具体实施方式

本发明是与植入体强结合兼具抗菌耐蚀性纳米复合涂层及制备方法，与植入体强结合兼具抗菌耐蚀性纳米复合涂层，所述的纳米复合涂层，包括耐蚀结合层和抗菌层；所述的耐蚀结合层为聚多巴胺涂层-PDA涂层；所述的抗菌层是单独的纳米氧化锌涂层-ZnO涂层，或是单独的氧化石墨烯涂层-GO涂层，或是纳米氧化锌-ZnO和氧化石墨烯-GO组合涂层。

本发明的纳米复合涂层采用了层层组装的设计，形成独特的“三明治结构”。具有制作简单和可以应用在具有复杂结构植入体表面的特点。

以上所述的纳米复合涂层，所述的PDA涂层的厚度为1-50nm，所述的纳米ZnO涂层的厚度为10-160nm，所述的GO涂层的厚度为0.1-2.0nm，所述的纳米ZnO和GO组合涂层的厚度为10.1-162.0nm，其中纳米ZnO涂层的位置在GO涂层的下方。

以上所述的纳米复合涂层，所述的纳米复合涂层的层数为2-3层，优选为2层。

以上所述的纳米复合涂层，所述的耐蚀结合层为PDA涂层，所述的抗菌层为纳米ZnO涂层和GO涂层中的任一种或是两种的组合。

本发明的与植入体强结合兼具抗菌耐蚀性纳米复合涂层的制备方法，其步骤为：

步骤（1）在植入体的表面制备PDA涂层；

步骤（2）在步骤（1）所得植入体表面制备GO涂层，得到与植入体强结合并兼具抗菌和耐蚀性能的聚多巴胺-氧化石墨烯纳米复合涂层，即GP纳米复合涂层；

步骤（3）在步骤（1）所得植入体表面制备纳米ZnO涂层，得到与植入体强结合并兼具抗菌和耐蚀性能的聚多巴胺-纳米氧化锌纳米复合涂层，即ZP纳米复合涂层；

步骤（4）在步骤（3）所得植入体表面制备GO涂层，得到与植入体强结合并兼具抗菌和耐蚀性能的聚多巴胺-纳米氧化锌-氧化石墨烯纳米复合涂层，即GZP纳米复合涂层。

以上所述的制备方法，步骤（1）所述植入体为医用金属，包括不锈钢，或者钴合金，或者钛，或者钛合金，或者形状记忆合金，或者贵金属，或纯金属中的一种或至少两种的组合，优选为钛合金。

以上所述的制备方法，步骤（1）所述的制备PDA涂层的方法为溶液氧化法，首先利用三羟基氨基甲烷盐酸盐制成缓冲液，之后加入盐酸多巴胺盐，在合适的温度和碱性环境下，多巴胺单体能在碱性溶液中进行自聚合反应形成PDA涂层，氧气为氧化剂。

以上所述的制备方法，在步骤（2）中制备GP纳米复合涂层的方法为GO悬浮液涂敷法，具体步骤为：

分步骤（1）将采用改进的Hummers法所得的产物移至离心管中加入稀盐酸和去离子水交替离心四次后，使用去离子水清洗离心管三次倒入培养皿中，对离心产物进行冷冻干燥和真空干燥处理，最后研磨成粉体；

分步骤（2）将分步骤（1）所得的粉体取一定量添加到去离子水中超声分散，之后于离心机中离心制备成一定浓度的GO悬浮液；

分步骤（3）将分步骤（2）所得的GO悬浮液移取滴铸到步骤（1）中覆有PDA层的植入体表面，之后置于真空干燥箱中干燥一段时间获得GP纳米复合涂层。

以上所述的制备方法，在步骤（3）中制备ZP纳米复合涂层的方法为无晶种的水热法；将硝酸锌和六次甲基四胺配置成浓度相同的溶液混合搅拌均匀；在合适的温度下，将步骤（1）所得植入体放入混合溶液中，快速升温至一定温度，反应一段时间后，溶液为无色透明状，使用去离子水冲洗，在一定干燥温度下干燥一段时间后得到ZP纳米复合涂层；

