具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1线纹海马抗菌肽hepcidin(HeHampⅡ-4)序列的确定

本发明基于线纹海马基因组和转录组数据库，筛选获得HeHampⅡ-4的cDNA序列，从线纹海马组织中克隆获得该抗菌肽序列，具体步骤为：

以成年雄性海马的肝脏组织为材料，使用TRIzol试剂(Invitrogen公司，Waltham,MA,USA)，按照其附带的说明书，提取总RNA。使用ReverAce qPCR RT Master Mix withgDNA Remover(Toyobo,Osaka,Japan)试剂盒，取1微克总RNA用于cDNA第一链的合成。采用Primer 5.00(Palo Alto,CA)设计该基因的特异性引物F，R(F:5'-ATGAAGCCCTTCAGTTTGTC-3'；R:5'-TTAGAATCTCCATTCGCAGC-3')，用于扩增HeHampⅡ-4的开放阅读框(ORF)。本研究中PCR反应遵循如下循环参数:95℃5min；95℃30s,60℃30s,72℃1min共36个循环；72℃10min。使用E.Z.N.AGel Extraction Kit(Omega Bio Tek,Norcross,GA,USA)纯化相应分子质量的DNA产物。挑选3个阳性克隆由生工生物技术有限公司测序(Shanghai,China)。扩增获得的线纹海马HeHampⅡ-4的cDNA开放阅读框的片段为267bp,编码88个氨基酸残基(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)。其氨基酸序列结构由信号肽、前导肽和成熟肽组成，与已报道的抗菌肽hepcidin家族有明显的相似性，故线纹海马HeHampⅡ-4是hepcidin家族的一个新成员。

实施例2线纹海马抗菌肽hepcidin(HeHampⅡ-4)成熟肽的生物学活性检测

HeHampⅡ-4成熟肽的合成

成熟肽HeHampⅡ-4(63-88)的氨基酸序列为：HSGPCKFCCNCCGRMHFCGFCCEWRF，或如SEQ ID NO:1所示。采用固相多肽合成法，由GenScript生物技术公司(南京，中国)合成。该合成肽的分子质量和纯度分别为2.747kD和96.1％。合成肽在使用前以干粉的形式储存在-80℃。

微生物凝集试验

凝集实验所用革兰氏阴性菌：副溶血弧菌、哈氏弧菌、大肠杆菌、多耐药大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、鲍曼不动杆菌耐药株、克雷伯氏肺炎菌、鼠伤寒沙门氏菌；革兰氏阳性菌：苏云金芽孢杆菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌；真菌：白假丝酵母菌。细菌(非弧菌)用营养肉汤(NB)、MH肉汤培养基进行培养，弧菌用2216E培养基进行培养，真菌用YPD培养基进行培养。最适温度培养至对数期，取微生物细胞于室温下4000×g离心5分钟，再用TBS缓冲液(10mM Tris-HCl，150mM氯化钠，pH值7.4)洗涤三次，然后用TBS缓冲液重悬至OD₆₀₀＝0.6。将上述合成肽溶于无菌水中，然后加入到含微生物的溶液中，再加入10mM CaCl₂进行混合后，使菌液OD₆₀₀值为0.3，使微生物凝集实验时的蛋白终浓度分别为3μM、6μM和12μM。同时用BSA(牛血清白蛋白，2mg/mL)作为对照，每组设置三个重复。在光学显微镜(德国LEICA dmi4000b)下观察凝集反应，结果如表1所示。

表1 HeHampⅡ-4(63-88)的微生物凝集活性

其中，“+++”是指有95％-100％的菌体凝集；“++”是指有70％-95％的菌体凝集；“+”是指有30％-70％的菌体凝集；“-”是指有无可见菌体凝集。

从表1可知，合成肽HeHampⅡ-4(63-88)对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌均具有良好的凝集作用，尤其对耐药菌株(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、多耐药大肠杆菌、鲍曼不动杆菌耐药株)同样具有良好的凝集活性，体现了该肽的抗菌广谱性；在蛋白浓度为3μM时，即出现了明显的凝集现象。

