一种提高羊生产性能和瘤胃健康的复合微生态制剂及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种提高羊生产性能和瘤胃健康的复合微生态制剂及其制备方法和应用 (Composite microecological preparation for improving sheep production performance and rumen health and preparation method and application thereof ) 是由 左瑞雨 常娟 尹清强 韩露 王平 吕战旗 毕梦凡 王利军 李茂龙 刘超齐 党晓伟 于 2021-08-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提高羊生产性能和瘤胃健康的复合微生态制剂及其制备方法和应用,具体涉及微生物制剂领域。所述制剂包括米曲霉1、米曲霉2和产朊假丝酵母菌。所述制剂的制备方法包括米曲霉的培养、产朊假丝酵母菌得培养和混合。所述制剂可用于提高羊的生产性能、羊的瘤胃健康和对纤维的消化。本发明制备的复合微生态制剂可以显著的提高羊的日增重,降低料肉比,提高羊的生产性能；本发明制备的复合微生态制剂可以改善羊的消化功能,提高羊对纤维成分的消化率；羊的基础饲粮中加入本发明制备的复合微生态制剂能够提高羊的血清免疫水平,提高羊的免疫力；本发明制备的复合微生态制剂可以促进羊胃肠道组织结构的完整,降低羊的消化道炎性因子表达,显著提高羊的瘤胃健康。(The invention discloses a composite microecological preparation for improving sheep production performance and rumen health, and a preparation method and application thereof, and particularly relates to the field of microbial preparations. The preparation comprises Aspergillus oryzae 1, Aspergillus oryzae 2 and Candida utilis. The preparation method comprises culturing Aspergillus oryzae, and culturing and mixing Candida utilis. The preparation can be used for improving sheep productivity, sheep rumen health, and fiber digestion. The composite microecological preparation prepared by the invention can obviously improve the daily gain of sheep, reduce the feed conversion ratio and improve the production performance of sheep; the composite microecological preparation prepared by the invention can improve the digestion function of sheep and improve the digestion rate of sheep on fiber components; the composite microecological preparation prepared by the method is added into the basic feed of the sheep, so that the serum immunity level of the sheep can be improved, and the immunity of the sheep can be improved; the composite microecological preparation prepared by the invention can promote the integrity of the tissue structure of the sheep gastrointestinal tract, reduce the expression of inflammatory factors of the sheep digestive tract and obviously improve the rumen health of the sheep.)