在步骤（4）中制备GZP纳米复合涂层的方法为无晶种的水热法和GO悬浮液涂敷法，在步骤（3）的基础上涂敷GO悬浮液获得GZP纳米复合涂层。

下面进一步展开本发明的内容：本发明中，通过利用PDA对金属离子的螯合作用和本身具有丰富官能团的特性，在植入体表面形成一层耐蚀强结合的PDA涂层，之后在PDA涂层上采用三种方式制备抗菌涂层，制得与植入体强结合并兼具抗菌和耐蚀性能的纳米复合涂层；其中制备抗菌涂层的方式包括：方式一，采用涂敷法在PDA涂层表面涂敷一定浓度的GO悬浮液，GO自然沉积在PDA涂层表面形成聚多巴胺-氧化石墨烯纳米复合涂层（简称GP涂层），其抗菌效果取决于GO悬浮液的浓度，通过调配到合适的浓度，GO能最大程度发挥抗菌的作用；方式二，通过无晶种的水热法在PDA涂层上制备纳米ZnO涂层，制成聚多巴胺-纳米氧化锌纳米复合涂层（简称ZP涂层），通过控制实验条件，使纳米ZnO调整到最佳的形态达到较好的抗菌效果；方式三，首先通过无晶种的水热法在PDA涂层上制备纳米ZnO涂层，之后在制得的ZP纳米复合涂层的基础上涂敷GO悬浮液，形成聚多巴胺-纳米氧化锌-氧化石墨烯纳米复合涂层（简称GZP涂层），GO可以控制纳米氧化锌的析出速度，使得抗菌元素释放的速度适中，在纳米ZnO和GO的协同作用下达到最佳的抗菌性能。

所述的PDA涂层的厚度为1~50nm，可以是1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、21nm、22nm、23nm、24nm、25nm、26nm、27nm、28nm、29nm、30nm、31nm、32nm、33nm、34nm、35nm、36nm、37nm、38nm、39nm、40nm、41nm、42nm、43nm、44nm、45nm、46nm、47nm、48nm、49nm、50nm，优选为40~50nm。

所述的纳米ZnO涂层的厚度为10~160nm，可以是10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm，优选为40~120nm。

所述的GO涂层的厚度为0.1~2nm，可以是0.1nm、0.2nm、0.3nm、0.4nm、0.5nm、0.6nm、0.7nm、0.8nm、0.9nm、1.0nm、1.1nm、1.2nm、1.3nm、1.4nm、1.5nm、1.6nm、1.7nm、1.8nm、1.9nm、2.0nm，优选为0.5~1.5nm。

所述的纳米ZnO和GO组合涂层的厚度为10.5~161.5nm，可以是10.5nm、11nm、11.5nm、20.5nm、21nm、21.5nm、30.5nm、31nm、31.5nm、40.5nm、41nm、41.5nm、50.5nm、51nm、51.5nm、60.5nm、61nm、61.5nm、70.5nm、71nm、71.5nm、80.5nm、81nm、81.5nm、90.5nm、91nm、91.5nm、100.5nm、100nm、101.5nm、110.5nm、111nm、111.5nm、120.5nm、121nm、121.5nm、130.5nm、131nm、131.5nm、140.5nm、141nm、141.5nm、150.5nm、151nm、151.5nm、160.5nm、161nm、161.5nm，优选为40.5~121.5nm。

所述的纳米复合涂层的层数为2-3层，例如可以是2层、3层，优选为2层。

本发明中所述的PDA涂层可以是1层或多层，所述的纳米ZnO涂层可以是1层或多层，所述的GO涂层可以是1层或多层，所述的纳米ZnO和GO组合涂层可以是2层或多层，根据植入体的具体形状可以自由的选择上述所有涂层的层数，本发明中选择PDA涂层为1层，纳米ZnO涂层为1层，GO涂层为1层，纳米ZnO和GO组合涂层为2层，其中纳米ZnO涂层的相对位置在GO涂层之下。

