一种五氯酚钠半抗原、人工抗原及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种五氯酚钠半抗原、人工抗原及其制备方法与应用 (Sodium pentachlorophenate hapten, artificial antigen, and preparation methods and applications thereof ) 是由 李斌 黄家怡 苏振贤 梁志玲 石松 任季玉 于 2021-09-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种五氯酚钠半抗原、人工抗原及其制备方法与应用,该五氯酚钠半抗原结构如式I所示,五氯酚钠人工抗原的结构式如式V所示。本发明中的五氯酚钠半抗原的制备方法简单,一个半抗原分子中含有两个五氯苯氧基的特征结构,使得基于其制备得到的人工抗原在空间结构上更容易突显出小分子的结构特性,提高了免疫原性。而且,基于本发明中的五氯酚钠半抗原制备得到的人工抗原和抗体特异性好,能够准确的识别靶向物质。基于其制备得到的检测试纸条特异性高,灵敏度强,对五氯酚钠的实际检测灵敏度可达1μg/kg,具有较好的检测效果。(The invention discloses a sodium pentachlorophenate hapten, an artificial antigen, a preparation method and an application thereof. The preparation method of the sodium pentachlorophenate hapten is simple, and one hapten molecule contains two characteristic structures of pentachlorophenoxy, so that the artificial antigen prepared based on the hapten can more easily show the structural characteristics of small molecules on the spatial structure, and the immunogenicity is improved. Moreover, the artificial antigen and the antibody prepared based on the sodium pentachlorophenate hapten have good specificity and can accurately identify the target substance. The detection test strip prepared based on the sodium pentachlorophenate has high specificity and strong sensitivity, the actual detection sensitivity to the sodium pentachlorophenate can reach 1 mug/kg, and the detection effect is better.)
技术领域
本发明涉及生物化工领域，具体涉及一种五氯酚钠半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。
背景技术
五氯酚钠，即五氯酚酸钠(Sodium pentachlorophenoxide，PCP-Na)，是一类具有五氯苯氧基结构特征的化合物，常作为杀菌剂、除草剂、杀虫剂和木材防腐剂被广泛使用。五氯酚钠化学性质稳定，不易发生降解，可通过生物富集作用进入食物链。五氯酚钠具有致畸、致癌、致突变作用，人体在长期摄入五氯酚钠后，会对人体免疫功能、神经功能造成损伤，具有极大的危害性。在世界范围内，大部分国家及地区、组织均建立相关法律法规，将五氯酚钠列入食品动物禁用的兽药中，禁止在水生动物养殖中使用，在动物源性食品中不得检出。
相关技术中，食品中五氯酚或其钠盐(五氯酚钠)的检测方法主要为气相色谱法、气相色谱-电子捕获法、气相色谱-氢火焰法等。其中，气相色谱-质谱法、气相色谱法等方法由于设备仪器昂贵，检测时间长，且需专业人员操作，无法真正意义上的实现现场检测和快速临检，给日常检测工作带来了极大的不便。
