周环不对称精氨酸修饰酞菁及其制备和在制药领域的应用
阅读说明：本技术 周环不对称精氨酸修饰酞菁及其制备和在制药领域的应用 (Phthalocyanine modified by pericyclic asymmetric arginine, preparation thereof and application thereof in pharmaceutical field ) 是由 黄剑东 柯美荣 马新月 杨丽芳 郑碧远 于 2021-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了周环不对称精氨酸修饰酞菁及其制备和在制药领域的应用,属于光敏剂和药物制备技术领域。本发明所述化合物显示了独特的I型机制光敏反应。本发明所得化合物在缺氧条件下表现了高的光动力抑制癌细胞生长活性,本发明所得化合物具有高的光动力抑制实体瘤生长能力,同时显示了协同免疫检查点抑制剂显著抑制肿瘤转移和抗转移瘤的能力,可作为一类新型的药物或者光敏剂用于乏氧肿瘤的光动力治疗和免疫光动力治疗。(The invention discloses a peripherial asymmetric arginine modified phthalocyanine, and preparation and application thereof in the field of pharmacy, and belongs to the technical field of photosensitizer and medicine preparation. The compounds of the present invention exhibit a unique type I mechanism photosensitizing response. The compound obtained by the invention has high photodynamic cancer cell growth inhibition activity under the anoxic condition, has high photodynamic solid tumor growth inhibition capacity, simultaneously shows the capacity of obviously inhibiting tumor metastasis and resisting metastasis of a synergistic immune checkpoint inhibitor, and can be used as a novel medicament or photosensitizer for photodynamic therapy and immunophotodynamic therapy of hypoxic tumors.)
技术领域
本发明属于药物制备技术领域，具体涉及周环不对称精氨酸修饰酞菁及其制备和在制药领域的应用。
背景技术
光动力治疗（或称光动力疗法），是一种治疗疾病的新型疗法，其作用过程是将光敏剂注射入机体并且使其在靶体中富集，然后用特定波长的光照射靶体，使富集在靶体中的光敏剂在特定光激发下发生一系列光物理、光化学反应，产生活性氧，进而对病变的细胞，组织等产生氧化损伤。因此，光动力治疗的关键在于光敏剂。至今，获准在临床上正式使用的光敏剂主要为血卟啉衍生物。在美国、加拿大、德国、日本等国，使用的是Photofrin（美国FDA于1995年正式批准Photofrin用于临床治疗癌症），它是从母牛血液中提取并进行化学改性的血卟啉低聚物的混合物。虽然血卟啉衍生物显示了一定的疗效，但也暴露了其严重缺点：最大吸收波长（380-420nm）不在对人体组织透过率较佳的红光区(650-800nm)，皮肤光毒性大，且混合物组成不稳定等，使其临床应用受到限制。所以，开发新一代光动力药物（光敏剂）是国际上的研究热点。
光动力疗法的作用机制可根据光敏剂产生ROS的种类和方式的不同而分为Ⅰ型和Ⅱ型两种机制。Ⅰ型机制中，激发态光敏剂与基质分子直接发生电子转移作用，产生自由基物种（如超氧阴离子自由基、羟基自由基等）；Ⅱ型机制中，激发态光敏剂与氧气发生能量传递作用，产生单线态氧（1O2），1O2可快速与许多生物基质反应，导致其氧化损伤，被认为是PDT治疗中产生的主要细胞毒素剂。
由于具有最大吸收波长位于易透过人体组织的红光区域、暗毒性低等特点，酞菁金属配合物作为新型光敏剂的应用受到高度重视。但是，目前所报道的具有生物活性的酞菁配合物大多通过Ⅱ型机制用于光动力治疗，而且用于光动力疗法的具体机制尚不明确。所以研究光动力疗法的作用机制，以便制备出更多具有比较优势的酞菁配合物作为候选药物是十分必要的。
同时，现已有研究表明，Ⅱ型机制光敏剂产生的单线态氧具有很强的细胞毒性，但是II型机制产生活性氧是一个依赖氧气的过程，实体瘤是乏氧组织，所以II型光敏剂的光动力治疗实体瘤效果受到限制。I型机制是一个不依赖于氧的过程，因此I型机制光敏剂在光动力治疗实体瘤中具有优势。目前大多数酞菁光敏剂是Ⅱ型机制光敏剂，因此开发具有I型光敏机制或Ⅰ型与Ⅱ型相结合的酞菁光敏剂具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供周环不对称精氨酸修饰酞菁及其制备和在制药领域的应用，并在此基础上提供一种具有Ⅰ型光敏机制的酞菁光敏剂。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
本发明的目的之一是提供一种周环不对称精氨酸修饰酞菁，其在水中能够发生自组装。
所述的周环不对称精氨酸修饰酞菁具体为：
（1）酞菁周环取代基上包含有一个精氨酸，结构式如下：
（I）记为ZnPcR1B
或
（II）记为ZnPcR1。
（2）酞菁周环取代基上包含有二个精氨酸，结构式如下：
（III）记为ZnPcR2或
（Ⅳ）记为ZnPcR2B。
（3）酞菁周环取代基上包含有三或四个精氨酸，结构式如下：
（Ⅴ）记为ZnPcR3或
（Ⅵ）记为ZnPcR4。
本发明的目的之二是保护上述周环不对称精氨酸修饰酞菁的制备方法，包括以下步骤：
