阅读说明：本技术 一种经头颅定位穿刺建立小鼠远端视神经损伤模型的方法 (Method for establishing mouse distal optic nerve injury model through skull positioning puncture ) 是由 钟一声 余欢 沈柄桥 钟慧敏 章敏贵 陈珺珏 于 2021-09-13 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种经头颅定位穿刺建立小鼠远端视神经损伤模型的方法,属于临床动物模型技术领域。本发明的造模方法包括以下步骤：(1)麻醉：于小鼠腹腔注射麻醉剂；(2)备皮定位：剔除小鼠头顶毛发,剪开头顶皮肤,钝性分离筋膜,暴露前囟；采用头颅立体定位仪找到视神经对应的体表位置,以前囟为起点,向尾部和右侧分别移动0.5mm作为进针点；(3)进针：27G针头缓慢进针,进针深度为6mm时到达颅底,后将针缓慢拔出,拔针后按压止血并缝合颅顶筋膜及皮肤,术后预防感染。本发明的模型对损伤后小鼠的存活率可达85.56％,对视神经损伤的造模成功率达95％,特别是对远端视神经损伤的造模成功率可高达90％。(The invention provides a method for establishing a mouse distal optic nerve injury model through skull positioning puncture, belonging to the technical field of clinical animal models. The molding method of the invention comprises the following steps: (1) anesthesia: injecting anesthetic into the abdominal cavity of the mouse; (2) skin preparation and positioning: removing hair at the top of the mouse head, cutting the skin at the top of the mouse head, separating fascia bluntly, and exposing bregma; finding the body surface position corresponding to the optic nerve by adopting a skull stereotaxic apparatus, and respectively moving 0.5mm to the tail part and the right side by taking bregma as a starting point to be used as a needle inserting point; (3) inserting needles: and slowly inserting a 27G needle, slowly pulling out the needle when the insertion depth reaches the skull base when being 6mm, pressing for hemostasis after pulling out the needle, suturing skull top fascia and skin, and preventing infection after operation. The survival rate of the mouse after injury can reach 85.56%, the molding success rate of the optic nerve injury can reach 95%, and particularly the molding success rate of the optic nerve injury at the far end can reach 90%.)

一种经头颅定位穿刺建立小鼠远端视神经损伤模型的方法

技术领域

本发明属于临床动物模型技术领域，具体涉及一种经头颅定位穿刺建立小鼠远端视神经损伤模型的方法。

背景技术

视神经损伤(Traumatic optic neuropathy，TON)是颅脑、眼眶和面部外伤严重的并发症，伤后视力损害严重，常遗留永久性视力障碍。据报道，临床上TON的发生率在闭合性颅脑损伤中为0.5％，在颌面部损伤中为2.5％，其中机动车和自行车事故占大多数，其次是摔倒和袭击。视神经损伤可分为直接损伤和间接损伤两种类型。直接视神经损伤是指穿透视神经管内部或外部的眼眶创伤，由骨碎片或血肿直接破坏视神经而发生的；间接视神经损伤是由闭合性创伤向视神经传递力和/或营养因子引起的，不伴有相邻的组织结构的明显损害。

视神经间接伤害是导致ONT的最常见原因，且是青壮年主要的致盲原因。临床统计发现，79％的ONT患者为小于31岁的中年男性，21％的患者为小于18岁的男性。

有关间接视神经损伤的治疗方法长期以来一直存在争议。现有的治疗方法主要包括大剂量激素冲击和减压手术等，但研究表明其收效甚微，亟需新的治疗方法或干预措施来突破目前的治疗局限。因此建立规范可靠、方便易行、可重复的实验动物模型深入研究间接ONT的病理生理过程及开发新型疗法至关重要。