技术领域
本发明涉及微生物制剂领域，具体涉及一种提高羊生产性能和瘤胃健康的复合微生态制剂及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，我国养羊业得到了快速发展，但生产中存在精粗饲料比例不平衡，青粗饲料利用效率低，经济效益不高等问题。瘤胃是羊消化青粗饲料的主要场所，青粗饲料饲喂比例不当，以及集约化的饲养条件，使羊的瘤胃消化及健康容易出现各种问题，如何有效地提高羊瘤胃的健康状况，提高青粗饲料的利用率，促进动物健康生长是羊规模化、标准化饲养的关键技术。
研制和开发羊专用的具有提高瘤胃健康和生产性能的复合微生态制剂，对于羊产业的健康和可持续发展具有重要的意义，目前国内外针对提高羊的瘤胃健康、纤维消化和动物生产的有效产品较少。本发明利用能产生多种纤维素酶、蛋白酶和淀粉酶的两种米曲霉和酵母菌制成复合微生态制剂，有效调节羊瘤胃健康和促进粗饲料利用，并提高羊的生产性能及免疫水平。
发明内容
为此，本发明提供一种提高羊生产性能和瘤胃健康的复合微生态制剂及其制备方法和应用，以提高羊的瘤胃健康和生产性能。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
根据本发明的第一方面提供的一种提高羊生产性能和瘤胃健康的复合微生态制剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
步骤一，米曲霉的培养
米曲霉1和米曲霉2分别采用PDA培养基恒温培养箱培养，培养后的孢子用生理盐水冲洗，制成孢子悬浮液，将孢子悬浮液接种于米曲霉固体发酵培养基中恒温培养箱中静置培养，取出固态培养物在60℃以下自然晾干；得米曲霉1固态培养物和米曲霉2固态培养物；
步骤二，产朊假丝酵母菌得培养
产朊假丝酵母菌用YPD培养基液体培养；培养后菌液离心，取出沉淀的菌体，加入冷冻保护剂，然后置于冷冻干燥机中冷冻干燥制成产朊假丝酵母菌冻干菌粉；
步骤三，混合
将米曲霉1固态培养物、米曲霉2固态培养物和产朊假丝酵母菌冻干菌粉充分混匀，即得复合微生态制剂。
进一步的，所述米曲霉(Aspergillus oryzae)1的保藏编号为5817；米曲霉(Aspergillus oryzae)2的保藏编号为65904。
进一步的，所述步骤一中，所述PDA培养基为葡萄糖20.0g，可溶性淀粉6.0g，MgSO4·7H2O 0.3g，KH2PO4 1.0g，酵母2g，大豆蛋白胨5g，琼脂粉15g，用蒸馏水溶解后定容至1L，在121℃、1.034×105Pa条件下高压灭菌后倾倒固体平板而成。
进一步的，所述步骤一中，所述PDA培养基恒温培养箱培养得条件为30℃恒温培养箱培养3d；所述米曲霉固体发酵培养基为麸皮：豆粕：玉米＝7:2:1，添加40％的蒸馏水，搅拌均匀后，在121℃、1.034×105Pa条件下高压蒸汽灭菌20min，冷却后制得。
进一步的，所述步骤一中，所述生理盐水为含体积分数为0.05％Tween 80的灭菌生理盐水。
进一步的，所述步骤一中，米曲霉固体发酵培养基中恒温培养箱中静置培养得条件为30℃恒温培养箱中静置培养5d。
进一步的，所述步骤二中，所述YPD培养基为蛋白胨20g，酵母浸粉10g，葡萄糖20g，加入蒸馏水充分搅拌溶解后定容至1L；所述冷冻保护剂为10％的脱脂乳，所述脱脂乳为脱脂奶粉10％，蔗糖10％，谷氨酸钠1％，海藻糖1％溶解于78％的蒸馏水中，混合均匀即得。
进一步的，所述步骤二中，所述产朊假丝酵母菌用YPD培养基液体培养时间为3d；所述冷冻干燥的温度为-68℃。
优选的，所述制剂种米曲霉菌1孢子数为1.0×104.45CFU/g，米曲霉菌2孢子数为1.0×105CFU/g，产朊假丝酵母菌的活菌数为1.0×105CFU/g。
根据本发明的第二方面提供的上述方法制备的复合微生态制剂，所述制剂包括米曲霉1、米曲霉2和产朊假丝酵母菌。
根据本发明的第三方面提供的上述方法制备的复合微生态制剂，可用于提高羊的生产性能和羊的瘤胃健康。
本发明具有如下优点：