（1）所述化合物（I）的制备方法为：以1-[4-(2-氨基乙基)苯氧基]锌酞菁（ZnPcN，结构见下式）和N-Boc-L-精氨酸为反应物，N,N-二甲基甲酰胺（DMF）作为溶剂，在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDCI）、1-羟基苯并三唑(HOBt)、N-甲基吗啡啉（NMM）的存在和氮气保护下，0-10℃条件下搅拌反应10-60min，然后于室温~45℃继续搅拌反应7~36h，通过柱层析法和分子排阻色谱法分离获得所述周环精氨酸取代的锌酞菁ZnPcR1B。其中，1-[4-(2-氨基乙基)苯氧基]锌酞菁与N-Boc-L-精氨酸的摩尔比为1:1~3；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)、1-羟基苯并三唑（HOBt）的用量为每mmol 1-[4-(2-氨基乙基)苯氧基]锌酞菁使用1.5-6mmol；N-甲基吗啡啉（NMM）的用量为每mmol 1-[4-(2-氨基乙基)苯氧基]锌酞菁使用0.2-1mL。
。
（2）所述化合物（II）的制备方法为：将ZnPcR1B分散于二氯甲烷与三氟乙酸的混合溶液中，在氮气的保护下，0-10℃下搅拌反应10-60min，然后于室温~45℃继续搅拌反应7~24h，通过分子排阻色谱法分离获得所述周环精氨酸取代的锌酞菁ZnPcR1。三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1:1~5；每mg 1-[4-(2-氨基乙基)苯氧基]锌酞菁使用1-10mL三氟乙酸与二氯甲烷的混合液。
（3）所述化合物（III）的制备方法为：以1-[4-(2-氨基乙基)苯氧基]锌酞菁（ZnPcN）和N-Boc-L-精氨酸-精氨酸为反应物，N,N-二甲基甲酰胺（DMF）作为溶剂，在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDCI）、1-羟基苯并三唑(HOBt)、N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）的存在和氮气保护下，0~10℃条件下搅拌反应10-60min，然后于室温~45℃继续搅拌反应7~36h，通过柱层析法和分子排阻色谱法分离获得所述周环精氨酸取代的锌酞菁ZnPcR2。其中，2-[4-(2-氨基乙基)苯氧基]锌酞菁与N-Boc-L-精氨酸-精氨酸的摩尔比为1:1~3；所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)、1-羟基苯并三唑（HOBt）的用量为每mmol 2-[4-(2-氨基乙基)苯氧基]锌酞菁使用1.5~6mmol；所述的N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）的用量为每mmol 1-[4-(2-氨基乙基)苯氧基]锌酞菁使用0.2~1mL。
（4）所述化合物（Ⅳ）的制备方法为：以2,3-[4-(2-氨基乙基)苯氧基]锌酞菁（ZnPcBN，结构见下式）和N-Boc-L-精氨酸-精氨酸为反应物，N,N-二甲基甲酰胺（DMF）作溶剂，在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDCI）、1-羟基苯并三唑(HOBt)、N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）的存在和氮气保护下，0-10℃条件下搅拌反应10-60min，然后于室温~45℃继续搅拌反应7~24h，通过柱层析法和分子排阻色谱法分离获得所述周环精氨酸取代的锌酞菁ZnPcR2B。其中2,3-[4-(2-氨基乙基)苯氧基]锌酞菁和N-Boc-L-精氨酸的摩尔比为1:2~6；所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)和1-羟基苯并三唑（HOBt）的用量为每mmol 3,3'-[4-(2-氨基乙基)苯氧基]锌酞菁使用1.5~6mmol；所述的N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）的用量为每mmol 2,3-[4-(2-氨基乙基)苯氧基]锌酞菁使用0.2~1mL。
。
（5）所述化合物（Ⅴ）的制备方法为：以1-[4-(2-氨基乙基)苯氧基]锌酞菁和N-Boc-L-精氨酸-精氨酸-精氨酸为反应物，N,N-二甲基甲酰胺（DMF）作溶剂，在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDCI）、1-羟基苯并三唑(HOBt)、N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）的存在和氮气保护下，0~10℃条件下搅拌反应10-60min，然后于室温~45℃继续搅拌反应7~24h，通过柱层析法和分子排阻色谱法分离获得所述周环精氨酸取代的锌酞菁ZnPcR3。其中，1-[4-(2-氨基乙基)苯氧基]锌酞菁与N-Boc-L-精氨酸-精氨酸-精氨酸的摩尔比为1:1~3；所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)、1-羟基苯并三唑（HOBt）的用量为每mmol 1-[4-(2-氨基乙基)苯氧基]锌酞菁使用1.5~6mmol；所述的N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）的用量为每mmol 1-[4-(2-氨基乙基)苯氧基]锌酞菁使用0.2~1mL。
（6）所述化合物（Ⅵ）的制备方法为：以2,3-[4-(2-氨基乙基)苯氧基]锌酞菁和N-Boc-L-精氨酸-精氨酸为反应物，N,N-二甲基甲酰胺（DMF）作溶剂，在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDCI）、1-羟基苯并三唑(HOBt)、N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）的存在和氮气保护下，0~10℃条件下搅拌反应10-60min，然后于室温~45℃继续搅拌反应7~24h，通过柱层析法和分子排阻色谱法分离获得所述周环精氨酸取代的锌酞菁ZnPcBNR2。其中，2,3-[4-(2-氨基乙基)苯氧基]锌酞菁和N-Boc-L-精氨酸-精氨酸的摩尔比为1:2~6；所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)、1-羟基苯并三唑（HOBt）的用量为每mmol 2,3-[4-(2-氨基乙基)苯氧基]锌酞菁使用1.5~6mmol；所述的N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）的用量为每mmol 2,3-[4-(2-氨基乙基)苯氧基]锌酞菁使用0.2~1mL。
本发明的目的之三是提供周环不对称精氨酸修饰酞菁的应用，其具体是将所述酞菁或其自组装体用于制备光动力药物。所述光动力药物具有I型光敏机制，可以在乏氧环境下发生光动力活性。
