具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。

首先，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

其次，本发明利用结构示意图等进行详细描述，在详述本发明实施例时，为便于说明，示意图会不依一般比例作局部放大，而且所述示意图只是实例，其在此不应限制本发明保护的范围。此外，在实际制作中应包含长度、宽度及深度的三维空间。

实施例1

β-1,4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合寡糖的制备工艺：

步骤1：称取1g魔芋葡甘聚糖，依次加入192mg 4-乙酰氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基自由基和1360mg亚氯酸钠，再加入200mL0.2 M醋酸钠/醋酸缓冲溶液(pH 4.7)，搅拌均匀。

步骤2：在步骤1的溶液中再加入4mL的5％次氯酸钠溶液，于25℃条件下进行氧化反应，48h后加入5mL无水乙醇终止反应。

步骤3：将上述所得样品置于500Da透析袋中透析72h除盐，抽滤过快速滤膜除去不溶物质，取下层澄清液体，旋蒸浓缩，冷冻干燥得到一种β-1,4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合多糖固体物质。

步骤4：将上述多糖物质溶于100mM三氟乙酸溶液中，100℃条件下酸解6小时获得β-1,4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合寡糖溶液。

步骤5：将获得的寡糖溶液除酸、除去不溶物质、旋蒸浓缩，冷冻干燥得到β-1,4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合寡糖固体物质。

对上述制备所得的一种β-1,4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合多糖/寡糖进行结构确认及缺糖缺氧条件下小鼠海马神经元细胞HT-22细胞的保护作用验证，方法及结果如下：

产物分析1

一种β-1,4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合多糖核磁结构确认：

¹³C NMR碳谱及¹H-¹³C HSQC谱图结果请参阅图1，图1为本发明所述的β-1,4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合多糖的核磁谱图，其中，A为β-1,4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合多糖的¹³C NMR碳谱图，B为β-1,4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合多糖的¹H-¹³CHSQC谱图。如图1所示，在103ppm及101ppm化学位移处分别为β-1,4连接的葡萄糖醛酸和甘露糖醛酸C1位异头碳信号峰，177ppm处为糖环6位伯羟基被氧化为羧基的羰基碳信号峰，此时化学位移60ppm处的糖环6位伯羟基的碳信号峰已经完全消失，表明氧化基本已经完全，魔芋葡甘聚糖糖链中的葡萄糖/甘露糖的单元基本被氧化为葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸，制备得到一种β-1,4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合多糖。

产物分析2

一种β-1,4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合多糖质谱结构确认：

请参阅图2，图2为本发明所述的β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合多糖210nm处紫外谱图及质谱图，其中，A为β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合多糖在210nm下的紫外色谱图，B为β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合多糖质谱图。如图2所示，多糖在300v电压下在离子源中碎裂成为不同聚合度的寡糖(图2B，dp2～dp9)，由于糖链中有少量葡萄糖/甘露糖未被氧化为葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸，每个聚合度寡糖在离子源中存在完全氧化和部分氧化两种形式，同时发生一定程度的脱水脱羧及加水的现象。进一步通过对图2B中的dp5质谱峰进行一级质谱解析，其中m/z 897对应的结构为β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸五糖，如式I(m＝5，n₁＝0)，记为dp5-DO5；m/z 879对应的结构为β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸五糖脱去一分子水，记为dp5-DO5-H₂O；m/z 865对应的结构为β-1,4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸五糖脱去一分子水，由于不完全氧化致使该寡糖片段中存在1个葡萄糖或者甘露糖单元未被氧化为葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸，如式(I)(m＝4，n₁＝1)，记为dp5-DO4-H₂O；m/z 851对应的结构为β-1,4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸五糖脱去一分子水，由于不完全氧化致使该寡糖片段中存在2个葡萄糖或者甘露糖单元未被氧化为葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸，如式(I)(m＝3，n1＝2)，记为dp5-DO3-H₂O；m/z 835对应的结构为β-1,4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸五糖脱去一分子水和羧基，记为dp5-DO5-H₂O-CO₂；m/z 821对应的结构为未完全氧化的β-1,4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸五糖脱去一分子水和羧基，记为dp5-DO4-H₂O-CO₂；m/z 807对应的结构为未完全氧化的β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸五糖脱去一分子水和羧基，记为dp5-DO3-H₂O-CO₂。

