和7D所示，以此方法分别计算出以不同GA、CAPE、SAS和紫胶浓度为变量的单因素实验对应的负载CAPE的包封率和回收率结果图。
结果讨论：如附图7A所示，当GA浓度范围在0.1％-0.8％，NPS包封率从99.836％增加至99.849％，但在0.8％～2.5％浓度范围内，包封率逐渐下降至99.764％。说明，NPS在0.8％GA浓度达到包封率最高点。如图7B、C和D所示，0.08％浓度的CAPE、所制成的NPS包封率最高，达到了99.936％；SAS为1:10时，包封率与回收率都达到最高点，分别是81.103％和72.707％；紫胶浓度为1.0％时，包封率最高达到82.79％。
(3)纳米颗粒的形貌表征
1.SEM表征
通过扫描电子显微镜表征纳米颗粒的形貌，如图8扫描电镜图像显示，负载CAPE的纳米粒子在冻干后均保持了呈近似球形形态，其中，图8A为阿拉伯树胶浓度为0.8％制备的纳米颗粒，图8B为阿拉伯树胶浓度为0.6％制备的纳米颗粒，图8C和8D为0.8％NPS的局部放大图；其中，图8A和图8B图中比例尺为10μm(0.1mm)，图8C和图8D图中比例尺分别为5μm(0.05mm)和2μm(0.02mm)。
结果讨论：由图可以观察到，大多数纳米颗粒均可呈现均匀的球形，颗粒表面形状较粗糙不规则可能是由于GA分子吸附在紫胶表面所致。因样品在分析前被冷冻干燥，然后用非常少的水重新分散，因此出现颗粒聚集的情况，总的来说，颗粒较稳定均一，形貌良好。
2.TEM表征
将已制备好的纳米颗粒溶液，取出部分NPS溶液滴于铜网上，3min后用滤纸吸干多余水分，滴加1％磷酸钨，染色5min后，吸干染料，并将网格风干，形成一层薄膜，然后用透射电镜进行观察。得出TEM电镜结果图附图9，其中，图9A图中比例尺为200nm，图9B图中比例尺为500nm。
结果讨论：由附图9所示，制备的纳米颗粒都为纳米级且具有较好的均一性，颗粒平均直径在175～225nm之间，且纳米粒子球形度良好，分布较均匀，与SEM电镜一致，测出的纳米颗粒发生团聚现象。
(4)纳米颗粒的稳定性
为了研究纳米颗粒在胃肠道中遇到的pH稳定性问题，本专利设置了两种方案。
方案一：
本专利制备了游离的CAPE溶液、紫胶纳米颗粒溶液以及GA-紫胶纳米颗粒溶液，通过PH计调节溶液PH为1.2，对比以上三种体系在胃PH1.2条件下的稳定性。具体的，因CAPE难溶于水，故先将0.8mgCAPE分散于1ml乙醇内，再用去离子水将溶液补足至50ml，配置游离的CAPE溶液；将0.8mgCAPE与10mg紫胶溶于1ml乙醇内配置紫胶纳米颗粒的内水相溶液，外水相则是10ml去离子水，如例2一般操作，两相溶液放置于微流控装置上制备纳米颗粒溶液，接收后加去离子水补足至50ml；最后将0.8mgCAPE与10mg紫胶溶解于1ml乙醇内配置GA-紫胶纳米颗粒溶液的内水相溶液，称取80mg的GA溶于10ml去离子水中配置外水相溶液，如上所述，制备GA-紫胶纳米颗粒溶液，同样用水补足至50ml。最后，用PH计加入1M的稀盐酸溶液调节三体系溶液PH为1.2，将已调完PH的三种体系溶液置于恒温振荡器上，调节参数为37℃，150rpm连续搅拌，并分别于5、15、30、45、60、90、120min取上清液样，检测三种体系溶液中已降解出来的CAPE量，并计算相应的降解度，降解度计算公式如下：
其中，
C：每次取样的溶液浓度；
V：取样溶液体积；
M：加入CAPE的总质量；
结果讨论：由附图10A所示，三种体系的降解度均随时间增长而上升，游离的CAPE溶液降解速率最快，1h内达到10.59％，而包封CAPE的两个纳米颗粒体系1h内降解度仅达到2.91％与2.62％，游离的CAPE溶液降解度几乎是GA-紫胶纳米颗粒降解度的5倍左右，说明对CAPE进行包封有助于缓解药物的降解。除此之外，还能发现，加入阿拉伯胶的纳米颗粒降解度甚至低于紫胶纳米颗粒，说明加入阿拉伯胶有助于纳米颗粒体系在PH1.2条件下的酸稳定性。
方案二：
本专利在方案二中，设计了不同GA浓度(0～2.5％w/v)的外水相溶液，内水相均采用0.08％w/v的CAPE、1％w/v紫胶以及1:10的SAS配置，制备了相应的不同阿拉伯树胶浓度的纳米颗粒溶液，使用激光粒度仪测出此时的不同溶液的粒径，再通过用1M的稀盐酸溶液调节溶液PH值为1.2，并于1、3、5、7、10、21天检测纳米颗粒溶液的粒径，观察纳米颗粒溶液粒径随时间的变化，并作出相应的曲线结果图。
结果讨论：由附图10B所示，GA浓度为0.8％w/v时，NPS溶液粒径随时间的变化最小，粒径均一且稳定性高，证实了例3研究的GA浓度单因素实验结果；而未添加阿拉伯树胶的纳米颗粒溶液的粒径随时间变化最大，说明本实验采用的阿拉伯树胶确实可以提高纳米颗粒的酸稳定性，并且制备出来的纳米颗粒可以有效包封药物。
(5)纳米颗粒的体外释放
按照药典标准，制备pH1.2的模拟胃酸溶液(不含酶)，pH6.8的模拟小肠液(不含酶)，使用紫外分光光度计测量CAPE的吸光度，测出在320nm处有最大波长，建立CAPE浓度标准曲线如下：
a以模拟胃液作为溶剂：
Y＝0.0696X-0.0091 R2＝0.9998
b以模拟小肠液作为溶剂：
Y＝0.0439X+0.0007 R2＝0.9998
为研究所制备纳米颗粒的体外释放情况，本专利对已制备的纳米颗粒进行体外药物释放实验。因包封的CAPE含量较低，载药率偏低，故实验设计投入70mg的冻干纳米颗粒置于模拟胃液和模拟肠液中处理。将微囊放置与恒温振荡器上37℃，150rpm连续搅拌，每1小时取样检测。
结果讨论：如图11所示，CAPE在胃中有少量的释放，10h内累积释放量达到23.1％，30h内累计释放率达37.6％，而在肠液中CAPE出现大量释放，10h累积释放量达45％，30h达83.6％。纳米颗粒在胃液和肠液中累计释放率的不同是因为包封CAPE的紫胶酸性溶液中难溶，而在碱性溶液中却可溶解。由此可见，纳米颗粒在胃液中能够保持稳定，在肠液中发生降解，说明本发明制备的纳米颗粒能保护CAPE药物不受胃液的影响而失活降解，同时还能实现肠道定位释放包封的CAPE，具有结肠靶向功能。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种阿塞那平透皮贴剂及其制备方法