所述光动力药物，或称光敏药物制剂，又称为光敏剂，可用于光动力治疗、光动力诊断或光动力消毒。所述光动力治疗可以是恶性肿瘤的光动力治疗，或是白血病的骨髓体外光动力净化治疗，或是非癌症疾病的光动力治疗，如真菌感染、细菌感染、口腔疾病、黄斑变性眼病、动脉硬化、创伤感染、皮肤病、病毒感染。所述光动力消毒可以是血液或血液衍生物的光动力灭菌净化，或是水的光动力灭菌消毒，或是医用或生活用器具的光动力消毒。
本发明所述上述周环不对称精氨酸修饰酞菁在光动力治疗、光动力诊断、光动力消毒和光动力降解污染物中的应用，需配套适宜的光源，所述适宜的光源可以由普通光源连接合适的滤光片来提供或由特定波长的激光或LED灯或其他灯源来提供，光源的波长范围为630~730 nm。
本发明的有益效果和突出优势是：
（1）本发明所述周环不对称精氨酸修饰酞菁可以在水中发生自组装，自组装体的形成可增强其I型光敏效率。
（2）在水中，本发明所述周环不对称精氨酸修饰酞菁在近红外激光的照射及乏氧条件下产生较高量的活性氧。其中，其所发挥的I型光敏机制是其他类似酞菁（如周环不对称赖氨酸修饰酞菁、周环不对称组氨酸修饰酞菁、轴向对称精氨酸修饰酞菁硅、轴向不对称精氨酸修饰酞菁硅等）所不具有的。
（3）细胞实验证明，利用周环不对称精氨酸修饰酞菁及其其自组装体所制备的光动力药物，在有氧与无氧条件下都具有较高的抗癌活性，显示了较高的光动力治疗效应。动物实验表明，所制备的光动力药物具有显著高的抗肿瘤活性，显著高于轴向对称精氨酸修饰酞菁硅的抗肿瘤活性，在乏氧肿瘤的治疗领域具有优异的应用前景。
（4）使用本发明所述周环不对称精氨酸修饰酞菁作为光敏剂的光动力治疗联合PD-L1抗体具有显著的抗肿瘤转移效应。
（5）本发明所述周环不对称精氨酸修饰酞菁的结构明确、制备过程操作简单、性质稳定，有利于在工业生产中大批量的制备，产业化前景良好。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1
（1）1-[4-(2-氨基乙基)苯氧基]锌酞菁（结构如下式所示）的合成：
参照我们课题组已公开的专利方法（CN105585571A，公开日2016-5-18）和发表的论文（Comparison between amine-terminated phthalocyanines and theirchlorambucil conjugates: synthesis, spectroscopic properties, and in vitroanticancer activity, Tetrahedron, 2017, 73, 378-384。）进行合成。
产物的表征数据如下：1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.35 – 9.15 (m, 5H), 8.81(d, J = 10.9 Hz, 1H), 8.28 – 8.08 (m, 6H), 7.88 – 7.74 (m, 3H), 7.49 (d, J =10.2 Hz, 2H), 7.41 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 3.03 (s, 2H), 2.87 (t, 2H).
HRMS (ESI) m/z：calcd for C40H25N9OZn [M+H]+ 712.1474, found 712.1547;calcd for C40H25N9OZn [M+2H]2+ 356.5737, found 356.5811。
（2）2,3-二[4-(2-氨基乙基)苯氧基]锌酞菁（结构如下式所示）的合成
首先，合成邻苯二甲腈衍生物（结构如下所示）：
以4，5-二氯邻苯二腈（2.54 mmol），4-(2-N-Boc-氨基)乙基-苯酚（5.08 mmol）为反应物，以DMF（20-50 mL，优选30 mL）为溶剂，在碳酸钾（5-15 mmol，优选10 mmol）存在和氮气保护下，20-45 ℃（优选30 ℃）下搅拌反应18-36小时，通过薄层色谱监控反应终点。反应结束后，将反应液加入到300 mL的冰水中，析出大量微红色沉淀，过滤，水洗至滤液为中性， 干燥得产物，产率为66.7%。产物的表征数据如下：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.60(m, 2H), 7.32 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.26 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 7.13 (d, J = 8.0Hz, 1H), 7.06 (d, J =8.0 Hz, 3H), 6.87 (s, 2H), 3.16 (d, J = 8.0 Hz, 4H),2.72 (dd, J = 20.0, 12.0 Hz, 4H), 1.37 (s, 18H)。HRMS (ESI): m/z calcd forC34H38N4O6 [M + Na]+, 621.2684; found 621.2682。
进而，合成2,3-二[4-(2-N-Boc-氨基)乙基-苯氧基]酞菁锌：以上述邻苯二甲腈衍生物（0.17 mmol）和邻苯二甲腈（1.00 mmol）为反应物，以正戊醇（20-35 mL，优选30 mL）为溶剂，加入无水醋酸锌（0.30 mmol），以1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯（DBU，0.4-0.8mL，优选0.5 mL）为催化剂，130-150 ℃下搅拌反应12-24小时，通过薄层色谱监控反应终点，生成相应的锌酞菁配合物。反应结束后旋蒸至干，用少量乙酸乙酯溶解，通过硅胶柱分离，先以乙酸乙酯为洗脱剂，后逐渐增加洗脱剂的极性至乙酸乙酯：DMF=20:1(v/v)，洗下酞菁带并收集，旋蒸去除有机溶剂，加入少量的THF溶解，进一步通过Bio-Beads S-X3型凝胶柱纯化，真空干燥得蓝色固体，产率为40.5%。产物的表征数据如下：1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 9.28-8.99 (m, 4H), 8.98-8.70 (m, 2H), 8.62 (s, 1H), 8.38-7.99 (m,5H), 7.60-7.22(m, 6H), 6.98 (s, 2H), 6.53 (s, 2H), 2.98-2.79 (m, 4H), 2.64(s,2H), 2.19 (s, 2H), 1.54-1.12 (m, 18H)。HRMS (ESI): m/z calcd for C34H38N4O6 [M +H]+, 1047.3279; found 1047.3311。