本发明制备的复合微生态制剂可以显著的提高羊的日增重，降低料肉比，提高羊的生产性能；本发明制备的复合微生态制剂可以提高羊饲料中中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维等纤维成分的消化率，提高羊对粗饲料利用率；本发明制备的复合微生态制剂可以提高羊瘤胃纤维素酶活力，改善羊的瘤胃消化功能；羊的基础饲粮中加入本发明制备的复合微生态制剂能够提高羊的血清免疫水平，提高羊的免疫力；羊的基础饲粮中加入本发明制备的复合微生态制剂能够提高羊空肠和瘤胃的组织形态的完整和健康；添加本发明制备的复合微生态制剂能够缓解肝脏、空肠和瘤胃中炎性因子Caspase-3、NF-κB、TNF-α的表达，促进了肝脏、空肠和瘤胃组织的健康。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为本发明提供的一种湖羊空肠组织结构(50×)；其中A为对照组，B为试验组；
图2为本发明提供的一种湖羊瘤胃组织结构(50×)；其中A为对照组，B为试验组；
图3为本发明提供的一种湖羊肝脏组织中炎性因子Caspase-3的表达效果(50×)；其中A为对照组，B为试验组；箭头指向为炎性因子表达处；
图4为本发明提供的一种湖羊肝脏组织中炎性因子NF-κB的表达效果(50×)；其中A为对照组，B为试验组；箭头指向为炎性因子表达处；
图5为本发明提供的一种湖羊肝脏组织中炎性因子TNF-α的表达效果(50×)；其中A为对照组，B为试验组；箭头指向为炎性因子表达处；
图6为本发明提供的一种湖羊空肠组织中炎性因子Caspase-3的表达效果(50×)；其中A为对照组，B为试验组；箭头指向为炎性因子表达处；
图7为本发明提供的一种湖羊空肠组织中炎性因子NF-κB的表达效果(50×)；其中A为对照组，B为试验组；箭头指向为炎性因子表达处；
图8为本发明提供的一种湖羊空肠组织中炎性因子TNF-α的表达效果(50×)；其中A为对照组，B为试验组；箭头指向为炎性因子表达处；
图9为本发明提供的一种湖羊瘤胃炎性因子Caspase-3的表达效果(50×)；其中A为对照组，B为试验组；箭头指向为炎性因子表达处；
图10为本发明提供的一种湖羊瘤胃炎性因子NF-κB的表达效果(50×)；其中A为对照组，B为试验组；箭头指向为炎性因子表达处；
图11为本发明提供的一种湖羊瘤胃炎性因子TNF-α的表达效果(50×)；其中A为对照组，B为试验组；箭头指向为炎性因子表达处。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一种提高羊生产性能和瘤胃健康的复合微生态制剂及其制备方法
PDA固体培养基：葡萄糖20.0g，可溶性淀粉6.0g，MgSO4·7H2O 0.3g，KH2PO41.0g，酵母2g，大豆蛋白胨5g，琼脂粉15g，用蒸馏水溶解后定容至1L，在121℃、1.034×105Pa条件下高压灭菌后倾倒固体平板制得。
YPD培养基：蛋白胨20g，酵母浸粉10g，葡萄糖20g，充分搅拌溶解后定容至1L，即得。
脱脂乳的制备：脱脂奶粉10％，蔗糖10％，谷氨酸钠1％，海藻糖1％，溶剂为蒸馏水；用蒸馏水溶解脱脂乳粉、蔗糖、谷氨酸钠和海藻糖得脱脂乳溶液。
两种米曲霉：米曲霉1(Aspergillus oryzae CGMCC5817)和米曲霉2(Aspergillusoryzae CGMCC 65904)均采用PDA固体培养基在30℃恒温培养箱培养3d。在平板中加入适量体积分数为0.05％Tween 80的灭菌生理盐水，用涂布棒将孢子刮下制成孢子悬浮液。
米曲霉固体发酵培养基为麸皮：豆粕：玉米＝7:2:1，添加40％的蒸馏水，搅拌均匀后，在121℃、1.034×105Pa条件下高压蒸汽灭菌20min，冷却后按1％的接种量加入孢子悬浮液，置于30℃恒温培养箱中静置培养5d后，取出固态培养物于60℃以下自然晾干保存备用。
产朊假丝酵母菌用YPD培养基液体培养3d。培养后菌液离心，取出沉淀的菌体，加入10％脱脂乳作为冷冻保护剂，然后置于冷冻干燥机中-68℃制成冻干菌粉。
将制得的固态培养物和冻干菌粉充分混匀，最终使得每克复合微生态制剂含有的米曲霉菌1孢子数为1.0×104.45CFU/g，米曲霉菌2孢子数为1.0×105CFU/g，产朊假丝酵母菌的活菌数为1.0×105CFU/g。
实验例1复合微生态制剂对羊生产性能的影响
1.动物试验设计与分组
试验选取体重为20kg左右健康状态良好的湖羊60只，分为2组，每组5个重复，每个重复6只羊。分组为：对照组(A组)：饲喂基础饲粮，试验组(B组)：在基础饲粮中按照400g/t添加复合微生态制剂(每千克饲粮中含有米曲霉菌1孢子数为4.0×104.45CFU/kg，米曲霉菌2孢子数为4.0×104CFU/kg，产朊假丝酵母活菌数为4.0×104CFU/kg)。试验期为60d。试验饲粮组成和营养成分如表1所示。