免疫分析检测技术的关键是抗原和抗体的性能决定的，而抗原和抗体的关键又是半抗原，因此，要得到性能优异的抗原和抗体，半抗原的结构设计就显得尤为重要。相关技术中基于五氯酚钠的本身直接制备得到的人工抗原存在灵敏度差、交叉反应率低的缺陷，无法满足现有市场的实际使用需求。因此，开发高特异性的五氯酚钠半抗原或人工抗原对于五氯酚钠快速、高灵敏度、低成本检测方法具有至关重要的意义。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种五氯酚钠半抗原、人工抗原及其制备方法与应用，其半抗原不仅具有活性基团，还完整保留了五氯酚钠的结构特征，且一个半抗原分子中含有两个五氯酚的特征结构，使得制备得到的人工抗原在空间结构上更容易突显出小分子的结构特性，提高了免疫原性。
本发明的第一个方面，提供一种五氯酚钠半抗原，该五氯酚钠半抗原的结构如式I所示：
本发明设计得到的五氯酚钠半抗原不仅具有活性基团，还完整保留了五氯苯氧基的结构特征，且一个半抗原分子中含有两个五氯苯氧基的特征结构，使得制备的人工抗原在空间结构上更容易突显出小分子的结构特性，提高了免疫原性。基于此结构，使其制备得到的特异性抗体具有极强的特异性。
本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述的五氯酚钠半抗原的制备方法，包括如下步骤：
(1)将式II所示的化合物、式III所示的化合物在室温下反应得到式IV所示的化合物；
(2)在式IV所示的化合物中加入碱性溶液进行水解，即得。
其中，式II所示化合物的结构式为：
式III所示化合物的结构式为：
式IV所示的化合物结构式为：
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中还含有催化剂、溶剂和缚酸剂。
在本发明的一些优选实施方式中，所述缚酸剂包括碳酸氢钠、碳酸钠和碳酸钾中的至少一种。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述缚酸剂为碳酸钾。
在本发明的一些优选实施方式中，所述溶剂包括N,N-二甲基甲酰胺、乙腈和丙酮中的至少一种。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。
在本发明的一些优选实施方式中，所述催化剂包括苄基三乙基氯化铵、四丁基溴化铵、四丁基氯化铵、四丁基硫酸氢铵、三辛基甲基氯化铵和四丁基碘化铵中的至少一种。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述催化剂为四丁基碘化铵。
在本发明的一些优选实施方式中，步骤(2)中的碱性溶液包括氢氧化锂、氢氧化钠和氢氧化钾中的至少一种。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述碱性溶液为氢氧化锂。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述制备方法的具体步骤为：
将结构式如式II所示的化合物、DMF、结构式如式III所示的化合物混合，再加入碳酸钾和四丁基碘化铵，在室温环境(23～27℃)下反应24h以上。乙酸乙酯萃取，去除溶剂(乙酸乙酯)，使用柱层析纯化得到式IV所示的化合物。将式IV所示的化合物在甲醇中溶解，加入氢氧化锂水溶液，在室温环境(23～27℃)下反应8h以上。乙酸乙酯萃取，水相pH调至3～4，析出固体物质。过滤，即得五氯酚钠半抗原。
本发明的第三个方面，提供一种五氯酚钠人工抗原，该五氯酚钠人工抗原由本发明第一个方面所述的五氯酚钠半抗原与载体蛋白偶联得到。
根据本发明第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述载体蛋白包括牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的至少一种。
当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，偶联其他的载体蛋白。
根据本发明第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述五氯酚钠人工抗原的结构式如式V所示，
其中，式V中的protein表示载体蛋白。
本发明的第四个方面，提供本发明第一个方面所述的五氯酚钠半抗原或本发明第二个方面所述的制备方法制备得到的五氯酚钠半抗原在下述(1)～(2)任一项中的应用；
(1)制备五氯酚钠特异性抗体；
(2)检测五氯酚钠特异性抗体。
根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述五氯酚钠特异性抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。
在本发明的一些优选实施方式中，所述五氯酚钠特异性抗体为单克隆抗体。
本发明的第五个方面，提供一种五氯酚钠特异性抗体，该五氯酚钠特异性抗体是以本发明第三个方面所述的五氯酚钠人工抗原为免疫原免疫动物得到的。