最后，合成2,3-二[4-(2-氨基乙基)苯氧基]锌酞菁：将上述所得2,3-二[4-(2-N-Boc-氨基)乙基-苯氧基]酞菁锌（0.048 mmol）作为反应物，以二氯甲烷:三氟乙酸=3:1（v/v，5-10 mL）为溶剂，氮气保护下，0-30℃下搅拌反应8-24小时，通过薄层色谱监控反应终点，待反应结束后，旋蒸除去反应溶剂，加乙酸乙酯（少量DMF）溶解，通过硅胶柱纯化，先以乙酸乙酯为洗脱剂洗掉杂质，再以DMF洗脱收集蓝色目标产物，旋蒸除去溶剂，真空干燥得到深蓝色目标产物，产率为49.4%。产物的表征数据如下：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.46-9.20(m, 4H), 9.14 (s, 1H), 8.98-8.80 (m, 2H), 8.72 (s, 1H), 8.45-8.13(m, 5H), 8.11-7.84 (m, 3H), 7.58-7.19 (m, 6H), 2.98 (s, 4H), 2.85 (s, 4H),1.09 (t, J = 8.0 Hz, 4H)。HRMS (ESI): m/z calcd for C48H34N10O2Zn [M + H]+,847.2230; found 847.2231。
实施例2
周环不对称精氨酸修饰酞菁ZnPcR1B的合成。ZnPcR1B的结构式如下：
以实施例1合成的1-[4-(2-氨基乙基)苯氧基]锌酞菁（0.055 mmol）以及N-Boc-L-精氨酸（0.055-0.165mmol优选0.066 mmol）作为原料，在1-羟基苯并三氮唑（HOBt，0.110mmol）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDCI，0.110 mmol）和N-甲基吗啉（NMM,17 μL）的存在下，以N,N-二甲基甲酰胺（DMF，2-6 mL）为溶剂，氮气保护下，0-10℃条件下搅拌反应10-60min，然后于室温~45℃继续搅拌反应7~36h，通过薄层色谱监控反应终点。待反应结束后，旋蒸除去反应溶剂，加少量的二氯甲烷溶解，通过硅胶柱纯化，先以二氯甲烷：甲醇=20:1(v/v)为洗脱剂，后逐渐增加洗脱剂的极性至二氯甲烷：甲醇=2:1(v/v)，洗下并收集蓝色酞菁带，旋蒸去除有机溶剂，加入少量的DMF，进一步通过Bio-Beads S-X3型凝胶柱精制，真空干燥得到深蓝色产物，产率为68.3%。
产物的表征数据如下：1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.50 – 9.29 (m, 3H), 8.94(d, J = 6.2 Hz, 1H), 8.32 – 8.11 (m, 1H), 7.96 (d, J = 2.7 Hz, 4H), 7.83 –7.69 (m, 1H), 7.66 – 7.52 (m, 2H), 7.46 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.35 (d, J = 8.1Hz, 2H), 7.28 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 7.06 (d, J = 6.2 Hz, 2H), 7.02 – 6.91 (m,3H), 6.90 – 6.79 (m, 1H), 3.87 (s, 1H), 3.06 (s, 2H), 2.69 (d, J = 19.2 Hz,2H), 1.35 (d, J = 10.7 Hz, 9H), 1.23 (s, 4H), 0.94 – 0.76 (m, 2H)。HRMS (ESI)m/z：calcd for C51H45N13O4Zn [M+H]+ 968.3009, found 968.3080。
实施例3
周环不对称精氨酸修饰酞菁锌ZnPcR1的合成和理化性质，其结构式如下：
以实施例2所得产物ZnPcR1B（0.038 mmol）为反应物，以二氯甲烷:三氟乙酸=3:1（v/v，40-300 mL，优选70mL）为溶剂，氮气保护下， 0-10℃下搅拌反应10-60min，然后于室温~45℃继续搅拌反应7~36h，通过薄层色谱监控反应终点。待反应结束后，旋蒸除去反应溶剂，加甲醇溶剂溶解，旋蒸除去溶剂和残留三氟乙酸，加入少量的DMF，通过Bio-Beads S-X3型凝胶柱纯化，收集蓝色酞菁带，旋蒸除去DMF，真空干燥得到深蓝色产物，产率为27.1%。
产物的表征数据如下：1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.55 – 9.23 (m, 6H), 8.89(d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.54 (s, 2H), 8.39 – 8.09 (m, 7H), 7.81 (d, J = 7.8 Hz,2H), 7.48 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.39 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.31 (d, J = 6.3 Hz,1H), 7.17 – 7.03 (m, 2H), 3.65 (s, 1H), 3.11 (s, 2H), 2.77 (d, J = 6.5 Hz,2H), 1.65 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 1.53 – 1.33 (m, 4H)。HRMS (ESI) m/z：calcd forC46H37N13O2Zn [M+H]+ 867.2658.2485, found 868.2557。
实施例4
周环不对称精氨酸修饰酞菁锌ZnPcR2的合成和理化性质，其结构式如下：
以实施例1合成的1-[4-(2-氨基乙基)苯氧基]锌酞菁（0.055 mmol）以及N-Boc-L-精氨酸-精氨酸（0.055-0.165mmol，优选0.066 mmol）为原料，在1-羟基苯并三氮唑（HOBt，0.110 mmol）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDCI，0.110 mmol）和和N，N-二异丙基乙胺（20 μL）存在下，以DMF（2-5 mL）为溶剂，于氮气保护下，0-30℃下搅拌反应12-36小时，通过薄层色谱监控反应终点。待反应结束后，旋蒸除去反应溶剂，加入少量的DMF，通过Bio-Beads S-X3型凝胶柱纯化，收集蓝色酞菁带，旋蒸浓缩至少量，进一步同过Bio-Beads S-X1型凝胶柱精制，真空干燥得到深蓝色产物，产率为21.2%。