表1 饲粮组成及营养水平(％，干物质基础)
注：1)预混料为每千克饲粮提供Cu 16.0mg，Fe 60.0mg，Mn 59.0mg，Zn 120.0mg，I1.4mg，Se 0.10mg，Co 0.03mg，VA 14400IU，VD 4400IU，VE 30mg。2)营养水平为实测值。
2.饲养管理
试验湖羊饲养于同一羊舍，每个重复的羊在一个圈内进行饲养。试验期内保持羊舍清洁干净、定期消毒。试验湖羊每天上午07:00和下午16:00进行两次饲喂，记录每天喂料量，并在当天下午15:00以及第二天上午06:00定时清理料槽剩料并称重。
3.指标的测定与方法
生长性能的测定：在正试期开始时的第1天、第30天和第60天早晨对每只羊进行空腹称重，记录体重，计算日增重、日采食量、料肉比。
日增重＝总增重/饲养天数。
日采食量＝每天所喂饲料量－每天的剩余饲料量。
料肉比＝采食饲料总量/总增重量。
4.统计分析
试验数据采用Excel 2010进行初步整理，后用SPSS 22.0软件分析，用Duncan氏法进行多重比较，P<0.05为差异显著，结果用“平均值±标准差”表示。
5.结果分析与讨论
由表2可以看出，试验期内各组湖羊的平均日采食量无显著差异(P>0.05)。
试验前期(1～30d)，各组的平均日增重均无显著差异(P>0.05)。试验后期(31～60d)，B组的平均日增重显著高于A组(P<0.05)。从整个试验期(1～60d)来看，B组的平均日增重显著高于A组(P<0.05)。
试验后期(31～60d)和整个试验期(1～60d)，添加复合微生态制剂的B组均显著降低了湖羊的料肉比(P<0.05)。
表2 复合微生态制剂对湖羊生产性能的影响
本试验结果表明：湖羊饲粮中加入复合微生态制剂能够提高平均日增重，降低料肉比。这可能与复合微生态制剂中米曲霉具有多种酶活和酵母菌的有益作用有关，也与添加复合益生菌提高饲料养分消化率的结果相一致。
实验例2复合微生态制剂对羊养分消化率和瘤胃健康的影响
1.样品的采集
粪样的采集：采用全收粪法，在动物试验的26-28d和57-58d，从每组每个重复中各挑一只体重均等的湖羊进行单圈饲养，每天准确记录采食量，完全收集每日粪便，称重。称重后于每组每个重复中取粪便150g左右，加入10％硫酸固氮处理后于-20℃保存。试验结束后将每组每个重复3d收集的粪便混匀，65℃烘干，自然环境下回潮24h后记录重量，粉碎待用。
血样的采集：在60d清晨从每组每个重复中各选一只体重均等的湖羊，空腹颈静脉采血，将采集的血样在3500r/min下离心，分离的血清于-20℃保存。
组织样品的采集：在60d试验结束后，从A组和B组各挑选3只体重均等的湖羊进行屠宰。用生理盐水冲洗空肠肠段，并用手术刀剪剪下1cm；再剪下肝脏边缘组织和面积为3×3cm左右的瘤胃内壁。将采集的组织样品放入10％福尔马林固定液中保存并做好标记。
2.指标的测定与方法
养分消化率的测定：饲料和粪中的粗蛋白含量测定参照GB/T 6432-2018，粗脂肪的测定参照GB/T 6433-2006，钙的测定参照GB/T 6436-2018，总磷的测定参照GB/T 6437-2018，中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)的测定按照范氏(Van Soest)洗涤纤维分析法进行。
血清生化指标的测定：使用全自动生化分析仪(BK-Au5800)，测定血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、尿素氮(BUN)、葡萄糖(GLU)、总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、乳酸脱氢酶(LDH)的含量。
采用可见分光光度法，测定血清中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)的含量。以上试剂盒均购自索莱宝生物科技有限公司。
采用酶联免疫方法，测定血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)、干扰素(IFN-γ)、CD4+、CD8+的含量。以上试剂盒均购自酶联生物科技有限公司。
组织形态结构观察：运用HE染色法。瘤胃、肝脏、空肠组织经水洗、脱水、包埋制成6μm厚度的切片，经苏木精-伊红染色后，用二甲苯做透明处理，最后用中性树脂封片，用生物光学显微镜观察。