根据本发明的第五个方面，在本发明的一些实施方式中，所述动物包括家兔、绵羊、豚鼠、小鼠、鸡、山羊和马中的至少一种。
根据本发明的第五个方面，在本发明的一些实施方式中，所述五氯酚钠特异性抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。
在本发明的一些优选实施方式中，所述五氯酚钠特异性抗体为单克隆抗体。
本发明的第六个方面，提供本发明第五个方面所述的五氯酚钠特异性抗体在在下述(1)～(2)任一项中的应用；
(1)检测五氯酚钠；
(2)制备五氯酚钠检测产品。
根据本发明的第六个方面，在本发明的一些实施方式中，所述五氯酚钠特异性抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。
在本发明的一些优选实施方式中，所述五氯酚钠特异性抗体为单克隆抗体。
根据本发明的第六个方面，在本发明的一些实施方式中，所述产品包括：检测试剂、检测试剂盒、检测试纸或检测卡中的至少一种。
本发明的第七个方面，提供一种检测试剂或检测试纸，该检测试剂或检测试纸中含有本发明第五个方面所述的五氯酚钠特异性抗体。
根据本发明的第七个方面，在本发明的一些实施方式中，所述五氯酚钠特异性抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。
在本发明的一些优选实施方式中，所述五氯酚钠特异性抗体为单克隆抗体。
本发明的第八个方面，提供一种检测试剂盒，该检测试剂盒中含有本发明第七个方面所述的检测试剂或检测试纸。
本发明的有益效果是：
1.本发明中的五氯酚钠半抗原的设计独特，其不仅具有活性基团，还完整保留了五氯酚的结构特征，且一个半抗原分子中含有两个五氯酚的特征结构，使得基于其制备得到的人工抗原在空间结构上更容易突显出小分子的结构特性，提高了免疫原性。
2.基于本发明中的五氯酚钠半抗原制备得到的人工抗原和抗体特异性好，能够准确的识别靶向物质，IC50值可达到1.07μg/L，可用于制备针对五氯酚钠的快速检测试纸条、试剂盒及其他相关检测设备，具有极高的应用前景。
3.基于本发明中的人工抗原和特异性抗体制备得到的检测试纸条特异性高，灵敏度强，对五氯酚钠的实际检测灵敏度至少为1μg/kg，对于五氯酚钠具有较好的检测效果。
附图说明
图1为本发明实施例中的五氯酚钠半抗原的质谱图；
图2为本发明实施例中的五氯酚钠半抗原的反应路线图；
图3为本发明实施例中的五氯酚钠胶体金免疫层析试纸条的检测结果对照图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
五氯酚钠半抗原的制备
取0.5g(1.94mmol)结构式如式II所示的化合物于100mL圆底烧瓶中，依次加入10mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、2.22g(7.76mmol)的结构式如式III所示的化合物，搅拌至完全溶解后，在依次加入0.54g(3.88mmol)碳酸钾和0.10g正四丁基碘化铵，在室温环境(23～27℃)下反应24h以上。反应完毕后，加入90mL纯化水，用乙酸乙酯萃取2次，减压去除溶剂(乙酸乙酯)，使用柱层析纯化得到0.83g式IV所示的化合物(流动相为乙酸乙酯/石油醚混合液，乙酸乙酯/石油醚的体积比为3:4)。将获得的0.83g(1.32mmol)式IV所示的化合物溶解在5mL甲醇中，再加入5mL 4mol/L的氢氧化锂水溶液，在室温环境(23～27℃)下反应8h以上。反应完毕后，加入30mL氯化钠水溶液，并用30mL乙酸乙酯萃取2次，水相用4M的稀盐酸将pH调至3～4，析出固体物质。过滤，烘干即得五氯酚钠半抗原。
其中，式II所示的化合物结构式为：
式III所示的化合物结构式为：
式IV所示的化合物结构式为：
本实施例中共获得五氯酚钠半抗原0.47g。
本实施例中获得的五氯酚钠半抗原ESI-MS为：600.6[M-1]。
其质谱图如图1所示。
五氯酚钠半抗原的反应路线图如图2所示。
五氯酚钠人工抗原的制备
(1)牛血清白蛋白-五氯酚钠半抗原偶联得到的人工抗原：
取上述实施例中制备得到的五氯酚钠半抗原(10mg)，加入0.2mL二甲基甲酰胺(DMF)充分溶解。然后加入5mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和5mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在室温下搅拌4h，使充分反应，获得五氯酚钠半抗原活化酯。
然后在搅拌条件下，将获得的五氯酚钠半抗原活化酯逐滴加入至牛血清白蛋白溶液(BSA，35mg BSA+3.5mL 0.01mol/L的PBS缓冲液)中，室温下避光搅拌16～24h。用0.01mol/L的PBS室温透析3天，每天换3次透析液，以除去溶液中的未反应小分子物质，即得五氯酚钠人工抗原。