产物的表征数据如下：1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.50-9.30 (m, 4H), 8.95(d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.39-8.09 (m, 6H), 7.96 (s, 1H), 7.90 (d, J = 8.0 Hz,1H), 7.85-7.71 (m, 1H), 7.57 (s, 2H), 7.42 (dd, J = 36.0, 8.0 Hz, 4H), 7.32-6.61 (m, 8H), 4.22 (s, 1H), 3.93 (s, 1H), 3.08 (s, 4H), 2.90 (s, 2H), 2.74(s, 2H), 2.53 (s, 2H), 2.34 (s, 2H), 2.04 (s, 1H), 1.64 (s, 2H), 1.48 (s,4H), 1.42-1.05 (m, 9H)。HRMS (ESI): m/z calcd for C57H57N17O5Zn [M+H]+,1124.4138,found,1124.4093。
实施例5
周环不对称精氨酸修饰酞菁锌ZnPcR3的合成和理化性质，其结构式如下：
以实施例1合成的1-[4-(2-氨基乙基)苯氧基]锌酞菁（0.030 mmol）以及N-Boc-L-精氨酸-精氨酸-精氨酸（0.030-0.090mmol, 优选0.060 mmol）为原料，在HOBt（0.060mmol）、EDCI（0.060 mmol）和N，N-二异丙基乙胺（20 μL）的存在下，以DMF（8-15 mL）为溶剂，于氮气保护下，0-10℃条件下搅拌反应10-60min，然后于室温~45℃继续搅拌反应7~36h，通过薄层色谱监控反应终点。待反应结束后，旋蒸除去反应溶剂。加入少量的DMF，过Bio-Beads S-X3型DMF凝胶柱，收集蓝色酞菁带，旋蒸浓缩至少量，再通过过Bio-Beads S-X1型凝胶柱精制，真空干燥得到深蓝色产物，产率为22.4%。
产物的表征数据如下：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.46 (s, 3H), 9.07 –8.88 (m, 2H), 8.29 (s, 3H), 8.24 – 8.11 (m, 2H), 7.97 (s, 2H), 7.88 – 7.71(m, 2H), 7.52 – 7.36 (m, 3H), 7.20 (s, 7H), 6.99 – 6.79 (m, 3H), 4.25 – 3.91(m, 6H), 3.09 (s, 8H), 2.13 (s, 3H), 1.79 – 1.65 (m, 3H), 1.55 (s, 5H), 1.43– 1.18 (m, 9H)。HRMS (ESI): m/z calcd for C63H69N21O6Zn [M+H]+,1280.5104, found,1280.5139。
实施例6
周环不对称精氨酸修饰酞菁锌ZnPcR2B的合成和理化性质，其结构式如下：
以实施例1合成的2,3-二[4-(2-氨基乙基)苯氧基]锌酞菁（0.020 mmol）以及N-Boc-L-精氨酸（0.040-0.120mmol,优选060 mmol）为原料，在HOBt（0.06 mmol）、EDCI（0.06mmol）和DIPEA（16 μL）的存在下，以DMF（8-15 mL）为溶剂，0-10℃条件下搅拌反应10-60min，然后于室温~45℃继续搅拌反应7~36h，通过薄层色谱监控反应终点。待反应结束后，旋蒸除去反应溶剂。加入少量的DMF，过Bio-Beads S-X3型凝胶柱，收集蓝色酞菁带，旋蒸浓缩至少量，再通过过Bio-Beads S-X1凝胶柱进一步精制，真空干燥得到深蓝色产物，产率为31.2%。
产物的表征数据如下：1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.45 (s, 3H), 9.36 (s,3H), 8.99 (s, 2H), 8.27 (s, 7H), 8.10-7.94 (m, 5H), 7.40 (s, 6H), 7.33 (s,5H), 6.92-6.83 (m, 3H), 6.58-6.51 (m, 2H), 5.41 (s, 2H), 4.02-3.95 (m, 2H),3.09 (s, 4H), 2.87-2.78 (m, 4H), 2.38-2.33 (m, 4H), 1.72-1.61 (m, 4H), 1.49(s, 8H), 1.36 (s, 10H)。HRMS (ESI): m/z calcd for C70H74N18O8Zn [M + 2H]2+,680.2687; found 680.2654。
实施例7
周环不对称精氨酸修饰酞菁锌ZnPcR4的合成和理化性质，其结构式如下：
以实施例1合成的2,3-二[4-(2-氨基乙基)苯氧基]锌酞菁（0.05 mmol）以及N-Boc-L-精氨酸-精氨酸（0.10-0.30mmol, 优选0.150 mmol）为原料，在HOBt（0.20 mmol）、EDCI（0.20 mmol）和DIPEA（20 μL）的存在下，以DMF（8-15 mL）为溶剂，于氮气保护下，0-10℃条件下搅拌反应10-60min，然后于室温~45℃继续搅拌反应7~24h，通过薄层色谱监控反应终点。待反应结束后，旋蒸除去反应溶剂。加入少量的DMF，过Bio-Beads S-X3型凝胶柱，收集蓝色酞菁带，旋蒸浓缩至少量，再通过Bio-Beads S-X1型凝胶柱进一步精制，真空干燥得到深蓝色产物，产率为19.7%。
产物的表征数据如下：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.53-9.35 (m, 5H),8.98 (s, 2H), 8.29 (s, 3H), 8.16 (s, 4H), 7.85 (s, 4H), 7.48 (s, 4H), 7.38(s, 2H), 7.26-7.05 (m, 5H), 7.04-6.93 (m, 3H), 6.93-6.63 (m, 7H), 6.54 (s,1H), 4.23 (s, 4H), 4.01-3.84 (m, 4H), 3.08 (s, 8H), 2.69 (s, 8H), 2.35 (s,8H), 1.42 (d, J = 36.0 Hz, 18H)。HRMS (ESI): m/z calcd for C70H74N18O8Zn [M+2H]2+, 836.3698. found, 836.3717。