目前制作视神经损伤动物模型的方法主要有以下四种：视神经挤压(ONC)、视神经轴突切开术、爆炸伤害和超声波诱导的TON(SI-TON)。现一一介绍如下：

(一)ONC模型中视神经是通过手术暴露，并用镊子或止血钳夹持不同时间的方法来完成模型构建。然而挤压模型易造成邻近组织(神经周围的血管丛等)的破坏；此外，该模型没有量化为实现伤害而施加的力，伤害程度因执行该过程的个人而异，其中钳夹力度和时间均成为诱导损伤的潜在变化因素，因此限制了其广泛应用。

(二)视神经轴突切开术是将视神经完整横切。该方法无法模拟在临床上占较大比例的部分性视神经损伤；此外，在轴突切开术模型中，没有机会挽救或减弱炎症反应，因此难以成为探索间接视神经损伤的预防或治疗方法的有力模型。

(三)爆炸伤害模型是将小鼠放在坚固的PVC管中，然后将压缩空气喷射向小鼠眼睛。该方法可以量化传递到眼表的力，但额部爆炸会导致严重的眼前后段的损伤，并伴有很高的死亡率(视所施加的气压水平而定，从24％到46％不等)。

(四)SI-TON模型是将微尖探针超声仪置于视神经进入骨管入口正上方的眶上以传递超声脉冲，但空气和骨骼之间的声速差使声波在如此狭窄的空间中难以聚焦，从而容易导致造模失败。

上述方法可以在一定程度上模拟视神经损伤，但也各有缺陷，且无一涉及远端视神经的损伤，因此很有必要研制出一种稳定、有效和简易的小鼠远端视神经损伤模型来承载该领域的相关基础研究。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述技术问题，而提供一种经头颅定位穿刺建立小鼠远端视神经损伤模型的方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种经头颅定位穿刺建立小鼠远端视神经损伤模型的方法，包括以下步骤：

(1)麻醉：选择健康的小鼠，于小鼠腹腔注射麻醉剂；

(2)备皮定位：剔除小鼠头顶毛发，剪开头顶皮肤，钝性分离筋膜，暴露前囟；采用头颅立体定位仪找到视神经对应的体表位置，以前囟为起点，向尾部和右侧分别移动0.5mm作为进针点；

(3)进针：27G针头缓慢进针，进针深度为6mm时到达颅底，后将针缓慢拔出，拔针后按压止血并缝合颅顶筋膜及皮肤，术后使用加替沙星眼膏预防感染。

本发明利用头颅立体定位仪，经头颅定位后穿刺以达到损伤远端视神经的目的，从而构建DONT模型。首先，利用头颅立体定位仪可精确的找到视神经对应的体表位置，使损伤区域相对固定；其次，采用27G针头进行穿刺，在保证视神经损伤的前提下最小化对周围组织的伤害；此外，本发明模型仅造成部分视神经损伤而非完全截断，更贴近临床；最后，本造模方法简便易行，不涉及昂贵的材料器械及繁琐的造模步骤，为远端视神经损伤的研究提供了一个稳定可靠、简单可复制的研究模型。经成模效果检验，本发明的模型对损伤后小鼠的存活率可达85.56％，对视神经损伤的造模成功率达95％，特别是对远端视神经损伤的造模成功率可高达90％。

进一步的是，步骤(1)中选择雄性4-6周的BALA/C小鼠。

进一步的是，步骤(1)中所述麻醉剂选择10mg/kg的甲苯噻嗪和25mg/kg盐酸氯胺酮。

进一步的是，所述模型的造模环境为室温22-24℃，通风良好。

进一步的是，在步骤(3)术后还包括对小鼠进行护理，其操作为于37℃保温2h，待小鼠苏醒后送回动物房。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明提供了一种经头颅定位穿刺建立小鼠远端视神经损伤模型的方法，经头颅定位后穿刺以达到损伤远端视神经的目的，能使损伤区域相对固定；