本发明中，所述的PDA涂层作为结合层与其他基底和抗菌涂层之间实现牢固结合的方法相比，使用PDA共价接枝对于具有复杂结构的材料表层形成功能化且具有粘附性的活性涂层更为有利。这是因为PDA含有丰富的官能团，表现出了在水环境中的强粘附性质，并且这种性质没有材料选择性，在几乎任何种类、形态、尺寸的材料表面都能够吸附，进行材料表面修饰的方法也很方便，易于在无机和有机的材料表面沉积，简单的浸泡或浸润方式就可以得到很好的修饰效果，且PDA可以长期稳定的存在于植入体表面。

本发明中，所使用的纳米ZnO和GO作为抗菌材料相较于其他抗菌材料，能够在人体内降解，且锌作为人体的微量元素，在提高生物相容性的同时，还可以降低细胞毒性。

优选地，所述的抗菌涂层包括纳米ZnO涂层或GO涂层中的任意一种或是两种的组合。

本发明提供一种如上所述的纳米涂层的制备方法，所述的方法包括如下：

（1）在植入体的表面制备PDA涂层；

（2）在步骤（1）所得植入体表面制备GO涂层，得到与植入体强结合并兼具抗菌和耐蚀性能的GP纳米复合涂层；

（3）在步骤（1）所得植入体表面制备纳米ZnO涂层，得到与植入体强结合并兼具抗菌和耐蚀性能的ZP纳米复合涂层；

（4）在步骤（3）所得植入体表面再制备GO涂层，得到与植入体强结合并兼具抗菌和耐蚀性能的GZP纳米复合涂层；

优选地，步骤（1）所述植入体为医用金属，包括不锈钢、钴合金、钛、钛合金、形状记忆合金、贵金属或纯金属中的一种或至少两种的组合，优选为钛合金（Ti6Al4V）。

步骤（1）之前还包括预处理，具体包括：清洗植入体的表面，去除植入体表面的附着物。

所述清洗为将植入体在溶剂中超声清洗10~20min，可以是10min、11min、12 min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min，优选为15min。

所述溶剂包括丙酮、无水乙醇、去离子水。

以上所述清洗的具体步骤为：

（1′）将植入体在丙酮中超声清洗15min；

（2′）将步骤（1′）所得植入体在无水乙醇中超声清洗15min；

（3′）将步骤（2′）所得植入体在去离子水中超声清洗15min。

步骤（1）所述制备 PDA涂层的方法为溶液氧化法，首先利用三羟基氨基甲烷盐酸盐制成缓冲液，之后加入盐酸多巴胺盐，在合适的温度和碱性环境下，多巴胺单体能在碱性溶液中进行自聚合反应形成PDA涂层，氧气为氧化剂。

所述三羟基氨基甲烷盐酸盐的用量为0.07~0.08g，可以是0.0711g，0.0722g，0.0733g，0.0744g，0.0755g，0.0766g，0.0777g，0.0788g，0.0799g，0.0800g，优选为0.0788g。

所述盐酸多巴胺盐的用量为0.05~0.15g，可以是0.05g，0.06g，0.07g，0.08g，0.09g，0.10g，0.11g，0.12g，0.13g，0.14g，0.15g，优选为0.10g。

所述碱性环境的pH值为7~9，可以是7，7.5，8.，8.5，9，优选为8.5。

所述合适的温度15~30℃，例如可以是，15℃，20℃，25℃，30℃，优选为25℃。

在缓冲液的pH调到8.5后加入多巴胺盐酸盐，pH将降低0.05左右。在25℃下将缓冲液中加入多巴胺盐酸盐调节pH至8.5测其pH，发现在前30min反应较快，溶液pH在8.27-8.29时变为棕色，40min后溶液（pH为8.23）变为棕黑色，继续反应90min后pH在8.21-8.23区间变动，其后反应pH变化较为缓慢，13h后pH为8.12，16h后为8.09，24h反应结束pH值为8.04。由此推测整个反应为消耗OH^-释放H⁺的反应，反应处于平衡时则消耗H⁺。因此，在室温（25℃）下，氧气较为充足的溶液（pH为8.5）为制备PDA涂层的最佳条件。