实施例8
周环不对称组氨酸修饰酞菁锌（ZnPcH1B，结构如下式所示）的合成
使用N-Boc-L-组氨酸替代实施例2中的N-Boc-L-精氨酸，参照实施例2的合成和纯化方法，获得如上式所示的周环不对称组氨酸修饰酞菁锌。
产物的表征数据如下：
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.49 – 9.28 (m, 3H), 8.95 (d, J = 7.0 Hz,1H), 8.37 – 8.14 (m, 4H), 7.91 – 7.78 (m, 2H), 7.57 (d, J = 6.8 Hz, 1 H),7.45 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.30 (d, J = 8.1 Hz, 1H),7.07 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.73 (s, 2H), 3.82 (s, 1H), 2.89 (d, J = 9.6 Hz,2H), 2.77 – 2.63 (m, 2H), 1.60 – 1.29 (m, 13H), 1.26 (d, J = 11.1 Hz, 9H),0.94 – 0.76 (m, 4H)。HRMS (ESI) m/z：calcd for C56H54N11O6Zn [M+H-CH3]+1040.3550, found 1040.3518。
实施例9
周环不对称组氨酸修饰酞菁锌（ZnPcH1，结构如下式所示）的合成
参照实施例3，使用实施例8所得周环不对称组氨酸修饰酞菁锌ZnPcH1B替代实施例3中的ZnPcR1B，可以获得目标产物。
产物的表征数据如下：
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.55 – 9.23 (m, 6H), 8.89 (d, J = 7.2 Hz,1H), 8.54 (s, 2H), 8.39 – 8.09 (m, 7H), δ 7.96 (s, 1H),7.81 (d, J = 7.8 Hz,2H), 7.48 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.39 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.31 (d, J = 6.3 Hz,1H), 7.17 – 7.03 (m, 2H), 3.65 (s, 1H), 3.11 (s, 2H), 2.77 (d, J = 6.5 Hz,2H), 1.65 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 1.53 – 1.33 (m, 4H)。HRMS (ESI) m/z：calcd forC41H40N11O2Zn [M+H]+ 855.2658, found 855.2073。
实施例10
周环不对称赖氨酸修饰酞菁锌（ZnPcK1B，结构如下式所示）的合成
使用N2, N6 -双-Boc-L-赖氨酸替代实施例2中的N-Boc-L-精氨酸，参照实施例2的合成和纯化方法，获得如上式所示的周环不对称组氨酸修饰酞菁锌。
产物的表征数据如下：
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.49 – 9.28 (m, 3H), 8.95 (d, J = 7.0 Hz,1H), 8.37 – 8.14 (m, 4H), 7.91 – 7.78 (m, 2H), 7.57 (d, J = 6.8 Hz, 1 H),7.45 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.30 (d, J = 8.1 Hz, 1H),7.07 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.73 (s, 2H), 3.82 (s, 1H), 2.89 (d, J = 9.6 Hz,2H), 2.77 – 2.63 (m, 2H), 1.60 – 1.29 (m, 13H), 1.26 (d, J = 11.1 Hz, 9H),0.94 – 0.76 (m, 4H)。HRMS (ESI) m/z：calcd for C56H54N11O6Zn [M+H-CH3]+ 1040.3550,found 1040.3518。
实施例11
周环不对称赖氨酸修饰酞菁锌（ZnPcK1，结构如下式所示）的合成
参照实施例3，使用实施例9所得周环不对称组氨酸修饰酞菁锌ZnPcK1B替代实施例3中的ZnPcR1B，可以获得目标产物。产物的表征数据如下：
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.55 – 9.23 (m, 6H), 8.89 (d, J = 7.2 Hz,1H), 8.54 (s, 2H), 8.39 – 8.09 (m, 7H), δ 7.96 (s, 1H),7.81 (d, J = 7.8 Hz,2H), 7.48 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.39 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.31 (d, J = 6.3 Hz,1H), 7.17 – 7.03 (m, 2H), 3.65 (s, 1H), 3.11 (s, 2H), 2.77 (d, J = 6.5 Hz,2H), 1.65 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 1.53 – 1.33 (m, 4H)。HRMS (ESI) m/z：calcd forC41H40N11O2Zn [M+H]+ 855.2658, found 855.2073。
实施例12
轴向精氨酸修饰硅酞菁的合成：参照我们发表的论文（Synthesis,Spectroscopic Properties, and Photodynamic Anticancer Activities of NovelArginine-modified Silicon(IV) Phthalocyanine，Chinese J. Struct. Chem. (结构化学), 2020, 39(1), 66-78.）合成以下轴向精氨酸修饰硅酞菁（结构如下式所示）：