(2)本发明方法在保证视神经损伤的前提下最小化对周围组织的伤害，且仅造成部分视神经损伤而非完全截断，更贴近临床；

(3)本发明的造模方法简便易行，不涉及昂贵的材料器械及繁琐的造模步骤，经成模效果检验，损伤后小鼠的存活率可达85.56％，对视神经损伤的造模成功率达95％，对远端视神经损伤的造模成功率可高达90％，为远端视神经损伤的研究提供了一个稳定可靠、简单可复制的研究模型。

附图说明

图1为小鼠ONT模型视神经损伤解剖示意图，箭头指向视神经损伤部位。

图2为小鼠ONT模型视神经损伤micro-CT示意图，箭头指向视神经损伤部位。

图3为小鼠ONT模型眼RGCs密度随着视神经损伤时间的增长而逐渐减少；A：对照小鼠和ONT 1周、2周、3周及4周组小鼠视网膜铺片，在每个象限相当于视网膜半径1/6、3/6、5/6区域，Brn3a染色标记的RGCs(放大倍率200×，标尺长度50μm)；B：随着ONT时间的增加，模型眼视网膜各个不同部位的RGCs的密度均明显下降(n＝6；与对照组相比，*P<0.05,*与对照组相比，P<0.05；**与对照组相比，P<0.01,***与对照组相比，P<0.001,****与对照组相比，P<0.0001)；ONT 1weeks：视神经损伤后1周；ONT 2weeks：视神经损伤后2周；ONT3weeks：视神经损伤后3周；ONT 4weeks：视神经损伤后4周。

图4为视神经损伤小鼠F-VEP P1波潜伏期和振幅的变化；A：对照组小鼠和视神经损伤造模术后1、2、3、4周组大鼠F-VEP检测波形，各组大鼠在实验过程中均能记录到F-VEP的典型NPN波形，依据国际临床视觉电生理学会规定对所记录的波形进行标定，波形起始出现的第一个负向波为N1波，紧随N1波之后出现的正向波为P1波，P1波其后出现的负向波为N2波；B：随着视神经损伤时间的增加，P1波的潜伏期逐渐增长，造模1周后潜伏期增长有统计学意义(n＝12；*与对照组相比，P<0.05)；C：随着视神经损伤时间的增加，P1波振幅逐渐降低，且造模后各组与对照组相比均有显著差异(n＝28；*与对照组相比，P<0.05；**与对照组相比，P<0.01,****与对照组相比，P<0.0001)；ONT 1weeks：视神经损伤后1周；ONT2weeks：视神经损伤后2周；ONT 3weeks：视神经损伤后3周；ONT4weeks：视神经损伤后4周。

图5为小鼠ONT模型眼小胶质细胞增殖及激活变化；A：对照小鼠和ONT 1周、2周、3周及4周组小鼠视网膜铺片，在每个象限相当于视网膜半径1/6、3/6、5/6区域，Iba-1染色标记的小胶质细胞(放大倍率200×，标尺长度50μm)；B：随着ONT时间的增加，模型眼视网膜各个不同部位的小胶质细胞的密度均明显增加，至造模后3周达到峰值，随后下降。

图6为小鼠ONT模型眼星形胶质细胞随视神经损伤时间的增长而逐渐增多和激活；A：对照小鼠和ONT 1周、2周、3周及4周组小鼠视网膜铺片，在每个象限相当于视网膜半径1/6、3/6、5/6区域，GFAP染色标记的星形胶质细胞(放大倍率200×，标尺长度50μm)；B：随着ONT时间的增加，模型眼视网膜各个不同部位的星形胶质细胞的密度均明显增加，细胞间接触增多且逐渐交织成网状。

图7为小鼠ONT模型眼Müller细胞随视神经损伤时间的增长而逐渐增多和激活；A：对照小鼠和ONT 1周、2周、3周及4周组小鼠视网膜切片，GS+GFAP共染标记的Müller细胞(放大倍率200×，标尺长度50μm)；B：随着ONT时间的增加，模型眼视网膜中的的Müller细胞的GFAP表达量逐渐上升，GS逐渐下降，表明Müller细胞激活增加。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例提供的一种小鼠远端视神经损伤模型的构建方法如下：