步骤（2）所述的制备GO涂层的具体步骤如下：

（1″）将采用改进的Hummers法所得的产物移至离心管中加入稀盐酸和去离子水交替离心四次后，使用去离子水清洗离心管三次倒入培养皿中，进行冷冻干燥和真空干燥处理，最后研磨成粉体；

（2″）将步骤（1″）所得的粉体取一定量添加到去离子水中超声分散，之后于离心机中离心，制备成一定浓度的GO悬浮液；

（3″）将步骤（2″）所得的GO悬浮液移取滴铸到覆有PDA层的植入体表面，之后置于真空干燥箱中干燥一段时间获得GP纳米复合涂层；

在步骤（1″）中稀盐酸稀释的比例为HCl:H₂O=1/5~1/15，可以是1/5，1/10，1/15，优选为1/10。

在步骤（1″）中冷冻干燥的温度为-75~-90℃，可以是-75℃，-80℃，-85℃，-90℃，优选为-80℃。

在步骤（1″）中冷冻干燥的时间为7~9h，可以是7h，7.5h，8h，8.5h，9h，优选为8 h。

在步骤（1″）中真空干燥的时间为12~48h，可以是12h，24h，48h，优选为24 h。

在步骤（2″）中超声分散的时间为1~2h，可以是1h，1.5h，2h，优选为1.5 h。

在步骤（2″）中氧化石墨烯的浓度为0.10mg/mL、0.25mg/mL、0.50mg/mL，优选为0.10mg/mL；

在步骤（3″）中真空干燥的温度为35~40℃，例如可以是35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃，优选为37℃。

在步骤（3″）中真空干燥的压强为20~30KPa，例如可以是20KPa，21KPa，22KPa，23KPa，24KPa，25KPa，26KPa，27KPa，28KPa，29KPa，30KPa，优选为25KPa。

在步骤（3″）中真空干燥的时间为5~7h，例如可以是5h，5.5h，6h，6.5h，7h，优选为6h。

涂敷GO悬浮液的浓度过高时，在沉积的过程中在PDA涂层的表面形成的GO层的缺陷较多，原因在于随着浓度的增加GO涂层的水接触角不断增大，导致材料的润湿性降低，因而涂层表面出现凹凸不平的缺陷；浓度过低时，形成的GO涂层不够致密，抗菌效果较差；当GO悬浮液浓度合适时才能达到较好的抗菌效果。

步骤（3）所述的制备纳米ZnO涂层具体步骤如下：

采用无晶种的水热法制备纳米ZnO涂层，将硝酸锌和六次甲基四胺配置成浓度相同的溶液搅拌混合均匀。在合适的温度下，将含有PDA涂层的植入体放入混合溶液中，快速升温至一定温度，反应一段时间后，溶液为无色透明状，使用去离子水冲洗。在一定温度下干燥一段时间后得到ZP纳米复合涂层。

所述的硝酸锌的用量为0.1~0.3g，取适量的硝酸锌完全溶于去离子水中配置成一定浓度的溶液，优选为硝酸锌的用量为0.2975g溶于100mL的去离子水中配置成0.01mol/L的溶液。

所述的六次甲基四胺粉末（HMT）的用量为0.05~0.15g，取适量的HMT完全溶于去离子水中配置成预设浓度的溶液，优选为HMT的用量为0.1402g溶于100mL的去离子水中配置成0.01mol/L的溶液。

所述合适的温度为50~60℃，可以是50℃，55℃，60℃，优选为55℃。

所述升温至预设温度为80~95℃，可以是80℃，85℃，90℃，95℃，优选为90℃。

所述反应时间为2~3h，可以是2h，2.5h，3h，优选为2.5h。

所述干燥温度为50~70℃，可以是50℃，55℃，60℃，65℃，70℃，优选为60℃。

所述的干燥时间为5~7h，可以是5h，5.5h，6h，6.5h，7h，优选为6h。

PDA的螯合作用可以增强反应初期纳米ZnO晶核的稳定性，在PDA涂层上形成大量细小的簇状纳米ZnO。簇状纳米ZnO呈规则的六棱柱型，具有较高的表面能和反应活性，不仅可以通过释放Zn⁺和光诱导产生H₂O₂等化学相互作用来达到杀菌的目的，而且有利于成骨细胞在其表面加速附着和增殖。