免疫组化测定：采用Sp法。切片脱蜡处理，PBS冲洗3次(5min/次)；柠檬酸抗原修复10min，PBS浸泡3次(5min/次)；3％H2O2封闭内源性过氧化物酶，室温20min，PBS浸泡3次(5min/次)；滴加山羊血清(50μL/片)，室温封闭内源性生物素20min；除去封闭液，滴加一抗(1:100，50μL/片)，4℃过夜；除去一抗，PBS浸泡3次(5min/次)，滴加二抗(50μL/片)，37℃30min，PBS浸泡3次(5min/次)；滴加辣根酶标记卵酶链白素(50μL/片)，37℃30min，PBS浸泡3次(5min/次)，DAB显色，棕色出现后终止，苏木素复染，梯度酒精脱色，二甲苯透明处理，中性树脂封片，生物光学显微镜观察。
3.统计分析
免疫组化结果分析：采用阳性细胞数和阳性细胞颜色两部分进行综合判定。阳性细胞数分为四个等级：阳性细胞总数小于5％，评分为0分；阳性细胞总数为6％－20％，评分为1分；阳性细胞总数为21％－50％，评分为2分；阳性细胞总数大于50％，评分为3分。阳性细胞颜色同样分为四个等级：无色(0分)、淡黄色(1分)、棕黄色(2分)、棕褐色(3分)。阳性细胞数和阳性细胞颜色评分的乘积就是总评分，总评分为0时，说明细胞无损伤；总评分为1-2时，说明细胞有轻微损伤；总评分为3-4时，说明细胞损伤程度较高；总评分大于6时，说明细胞凋亡坏死严重。总之，总评分越高，说明细胞受损程度严重。
试验数据采用Excel 2010进行初步整理，后用SPSS 22.0软件分析，用Duncan氏法进行多重比较，P<0.05为差异显著，结果用“平均值±标准差”表示。
4.结果分析与讨论
4.1复合微生态制剂对湖羊养分消化率的影响
由表3可以看出，试验前期(1～30d)和后期(31～60d)，饲料中添加复合微生态制剂均显著提高了饲料中中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)的消化率(P<0.05)，纤维成分是饲草中的主要营养成分，米曲霉1和米曲霉2在实验室前期的研究中发现均具有较高的纤维酶活，这说明添加复合微生态制剂对饲料纤维成分的消化发挥了显著的作用。
表3 复合微生态制剂对湖羊养分消化率的影响(％)
4.2复合微生态制剂对湖羊瘤胃消化酶活的影响
由表4可以看出，饲料中添加复合微生态制剂，显著提高了湖羊消化道纤维素酶活，该结果也进一步揭示了复合微生态制剂提高湖羊饲料纤维消化率的原因及作用。
表4 复合微生态制剂对湖羊瘤胃消化酶活的影响
4.3复合微生态制剂对湖羊血清生化指标的影响
由表5可以看出，添加复合微生态制剂对湖羊血清常规生化指标无显著影响，但显著提高了CD4+含量和CD4+/CD8+比值(P<0.05)。CD4+/CD8+是评价细胞免疫功能的重要指标，CD4+/CD8+升高，表明细胞免疫功能提高。本结果表明：湖羊基础饲粮中加入复合微生态制剂能够提高湖羊血清免疫水平。
表5 复合微生态制剂对湖羊血清抗氧化和免疫指标的影响
4.4复合微生态制剂对湖羊空肠组织结构的影响
由图1可以看出，A组的空肠绒毛形态正常，绒毛长度较长且排列整齐。B组相较于A组，绒毛数量相对较多，长度和形态没有明显区别。A组和B组隐窝深度没有明显区别。由表6可以看出，B组绒毛高度和隐窝深度的比值显著高于A组(P<0.05)。
表6 复合微生态制剂对湖羊空肠绒毛高度和隐窝深度的影响
由图2可以看出，A组瘤胃形态完整，瘤胃肌层充实，瘤胃乳突较明显。B组相较于A组，瘤胃肌层较厚，乳突数量较多且长度较长。以上说明添加复合微生态制剂提高了湖羊肠道和瘤胃的组织的健康。
4.5复合微生态制剂对湖羊组织中炎性因子表达的影响
综合表7结合图3、图4、图5可以看出，在肝脏组织内，添加400g/t复合微生态制剂组无论是在阳性细胞数量上，还是阳性细胞颜色上，均缓解了肝脏炎性因子Caspase-3、NF-κB、TNF-α的表达，促进了肝脏组织结构的健康；综合表7结合图6、图7、图8可以看出，在空肠组织内，添加400g/t复合微生态制剂组无论是在阳性细胞数量上，还是阳性细胞颜色上，均缓解了空肠炎性因子Caspase-3、NF-κB、TNF-α的表达，促进了组织结构的健康；综合表7结合图9、图10、图11可以看出，在瘤胃组织内；添加400g/t复合微生态制剂组无论是在阳性细胞数量上，还是阳性细胞颜色上，均缓解了瘤胃炎性因子Caspase-3、NF-κB、TNF-α的表达，促进了组织结构的健康。
表7 湖羊组织免疫组化评分表
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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