产物分析3

一种β-1,4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合多糖单糖组成分析：

请参阅图3，图3为本发明所述的β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合多糖的单糖组成离子色谱图。如图3所示，本实施例1条件下制备得到的一种β-1，4葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合多糖样品中含有大量葡萄糖醛酸及甘露糖醛酸，同时含有少量葡萄糖和甘露糖单元，外标法测定葡萄糖醛酸及甘露糖醛酸的摩尔比约等于4，葡萄糖醛酸及甘露糖醛酸的百分含量之和大于等于90％。

产物分析4

请参阅图4，图4为本发明所述的β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合多糖的分子量分布图。如图4所示，本实施例得到的一种β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合多糖样品的分子量Mw＝114.9kDa，Mn＝69.8kDa，polydispersity＝1.6。

产物分析5

一种β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合寡糖质谱结构确认：

请参阅图6，图6为水解6h时的β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸寡糖210nm处紫外谱图及质谱图，其中，A为β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合寡糖在210nm下的紫外色谱图，B为β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合寡糖离子质谱图。如图6所示，由于采用的是分子排阻色谱柱，分子量大的物质先从色谱柱流出，因此从左至右依次按照聚合度从大到小排列。通过对图6中的质谱峰对应物质进行一级质谱解析，分别对应二糖到十一糖(dp2～dp11，见图6中6B图)，具体解析结果如下：其中m/z 351、545、721、897、1073、1249、1425分别为带一个电荷的质谱离子峰，对应的结构为β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸二糖、三糖、四糖、五糖、六糖、七糖、八糖，以五糖为例，897.1683为被完全氧化的五糖记为dp5-DO5，883.1882为部分氧化的五糖记为dp5-DO4，既五糖单元中有一个中性糖单元没有被氧化为酸性糖单元。其中m/z 448、624、800、976分别为带二个电荷的质谱离子峰，对应的结构为β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸五糖、七糖、九糖、十一糖。具体请参阅图7，图7为不同聚合度β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸寡糖质谱放大图，分别为β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合三糖、四糖、五糖、六糖、七糖、八糖的质谱图。

产物分析6

一种β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合寡糖单糖组成分析：

β-1,4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合寡糖样品的单糖组成结果如图8。实施例1条件下制备得到的β-1，4葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合寡糖样品中含有大量葡萄糖醛酸及甘露糖醛酸，同时含有少量葡萄糖和甘露糖单元，外标法测定葡萄糖醛酸及甘露糖醛酸的摩尔比约等于4，葡萄糖醛酸及甘露糖醛酸的百分含量之和大于等于90％。

产物分析7

一种β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合寡糖在糖氧剥夺(OGD)条件下对HT-22细胞存活率的影响：

7.1OGD模型的建立及实验分组

将HT-22细胞于配置好的高糖DMEM培养基中培养，细胞培养箱温度为37℃，不断通入5％CO₂气体，当细胞密度为90％且长势良好时可以用于实验。

取正常培养的HT-22细胞接种在96孔板上，每组设置3个平行样，于培养箱中培养24h后，对照组的给药组吸去原始高糖DMEM，加入100μL新鲜高糖DMEM培养基，并分别加入10μL用PBS配置的不同浓度的样品(工作浓度10ug/mL、100ug/mL、500ug/mL)，对照组的空白组加入10μL的PBS，再置于37℃、5％CO₂培养箱中培养2h。

模型组的给药组吸去原始高糖DMEM，加入100μL新鲜无糖DMEM培养基，并分别加入10μL用PBS配置的不同浓度的样品(工作浓度10ug/mL、100ug/mL、500ug/mL),模型组的对照组加入10μL的PBS。将模型组96孔板置于缺氧罐中(95％N₂、5％CO₂),再置于37℃、5％CO2培养箱中培养2h。

正常组与模型组共同培养2h后，测定细胞存活率确定所得β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合寡糖对OGD条件下对HT-22细胞的影响。