本发明的纳米复合涂层可以用于修饰植入性医疗器械中。所述的植入性医疗器械包括骨钉、骨板、硬组织替代物、心脏支架、人工关节或心脏起搏器中的任意一种或至少两种的组合。

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例1：

本发明的纳米复合涂层，其制备方法的流程图如图1所示，具体如下：

（1）将抛光好的钛合金（Ti6Al4V）作为基体，分别在丙酮、无水乙醇、去离子水中超声清洗15min；

（2）在步骤（1）所得钛合金基体表面采用溶液氧化法制备PDA涂层，三羟基氨基甲烷盐酸盐的用量为0.0788g，盐酸多巴胺盐的用量为0.1000g，溶液环境的pH值为8.5，反应温度为25℃，PDA层的厚度50nm；PDA涂层的抗菌效果见图2；耐蚀性见图7~图12所示。

（3）在步骤（2）所得PDA涂层表面，采用改进的Hummers法和冷冻干燥处理制备GO粉体，首先将采用改进的Hummers法所得的产物在-80℃温度下预冷冻8h，然后移至冷冻干燥机中处理24h，最后研磨成粉；

（4）在步骤（3）所得GO粉体，取100mg添加到1000mL去离子水中超声分散1.5h，之后于离心机中离心15min，制备0.10mg/mL的GO溶液；

（5）在步骤（4）所得GO悬浮液，移取0.25mL 0.10mg/mL的GO悬浮液滴铸到覆有PDA层的钛合金基材表面，之后置于真空干燥箱中在37℃，25KPa环境下干燥6h，获得0.10-GP纳米复合涂层（代表涂敷有 0.10mg/mL的GO悬浮液的GP纳米复合涂层）；抗菌效果见图3，耐蚀性结果见图7和图8。

实施例2：

本发明的纳米复合涂层，其制备方法的流程图如图1所示，具体如下：

（1）将抛光好的钛合金（Ti6Al4V）作为基体，分别在丙酮、无水乙醇、去离子水中超声清洗15min；

（2）采用和实施例1相同的方式制备PDA涂层；

（3）在步骤（2）所得PDA涂层表面采用无晶种的水热法制备纳米ZnO涂层，将0.2975g Zn（NO₃）₂·6H₂O和0.1402g六次甲基四胺（HMT）粉末分别溶于100mL去离子水中配置成浓度为0.01mol/L的溶液；

（4）步骤（3）所得的溶液在55℃下，将HMT溶液倒入Zn（NO₃）₂溶液中搅拌混合均匀，随后放入涂敷有PDA涂层的钛合金基材，然后快速升温至预设温度90℃，随着溶液温度的升高，溶液由无色变浑浊，反应2.5 h后，溶液呈无色透明状态，使用去离子水冲洗钛合金基材，并在60℃下干燥6 h，获得ZP纳米复合涂层；抗菌效果见图5，耐蚀性结果见图9和图10。

实施例3：

本发明的纳米复合涂层，其制备方法的流程图如图1所示，具体如下：

（1）将抛光好的钛合金（Ti6Al4V）作为基体，分别在丙酮、无水乙醇、去离子水中超声清洗15min；

（2）采用和实施例1相同的方式制备PDA涂层；

（3）采用和实施例2相同的方式制备ZP纳米复合涂层；

（4）在步骤（3）所得的ZP纳米复合涂层的表面通过涂敷GO悬浮液制备GZP纳米复合涂层。滴加0.25 mL 0.1mg/mL GO溶液于ZP纳米复合涂层表面，在37℃、25KPa下真空干燥6h，获得0.10−GZP纳米复合涂层（代表涂敷有 0.10mg/mL的GO悬浮液的GZP纳米复合涂层）；抗菌效果见图6，耐蚀性结果见图11和图12。