所得五氯酚钠人工抗原可保存于4℃条件下备用。
(2)血蓝蛋白-五氯酚钠半抗原偶联得到的人工抗原：
方法同(1)，区别在于：
在本实施例中，EDC和NHS的添加量均提高至10mg。
血蓝蛋白(KLH)溶液的配制方法为35mg KLH+3.5mL 0.01moll/L的PBS缓冲液。
五氯酚钠人工抗原的应用
(1)五氯酚钠人工抗原在制备五氯酚钠单克隆抗体中的应用：
具体制备方法如下：
取上述实施例中的血蓝蛋白-五氯酚钠半抗原偶联得到的人工抗原作为免疫原，加入等体积弗氏佐剂充分乳化后进行免疫BALB/C小鼠处理。每只BALB/C小鼠接种的免疫原剂量为50～100μg，每次免疫间隔2周。免疫3次后，采集小鼠尾部静脉血，检测血清中的抗体效价。如抗体效价不达要求，需加强免疫。
待抗体效价不再升高后，以100μg接种量的全抗原(血蓝蛋白-五氯酚钠半抗原偶联得到的人工抗原)进行皮下加强免疫。
加强免疫5天后，取试验小鼠脾细胞与SP20细胞(小鼠骨髓瘤细胞)进行细胞融合。融合后的融合细胞在HAT培养基中进行孵育筛选，孵育5天后以完全培养基进行培养。
用ELISA法对获得的融合细胞上清进行检测，将检测结果为强阳性的融合细胞使用有限稀释法克隆培养，经3次克隆培养检测后，均呈阳性的融合细胞即为五氯酚钠单克隆抗体的杂交瘤细胞。将该杂交瘤细胞放大培养后，接种至小鼠腹腔，产生含五氯酚钠单克隆抗体的腹水。用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水，冷冻干燥后即可得到五氯酚钠单克隆抗体。
(2)五氯酚钠人工抗原在免疫分析中的应用：
在本实施例中，以ELISA法作为示例展示五氯酚钠人工抗原在免疫分析中的应用，具体步骤如下：
取上述实施例中的牛血清白蛋白-五氯酚钠半抗原偶联得到的人工抗原，用碳酸盐缓冲液(pH 9.6)作为包被稀释液将其稀释至0.1μg/mL。然后按照100μL/孔的量将其加至聚苯乙烯微孔板中4℃包被过夜。甩干孔中的液体，以250μL/孔的量加入1％的BSA(磷酸盐缓冲液作为稀释液)，37℃封闭1h，干燥，得到包被好的检测板。向包被好的检测板中依次加入不同浓度的五氯酚钠标准溶液(100μL/孔)、五氯酚钠单克隆抗体(20μL/孔)，37℃孵育0.5h。甩干孔中的液体，加入280μL/孔的洗涤液，洗涤3次，拍干。加入100μL/孔的酶标二抗，37℃反应0.5h。再次洗涤3次后拍干，加入50μL/孔的显色液，37℃避光反应15min。加入50μL/孔的2M硫酸终止反应，于450nm波长下测定每孔的OD值。结果如表1所示。
本实施例中的五氯酚钠单克隆抗体需使用含有0.05％叠氮钠的磷酸盐缓冲液(pH7.4)稀释至0.08μg/mL，可于4℃保存备用。
表1不同浓度的五氯酚钠标准溶液的OD值
浓度(μg/L)
0
0.2
0.4
0.8
1.6
3.2
6.4
OD值
2.255
1.845
1.766
1.285
0.862
0.497
0.207
将表1中的数据利用ELISA Calc软件进行四参数Logistic曲线拟合，绘制标准曲线。
可以发现，获得的五氯酚钠标准溶液的的线性方程为：
y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D；其中，r2＝0.998，A＝2.26140，B＝1.21123，C＝1.07348，D＝-0.00919；
x表示待测样品中的待测物浓度；
y表示OD值。
通过计算发现，得到的IC50值为1.07μg/L，在0.4～6.4μg/L呈线性关系。
(3)五氯酚钠人工抗原在制备用于检测五氯酚钠的胶体金免疫层析试纸条中的应用：
具体制备方法如下：
a.制备反应膜：
以硝酸纤维素膜(NC膜)为反应膜，将上述实施例中的牛血清白蛋白-五氯酚钠半抗原偶联得到的人工抗原用包被缓冲液调节浓度至0.1～0.5mg/mL，并将鼠IgG用包被缓冲液调节浓度至0.1～0.5mg/mL。按照0.8～1.2μL/cm的膜液量，将人工抗原和鼠IgG分别喷到反应膜上对应的检测区(T线)和控制区(C线)表面。检测区和控制区之间间隔为2.5mm，放置于烘箱中45℃处理12～16h。
其中，按质量百分比计，所述包被缓冲液为含有1％蔗糖、0.05％叠氮化钠的0.01MPBS缓冲液(pH 7.6)。
b.制备胶体金微孔：