。
实施例13
测试实施例2-12所合成的酞菁在DMF、水和蓖麻油衍生物（Cremophor EL）水溶液中的电子吸收光谱（浓度为4μM）。结果表明，在DMF中，所有酞菁化合物均显示出强而尖锐的Q带吸收峰，摩尔吸收系数可达到1.0-2.0×105 cm-1mol-1L，其中锌酞菁的最大吸收波长位于676-672nm处，而硅酞菁的最大吸收波长位于684-686nm处，说明这些酞菁在DMF中主要以单体形式存在。但是在水中，不同的酞菁化合物显示了不同的吸收光谱，实施例2-11所述的锌酞菁在水中呈现出弱而宽化的Q带吸收，吸收强度为在DMF中的Q带吸收强度的1/5至1/4，这说明这些酞菁化合物在水中形成聚集体；实施例12所述硅酞菁在水中仍然呈现出强而尖锐的Q带吸收，吸收强度与在DMF中情况相当，说明这些硅酞菁在水中也是主要以单体形式存在。在1%蓖麻油衍生物水溶液（Cremophor EL，wt%）中，实施例2-12所述锌酞菁和硅酞菁均呈现出强而尖锐的Q带吸收，吸收强度与在DMF中情况相当，说明在1%蓖麻油衍生物水溶液以单体形式存在。
实施例14
利用粒度分布仪测定实施例2-12所制备的酞菁化合物在水中和在1%蓖麻油衍生物水溶液的粒径分布情况，详细的实验步骤参照J. Mater. Chem. B, 2021,9, 2845开展。
测试结果表明，实施例2-11所制备的锌酞菁（4 μM）在水中均可以发生自组装，形成粒径大小为100-250nm左右的纳米颗粒，而实施例12所述硅酞菁在水中则没有发生自组装行为，观察不到纳米颗粒。实施例2-12所制备的酞菁在1%蓖麻油衍生物水溶液（1%CEL），均没有观察到明显的纳米颗粒，说明在1%蓖麻油衍生物存在下，实施例2-12所制备的酞菁在水溶液的自组装被阻止，主要以单体形式存在。
实施例15
测试实施例2-12制备的酞菁化合物在水中或在1%CEL的溶液中光敏产生活性氧（ROS）能力。
活性氧总量测试采用水解的2,7-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）（即2,7-双氯荧光素蛋白乙酸盐）作为荧光探针。DCFH能够被氧活化形成能在520 nm波长处发射荧光信号的二氯荧光素。2,7-双氯荧光素蛋白乙酸盐（DCFH）的制备方法是：将2,7-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）溶解于甲醇配置成5 mM的DCFH-DA溶液，-20℃保存。待测时，将DCFH-DA溶液与0.1 mol/L的氢氧化钠溶液混合避光反应30 min后，用pH 7.4的PBS溶液稀释成为浓度为200 mM的母液。
在石英比色皿中配置总量为2 mL的酞菁（4 μM水溶液或1%CEL溶液）和上述活化好的活性氧探针（5 μM）的混合去离子水溶液，使用≥610 nm的红光（15 mW/cm2）对比色皿进行照射，测定不同光照时间下活性氧探针荧光强度的变化情况（488 nm激发，扫描范围在500 nm-600 nm处的荧光）。将 522 nm处的相对荧光强度（Ft-F0/F0）与光照时间（T）作图，得到线性关系的斜率，斜率越大说明产生ROS的能力越强。以常见光敏剂亚甲基蓝（MB，）为对照组（亚甲基蓝在水中和在1%CEL中产生ROS的能力没有明显差别），将实验组的斜率除以对照组的斜率，获得测试酞菁的相对产生ROS能力。
上述波长≥610 nm的红光是通过500 W的卤素灯连接隔热水槽加大于610 nm的滤光片来提供的。
表1 不同样品产生活性氧的相对能力对比
实验结果见表1。从表中可见，在水中，周环不对称精氨酸修饰酞菁锌（实施例2-7所得酞菁）产生ROS的能力显著高于周环不对称组氨酸或赖氨酸修饰酞菁锌（实施例8-11所得酞菁）和对照组亚甲基蓝，也高于轴向精氨酸修饰酞菁硅（实施例12所得酞菁）；在1%CEL中，周环不对称精氨酸修饰酞菁锌（实施例2-7所得酞菁）和周环不对称组氨酸或赖氨酸修饰酞菁锌（实施例8-11所得酞菁）产生ROS不及对照组亚甲基蓝；周环不对称精氨酸修饰酞菁锌（实施例2-7所得酞菁）在水中产生ROS的能力显著高于在1%CEL中的ROS产生能力（高出6-46倍），周环不对称赖酸修饰酞菁锌（实施例10-11所得酞菁）在水中产生ROS的能力高于在1%CEL中的ROS产生能力，但是周环不对称组氨酸酞菁锌和轴向精氨酸修饰酞菁硅则无此现象。如实施例13-14所述，周环不对称精氨酸修饰酞菁锌（实施例2-7所得酞菁）和周环不对称组氨酸或赖氨酸修饰酞菁锌（实施例8-11所得酞菁）在水中以聚集体形式存在、在1%CEL中以单体形式存在，可见周环不对称精氨酸修饰酞菁锌显示了独特而显著的聚集增强产生ROS能力，显著区别于轴向精氨酸修饰酞菁硅和周环不对称组氨酸或赖氨酸修饰酞菁锌，这是其他常见酞菁光敏剂不具有的独特性质。
实施例16
测定实施例2-7所制备的周环不对称精氨酸修饰酞菁锌在水中光敏产生超氧阴离子(O2 ·-)的能力。采用二氢乙锭(DHE)作为检测超氧阴离子的荧光探针进行测定。在超氧阴离子的存在下，DHE被氧化成溴化乙锭，再与周围的DNA结合后，发出明亮的红色荧光（激发波长在500-510 nm左右，发射波长在600 nm左右）。荧光越强说明产生的超氧阴离子的量越多。具体的步骤为：在去离子水中加入所需测定的酞菁化合物（酞菁浓度为4 μM），DHE探针（25 μM），以及小牛胸腺DNA（250 μg/mL），混合均匀。测试开始时的荧光强度，之后使用波长≥610 nm的红光（光照密度为1 mW/cm2）光照25min，使用荧光分度计来记录探针荧光强度的变化，以此来判断超氧阴离子的产生。荧光强度越强，说明超氧阴离子产生能力越大。采用常见光敏剂亚甲基蓝（MB）作为对照组，将实验组的探针荧光强度增幅（光照前后的增幅）除以对照组MB的探针荧光强度增幅（光照前后的增幅），获得测试酞菁的相对产生超氧阴离子能力。
表2不同样品光敏产生超氧阴离子的相对能力对比
实验结果见表2，从表2可见，上述周环不对称精氨酸修饰酞菁锌在水能有效产生超氧阴离子，产生能力高于常见光敏剂亚甲基蓝3-16倍。光敏产生超氧阴离子，说明周环不对称精氨酸修饰酞菁锌可以通过I型光敏机制产生活性氧。
在相同测试条件下，周环不对称组氨酸或赖氨酸修饰酞菁锌（实施例8-11所得酞菁）和轴向精氨酸修饰酞菁硅（实施例12所得酞菁）在水中不能明显观察到超氧阴离子的产生。
实施例17
测试在缺氧条件下实施例2-7所制备的周环不对称精氨酸修饰酞菁锌在水中光敏产生活性氧的能力。