7.2CCK-8法测定细胞存活率

待上述培养结束后，在对照组与模型组于超净台中避光每孔加入10μLCCK-8试剂，继续在培养箱中孵育2h，于450nm处测定吸光度，并计算细胞存活率。

7.3结果

通过CCK-8法计算出各组细胞存活率结果如表1、2及图9、10所示。表1为一种β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合寡糖对正常培养HT-22细胞存活率的影响(n＝3)，表2为一种β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合寡糖对OGD培养下HT-22细胞存活率的影响(n＝3)，图9为本发明实施例1条件下制备所得一种β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合寡糖对正常小鼠海马神经元细胞的作用；图10为本发明实施例1条件下制备所得一种β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合寡糖对缺糖缺氧条件下小鼠海马神经元细胞的保护作用。

表1

表2

从图9可以看出不同剂量的β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合寡糖对正常培养的HT-22细胞存活率没有影响，表明该样品对HT-22细胞无毒性。

从图10可以看出模型组细胞存活率较正常培养细胞对照组降低，且具有显著性差异，表明缺糖缺氧条件能够有效抑制细胞存活率。而模型组的给药组随着给药浓度的增加能够有效提高细胞存活率，表明制备所得β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合寡糖能够显著提高HT-22细胞存活率。

表1和表2中，数据以mean+SEM表示；与对照组比较：p<0.05有显著性差异。

实施例2

β-1,4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合寡糖的制备方法：

步骤1：称取10g魔芋葡甘聚糖，依次加入3840mg 4-乙酰氨基-2,2,6，6-四甲基哌啶-1-氧基自由基和2720mg亚氯酸钠，再加入2000mL0.2M醋酸钠/醋酸缓冲溶液(pH 4.7)，搅拌均匀。

步骤2：在步骤1溶液中再加入50mL的5％次氯酸钠溶液于25℃条件下进行氧化反应，72h后加入30mL无水乙醇终止反应。

步骤3：将上述所得样品置于500Da透析袋中透析72h除盐，抽滤过快速滤膜除去不溶物质，取下层澄清液体，旋蒸浓缩，冷冻干燥得到β-1,4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合多糖固体物质。

步骤4：将上述多糖物质溶于1M三氟乙酸溶液中，100℃条件下酸解3h获得寡糖溶液。

步骤5：将获得的寡糖溶液除酸、除去不溶物质、旋蒸浓缩，冷冻干燥得到β-1,4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合寡糖固体物质。

步骤6：将上述所得样品置于500Da透析袋中透析48h，旋蒸浓缩，使用3K超滤离心管于5000r/min条件下离心30min，取下层澄清液体冷冻干燥得到部分氧化β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合寡糖。

实施例3

一种β-1,4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合寡糖的制备方法：

步骤1：称取2g魔芋葡甘聚糖，依次加入192mg 4-乙酰氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基自由基和1360mg亚氯酸钠，再加入200mL0.2 M醋酸钠/醋酸缓冲溶液(pH 4.7)，搅拌均匀。

步骤2：在步骤1溶液中再加入12mL的5％次氯酸钠溶液于25℃条件下进行氧化反应，96h后加入10mL无水乙醇终止反应。

步骤3：将上述所得样品置于500Da透析袋中透析72h除盐，抽滤过快速滤膜除去不溶物质，取下层澄清液体，旋蒸浓缩，冷冻干燥得到β-1,4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合多糖固体物质。

步骤4：将上述多糖物质溶于100mM三氟乙酸溶液中，100℃条件下分别酸解1h，3h，6h，9h，12h，获得分子量分布不同、不同聚合度寡糖单体相对组成比例不同的酸解寡糖溶液，具体请参阅图5，图5为经过不同水解时间所得β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸寡糖在210nm处的紫外色谱图。

步骤5：将获得的寡糖溶液除酸、除去不溶物质、旋蒸浓缩，冷冻干燥得到几种β-1,4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合寡糖固体物质。

步骤6：将上述所得样品置于500Da透析袋中透析72h，旋蒸浓缩，使用3K超滤离心管于3000r/min条件下离心30min，取下层澄清液体冷冻干燥得到几种β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合寡糖。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合寡糖的制备方法，其反应条件温和，合成工艺简单、产品纯度高，制备原料易得，成本较低，易于产业化；所制备获得的β-1，4型葡萄糖醛酸/甘露糖醛酸直链杂合寡糖，具有结构明确、分子量低、生物利用度高的优点，具有优良的应用前景。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。