取1g氯金酸，加入纯水在超声条件下完全溶解定容至100mL。然后取1mL定容后的溶液，加入100mL纯水，加热至沸腾后加入0.5mL 0.06％的柠檬酸钠溶液，继续加热10分钟。冷却至室温。加入纯水恢复至原体积，得到纳米金溶液，避光常温保存。其中，需要注意的是，上述步骤中全部玻璃器皿需使用高锰酸钾及硫酸混合液过夜浸泡，清洗晾干后使用。取1mL纳米金溶液，用0.1mol/L K2CO3和0.1mol/L HCl将溶液pH值。将5μg上述实施例中制备得到的五氯酚钠单克隆抗体加入不同pH值的纳米金溶液中，室温反应5分钟。观察溶液颜色变化，记录使溶液颜色保持红色的pH值。然后向溶液颜色保持红色的混合液中加入10μL 10％的牛血清蛋白进行封闭，12000rpm离心，弃去全部上清液。加入胶体金稀释液(含2％Tris、5％牛血清蛋白、0.05％硫柳汞、5％蔗糖的纯水溶液)复溶，按20μl/孔分装于微孔中，37℃干燥处理16小时后保存备用。
c.胶体金免疫层析试纸条的组装：
在PVC板背衬中部叠置上述反应膜，两端分别叠置样品垫(样品垫在样品垫处理液中浸泡5min，37℃干燥16h后得到，按质量百分比计，样品垫处理液为含有0.3％吐温20、1％蔗糖、0.5％BSA、0.05％叠氮化钠的0.01M PB缓冲液)和吸水垫。反应膜分别和吸水垫、样品垫搭连，检测区靠近样品垫，控制区靠近吸水垫，即得用于检测五氯酚钠的胶体金免疫层析试纸板，将试纸板切割即得试纸条(宽度为3mm)。
取本实施例中得到的胶体金免疫层析试纸条进行检测，评估其检测灵敏度。
使用0.01M PBS缓冲液配制不同浓度的五氯酚钠标准溶液，然后分别取100μL不同浓度的五氯酚钠标准溶液加入上述实施例制备的金标微孔中，反复吹打使溶液复溶均匀。静置3min，将金标微孔中的溶液转移至本实施例中得到的胶体金免疫层析试纸条上(加样孔中)，加样后5～8min后观察结果，加样8min后的结果判读无效。检测试验重复3组。
结果判读采用肉眼判读方法(如图3所示)：
T线显色强于C线显色或与C线显色无明显差异，表示检测结果阴性(-)，说明检测样品中不含五氯酚钠。T线显色明显弱于C线显色或T线不显色，表示检测结果阳性(+)，说明检测样品中含五氯酚钠。未出现C线，则表示操作不正确或试纸条已失效，需重新进行检测。
检测结果如表2所示。
表2五氯酚钠胶体金免疫层析试纸条检测五氯酚钠标准品的测定结果
结果反复测试后，发现本实施例中得到的胶体金免疫层析试纸条对五氯酚钠的检测灵敏度至少为2μg/L，灵敏度较高。
同时，取上述实施例中得到的胶体金免疫层析试纸条进行稳定性检测。
上述实施例中得到的胶体金免疫层析试纸条的正常保存条件为室温保存。但在本实施例中，为了更真实表现试纸条的稳定性，对试纸条进行了加速破坏性实验，将上述实施例中得到的胶体金免疫层析试纸条分别在室温、37℃(高温加速产品老化)条件下连续放置90天，并在放置第0天、第7天、第14天、第30天、第45天、第60天、第75天和第90天使用不同五氯酚钠浓度的样品进行对比检测(重复3组)。
结果如表3所示。
表3不同存放时间的胶体金免疫层析试纸条的检测结果
其中，+表示结果为阳性，-表示结果为阴性。
由上表可知，上述实施例中得到的胶体金免疫层析试纸条在常温和37℃下密封保存条件下保存90天后，两组试纸条的T/C显色情况并无显著变化，检测结果一致，说明上述实施例中得到的胶体金免疫层析试纸条在极端条件下(37℃)最少可稳定保存90天。而对于常温保存的胶体金免疫层析试纸条，其在室温下稳定保存一年以上对于检测效果无显著影响，完全可以满足市场在保存和运输过程中的要求。
五氯酚钠胶体金免疫层析试纸条的实际检测效果
为了进一步验证上述实施例中制备得到的五氯酚钠胶体金免疫层析试纸条在实际样品检测中的检测效果，共选择了10种不同的畜禽、水产样本作为检测样品进行评估。
样品均采用加标的方式混入五氯酚钠标准溶液，加标的浓度递度为0、0.5、1、2、4μg/kg。
具体检测步骤如下：
(1)样品前处理：
取100g以上的检测样品搅碎，随机取其中2.0g加入到10mL离心管中，加入2mL乙酸乙酯，充分震荡混匀，提取2min。然后在4000rpm条件下离心3min。取1mL离心上清液，65℃浓缩吹干，加入300μL的0.01M PBS复溶，即得待检测液。
(2)样品检测：
取100μL的待检测液，按照上述实施例中的五氯酚钠胶体金免疫层析试纸条的使用方法进行检测。
结果如表4所示。
表4不同检测样品的检测结果
其中，+表示结果为阳性，-表示结果为阴性。
由表4可知，上述实施例中的五氯酚钠胶体金免疫层析试纸条在10种不同的检测样品中的检测结果一致，检测结果重复性好，当检测样品中的五氯酚钠含量低于1μg/kg时，均为阴性；高于1μg/kg时，均为阳性。因此，可以说明，上述实施例中的五氯酚钠胶体金免疫层析试纸条对于样品中的五氯酚钠的实际检测限为1μg/kg。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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