测试前将所使用的去离子水煮沸20 min并超声以排除氧气，之后大量通入氮气以防氧气的进入，使用上海雷磁 JPB607A 型便携式溶解氧测定仪对氧气含量进行检测，以检查水中的缺氧状态（氧气量不高于2.5 mg/L）。选取提前备好的去氧水，加入所需测定的样品和探针，其他步骤按照参照实施例15所述开展。测试结果列于表3。
表3不同样品在缺氧条件下光敏产生ROS的相对能力对比
可见，在缺氧条件下，上述周环不对称精氨酸修饰酞菁锌（实施例2-7所得酞菁化合物）水能有效产生活性氧，特别是实施例2-4所得酞菁仍然保持很高的活性氧产生能力，这对于乏氧实体瘤的光动力治疗是十分有益的。
实施例18
利用本发明所述的酞菁制备光敏剂或光疗药物的方法是：先将酞菁化合物使用DMF或DMSO或乙醇溶解配置成1-2 mM的母液，再使用水进行稀释，配置成一定浓度的药物水溶液。
本发明所制备的酞菁光敏剂或者光疗药物，在应用过程中需要配套适宜的光源，适宜的光源可以用普通光源连接合适的滤光片来提供或由特定波长的激光或相应波长范围的LED光来提供，光源的波长范围为600~800 nm，优选620~700 nm。
实施例19
测试部分周环不对称精氨酸修饰酞菁锌在常氧和乏氧条件下的光动力抑制癌细胞生长活性。将待测酞菁化合物溶于DMF配置成1 mM的母液，进而将其稀释到细胞培养液中，制成含不同浓度酞菁的细胞培养液。在放置有洁净无菌盖玻片的培养板中接种处于对数生长期的HepG2细胞（每板细胞的数量约为1×105个），分别在37 ℃、95%空气、5% CO2（常氧条件）或者3% O2、5% CO2和92% N2（乏氧条件）进行培养，24 h后移出培养液，将癌细胞分别在含有不同浓度酞菁的培养液中培养2小时，之后弃培养液，用PBS缓冲溶液清洗细胞后，加入新的培养液（不含酞菁）。光照实验组，对细胞进行红光照射（所用激发光光源为波长大于610nm的红光，照射30分钟，照射光的功率为15mw·cm-2）；不照光组，将细胞置于暗处20分钟。光照或不光照后，细胞的存活率采用MTT法考察。具体实验步骤参见《Bioorganic &Medicinal Chemistry Letters》，2006，16，2450-2453。
实验结果表明：在不进行光照时，实施例2-7所得周环不对称精氨酸修饰酞菁锌对HepG2细胞均没有杀伤和生长抑制作用，表明上述酞菁没有暗毒性。但经光照射后，无论是在常氧或乏氧条件下，本发明制备的周环不对称精氨酸修饰酞菁锌均显示出高的光动力抗癌活性，且呈现量效关系，相应的IC50值（半数致死浓度，即杀死50％癌细胞所需的药物浓度）见表4。特别是实施例4所制备的周环二精氨酸不对称修饰酞菁锌的光动力抗癌活性最好，在乏氧条件下IC50值仍低至0.47 μM。而作为对照，在乏氧条件下，实施例12所述轴向精氨酸修饰酞菁硅水溶液则没有表现出显著的光动力抗癌活性。
表4 常氧及乏氧光照条件下不同样品的IC50值对比
实施例20
测试本发明所得酞菁化合物的光动力抗肿瘤效果。参照文献方法（ACS Appl.Mater. Interfaces 2019, 11, 36435−36443）建立皮下移植H22肝癌细胞的KM小鼠。将H22荷瘤KM小鼠分为以下实验组：单纯给药组，单纯PBS组，单纯激光组，给药+激光组，每组5只。给药+激光照射是待肿瘤长到60-100 mm3大小时，静脉注射100 μL浓度为100 μM的酞菁水溶液（剂量为0.5 nmol/g），然后在给药8小时后使用685 nm激光照射肿瘤部位8分钟，光照强度为15mW/cm2，光照组在第一次光照后的第4天再光照一次。将各组小白鼠按要求处理后，继续饲养小白鼠，隔日观察小鼠情况，测量小白鼠的体重，用游标卡尺测量肿瘤的长直径与短直径，一共测量14天。按照文献方法（ACS Appl. Mater. Interfaces 2019, 11,36435−36443）计算抑瘤率。
实验结果显示：（1）单纯给药组、单纯激光组对小鼠肿瘤均无抑制肿瘤生长效应（肿瘤增长了大约14倍）。（2）单纯给药组、给药+激光组的小鼠在14天内体重呈增加趋势，说明所测酞菁对小鼠均没有明显毒性，具有良好的生物相容性。（3）实施例4所得周环不对称精氨酸修饰酞菁锌（ZnPcNR2）+激光组显示了非常高的抑制肿瘤生长的作用，抑瘤率高达100%（完全抑制了肿瘤的生长）。而相同条件下实施例11所得轴向精氨酸修饰酞菁硅（SiPcR1B或SiPcR2B）+激光组没有显示出显著的抑制肿瘤生长能力，抑瘤率小于35%。由此进一步证明本发明所提供的周环不对称精氨酸修饰酞菁锌具有显著高的光动力抗实体瘤活性，特别值得强调是，ZnPcNR2获得100%抑瘤率所需的药剂量仅为0.5 nmol/g，显示了良好的临床应用前景。
实施例21
建立黑色素瘤细胞B16-F10的双侧荷瘤小鼠模型（近端和远端），测试使用本发明所提供周环不对称精氨酸修饰酞菁锌ZnPcNR2作为光敏剂的光动力治疗与基于PD-L1抗体的免疫治疗联用的抗肿瘤效果。近端是指光动力治疗（PDT）时的光照侧，远端是无光照侧。设立以下5组实验，每组5只：PBS对照组；anti-PD-L1抗体治疗组；单纯酞菁 (无光照）治疗组； 酞菁+光照治疗组，即PDT治疗组；酞菁+光照+ anti-PD -L1抗体治疗组，即联合治疗组。其中，anti-PD-L1抗体购自BioX cell公司。
联合治疗组、光动力治疗组和单纯光敏剂组每只小鼠尾静脉注射100 μL酞菁化合物（浓度200 μM）。联合治疗组、光动力治疗组在给药后8小时后用波长为685nm激光照射（照射功率为15 mW/cm2，照射时间为5 min）右侧肿瘤（即近端肿瘤）。联合治疗组于激光治疗后立即腹腔注射50 μg PD-L1抗体/只，抗体治疗组同一时间腹腔注射50 μg PD-L1抗体/只。在第一天和第四天分别治疗一次。
从第一次治疗开始隔日测量所有小鼠的体重及肿瘤体积，并根据公式肿瘤体积=肿瘤长度×宽度×高度×π/6计算肿瘤大小，连续观察14天，计算各实验组的抑瘤率。
实验结果表明，对PDT治疗组（酞菁+光照治疗组），实施例4中所述的周环不对称精氨酸修饰酞菁锌（ZnPcNR2）对B16-F10荷瘤小鼠的近端肿瘤（有光照肿瘤）的抑瘤率为92.8%，而对远端肿瘤（没有光照肿瘤）几乎没有抑制作用（抑瘤率为5.6%），说明单纯使用酞菁光动力治疗无法抑制肿瘤转移和转移瘤。另一方面，单纯PD-L1抗体治疗对于近端和远端肿瘤的抑制作用也十分有限，抑瘤率分别为12%和13%。对于联合治疗组，实施例4中所述锌酞菁（ZnPcNR2）+光照+ anti-PD -L1抗体治疗组对B16-F10荷瘤小鼠的远端肿瘤（无光照肿瘤）的抑瘤率高达99.4%，对近端肿瘤（有光照肿瘤）也高达99.9%。这说明实施例4中所述锌酞菁的光动力治疗联合PD-L1抗体具有显著的抗肿瘤转移效应。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。