实施例3细菌内毒素抑制实验

本实验所用试剂及耗材均为无菌，无内毒素。

将大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和副溶血弧菌在最适温度下孵育过夜后收集菌体，用1×PBS洗涤3次，用1×PBS重悬至1×10⁵cfumL^-1。实验组为：合成肽与菌液等体积混合(处理大肠杆菌和副溶血弧菌时，蛋白和菌液的混合液中，蛋白的终浓度为6μM；处理鲍曼不动杆菌时，蛋白和菌液的混合液中，蛋白的终浓度为6μM)；对照组为：蛋白溶剂(体积比为千分之一的DMSO溶液)与菌液等体积混合，并且选择大黄鱼hepcidin的成熟肽(PC-hepc)作为参照，每组设置三个重复。室温条件下，在多肽和细菌共孵育后的第0.5h,1.5h和3h，用0.22μM的滤头过滤除去细菌，用鲎试剂内毒素检测试剂盒(BIOENDO，中国)检测细菌游离内毒素的浓度。大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和副溶血弧菌内毒素释放结果分别如图1、图2和图3所示。

从图1、图2和图3可知，海马hepcidin成熟肽HeHampⅡ-4(63-88)能够抑制细菌游离内毒素释放，并且其作用显著强于大黄鱼hepcidin成熟肽PC-hepc。

实施例4细胞毒性实验

当线纹海马胚胎细胞的密度达到90％以上后，进行传代。先弃尽培养基，1mLHBSS洗涤后用1mL胰蛋白酶消化30s至悬浮状态。用培养基(80％DMEM，20％胎牛血清FBS，1x双抗)稀释细胞悬液，使细胞浓度为1×10⁵个/mL，向96孔细胞培养板中加入稀释的细胞悬液，每孔100μL，28℃恒温过夜培养。实验前，吸出培养基，加入100μL含有HeHampⅡ-4(63-88)多肽的DMEM培养基，蛋白终浓度为96μM、48μM和24μM，每个浓度设置三个平行，并以等体积添加不含多肽的DMEM培养基作为对照，28℃培养24h。吸出旧培养基，每孔加入100μLDMEM新鲜培养基及10μL的CCK-8试剂，避光培养4h后，测定吸光度A450nm，计算统计出细胞的存活率：

1.对照组(蛋白终浓度为0μM)的三个平行样A450nm吸光值为A1,A2,A3,他们的平均值为A。A1/A,A2/A,A3/A为对照组的细胞存活率。

2.每个实验组(蛋白终浓度为24μM，48μM，96μM)的三个平行样的A450nm吸光值分别为B1、B2、B3，分别除以A即得细胞存活率B1/A,B2/A,B3/A。

采用Unpaired Student's t检验或单因素方差分析及Tukey’s检验进行统计学差异分析，P<0.05为差异有统计学意义。结果如图4所示。

从图4可知，海马hepcidin成熟肽HeHampⅡ-4(63-88)与海马胚胎细胞共孵，不会降低细胞的存活率，说明其对胚胎细胞无毒性。

序列表

<110> 中国科学院南海海洋研究所

<120> 一种抗菌肽HeHampⅡ-4(63-88)及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

His Ser Gly Pro Cys Lys Phe Cys Cys Asn Cys Cys Gly Arg Met His

1 5 10 15

Phe Cys Gly Phe Cys Cys Glu Trp Arg Phe

20 25

<210> 2

<211> 88

<212> PRT

<213> 线纹海马(Hippocampus erectus)

<400> 2

Met Lys Pro Phe Ser Leu Ser Val Ala Val Ile Ile Met Leu Ala Phe

1 5 10 15

Leu Phe Ile Gln Glu Gly Ser Thr Ile Ser Leu Asp Asn Arg Glu Pro

20 25 30

Asp Gln His Met Val Glu Thr Arg Glu Asp Ala Ala Ala Glu Ile Pro

35 40 45

Val Asp Leu Trp Lys Val Ala Asp Asn Lys Arg Gln Lys Arg His Ser

50 55 60

Gly Pro Cys Lys Phe Cys Cys Asn Cys Cys Gly Arg Met His Phe Cys

65 70 75 80

Gly Phe Cys Cys Glu Trp Arg Phe

85