对比例1：

与实施例1相比，除了不增加GO抗菌涂层外，其他条件同实施例1。

对比例2：

与实施例1相比，除了GO悬浮液的浓度为0.25mg/mL外，制得0.25-GP纳米复合涂层，其他条件同实施例1。

对比例3：

与实施例1相比，除了GO悬浮液的浓度为0.50mg/mL外，制得0.50-GP纳米复合涂层，抗菌结果见图4，其他条件同实施例1。

对比例4：

与实施例3相比，除了GO悬浮液的浓度为0.25mg/mL外，制得0.25-GZP纳米复合涂层，其他条件同实施例3。

对比例5：

与实施例3相比，除了GO悬浮液的浓度为0.50mg/mL外，制得0.50-GP纳米复合涂层，其他条件同实施例3。

纳米复合涂层腐蚀结果显示：

在实施例1中，GO涂层与PDA涂层具有协同耐蚀作用。0.10−GP试样具有最好的耐蚀性能，说明低浓度GO悬浮液形成的GO层缺陷少，对腐蚀性离子阻隔能力更好。腐蚀性能结果显示，GZP试样较ZP试样耐蚀性能显著提升，一方面是由于GO层的存在降低了涂层润湿性，另一方面GO层可以阻挡腐蚀离子与基底金属界面的接触。

在实施例3中，GO、纳米ZnO与PDA层表现出协同耐蚀作用。低浓度GZP纳米复合涂层具有较好的耐蚀性能，在对比例5中高浓度0.50−GZP纳米复合涂层因GO层缺陷较多，表现出较其他涂层差的耐蚀性能。

纳米复合涂层抗菌结果显示，通过图中平板细菌数结果计算抗菌率。抗菌率=（对照组菌落数-实验组菌落数）÷对照组菌落数×100%。

在实施例1中，GP纳米复合涂层较PDA层具有显著的抗菌作用，抗菌率与GO浓度呈正相关，随着浓度增大，在培养箱光源下抗菌率从0.10−GP纳米复合涂层的90.1%，增加至对比例中0.50−GP纳米复合涂层的99.1%。

在实施例2中ZP纳米复合涂层对E.coli（大肠杆菌）具有97%以上的杀菌作用。GZP纳米复合涂层较对比例1中的PDA层具有显著的抗菌作用，但相比于ZP纳米复合涂层对E.coli杀菌率降至约为87%，这是因为GO层截留了菌液，并非完全接触纳米ZnO，而实施例1中的低浓度GO杀菌作用较弱。同时也说明该复合涂层纳米ZnO起到主要抗菌作用。

纳米复合涂层结合力测试：

实施例1-3的超声震荡测试结果如表1所示：

利用超声震荡法测定震荡前后试样质量变化，由表1可知，每组试样前后各测五次质量，取其平均值。通过测试发现在加热超声条件下PDA涂层的质量略微减少，原因是在SBF溶液（模拟体液）中一些物理结合的多巴胺存在脱落造成的。由于样品本身质量较小，而且在沉积PDA以后的样品相比较基底质量在0.1 mg上无变化，所以对超声前后样品的质量在0.1 mg后的值予以保留。

每个试样用精密分析天平称量五次质量以后，将试样放入装满SBF溶液的锥形瓶中塞上塞子，放入超声波清洗仪中，开启加热，将超声频率调至40 kHz，超声震荡30 min后，用超纯水冲洗干净吹干后再次称量，同样称量五次，对比超声前后的质量平均值，质量有一定的损失，但是在PDA上涂覆纳米ZnO的试样质量损失相对于直接在基底上涂覆纳米ZnO的试样相对降低，从表1的差值可以看出，PDA的确增强了纳米ZnO涂层与基底的结合力。

综上，通过层层组装的结构设计，采用纳米氧化锌和氧化石墨烯作为联合抗菌剂，利用聚多巴胺对金属离子的鳌合作用，在植入体表面制备出一种与植入体强结合并兼具抗菌和耐蚀性能的纳米复合涂层。所述纳米复合涂层由耐蚀结合涂层和抗菌涂层组成，其中耐蚀结合层为聚多巴胺涂层；抗菌涂层为纳米氧化锌涂层和氧化石墨烯涂层中的任一种或两种的组合。该纳米复合涂层制备工艺简单，涂层具有抗菌、耐蚀和与基体强结合的综合效应，是应用于具有复杂结构植入体表面修饰的理想涂层。

本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。