(1)造模环境：室温22-24℃，通风良好；

(2)麻醉：雄性4-6周BALA/C小鼠腹腔注射10mg/kg的甲苯噻嗪和25mg/kg盐酸氯胺酮麻醉小鼠；

(3)备皮定位：剔除头顶毛发，剪开头顶皮肤，钝性分离筋膜，暴露前囟，采用头颅立体定位仪找到视神经对应的体表位置，以前囟为起点，向尾部和右侧分别移动0.5mm作为进针点；

(4)进针：27G针头缓慢进针，进针至3mm左右可感受到突破感并观察到右眼球颤动，此为进针引起视神经损伤带来的反应。进针深度约为6mm时可达颅底，后将针缓慢拔出。拔针后按压止血并缝合颅顶筋膜及皮肤，术后使用加替沙星眼膏预防感染；(对照组构建方法：相同位置进针刺穿颅骨即退出，其余操作与造模组一致)

(5)术后护理：37℃保温2h，待小鼠苏醒后送回动物房。

实验例1

1、头颅穿刺构建ONT模型的成模效果

1)生存率：在4周的观察期内，ONT造模的180只小鼠中，154只存活，存活率为85.56％。

2)成功率：造模后1周，将20只小鼠进行视神经分离暴露，固定后显微镜下观察，其中18只可见右侧远端视神经损伤(图1)，估计造模成功率为90％。另外20只小鼠通过microCT观察视神经损伤情况，其中19只可见视神经损伤(图2)，估计造模成功率为95％。综合两种评估方法，预估造模成功率约为92.5％。

2、视网膜铺片Brn3a染色观察视网膜神经节细胞存活情况

ONT造模术后1、2、3、4周，视网膜铺片Brn3a染色显示视网膜半径1/6、3/6、5/6区域的RGCs的密度均较对照组明显下降，并且随着ONT造模时间的增加，RGCs的密度逐渐下降(图3，表1)。

表1不同分组的小鼠RGCs密度(均值±标准差，n＝6)

3、小鼠视神经损伤模型眼视神经功能检测情况

视神经损伤造模术后1、2、3、4周，对造模组及对照组进行F-VEP检测，采用LKC-UTAS-SBMF系统(Multi-focal Visual Diagnostic Test System，美国)记录F-VEP，刺激光强度0dB(3.0cd·s·m^-2)，刺激频率2.0Hz，波形时间250ms，通频带1～100Hz，叠加80次。观测P1波的峰时值(ms)和波幅(μV)，每只眼测量3次，计算平均值。结果显示，随着高眼压时间的增加，P1波的潜伏期逐渐增长，P1波振幅逐渐降低(图4)，表明该慢性高眼压模型可有效造成视神经功能损害。

4、小鼠视神经损伤模型眼小胶质细胞增殖及激活情况

ONT造模术后1、2、3、4周，视网膜铺片Iba-1染色显示视网膜半径1/6、3/6、5/6区域的小胶质细胞的密度均较对照组明显增加，并且随着ONT造模时间的增加，至造模后3周密度达到最大，随后下降(图5)。

5、小鼠视神经损伤模型眼星形胶质细胞增殖及激活情况

ONT造模术后1、2、3、4周，视网膜铺片GFAP染色显示视网膜半径1/6、3/6、5/6区域的星形胶质细胞的密度均较对照组明显增加，且随着造模时间的增长可见细胞间的接触和交互作用增加，从单个独立的细胞逐渐连接成网状(图6)。

6、小鼠视神经损伤模型眼Müller细胞激活情况

ONT造模术后1、2、3、4周，视网膜切片GS+GFAP染色显示视网膜Müller细胞的激活较对照组明显增加，且随着造模时间的增长激活逐渐增加(图7)。