阅读说明：本技术 一种n-乙酰神经氨酸钙盐晶体及其制备方法和应用 (N-acetylneuraminic acid calcium salt crystal and preparation method and application thereof ) 是由 朱薇薇 袁丽霞 陈祥松 吴金勇 王煜 王刚 费贤春 李翔宇 孙立洁 王纪 姚建铭 于 2019-10-08 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种N-乙酰神经氨酸钙盐晶体及其制备方法和应用,所述N-乙酰神经氨酸钙盐晶体的分子式为(C<Sub>11</Sub>H<Sub>18</Sub>NO<Sub>9</Sub>)<Sub>2</Sub>Ca,在粉末X射线衍射谱图中有明显的衍射峰,具有优异的溶解性和高温稳定性,184℃高温处理下不会变色。本发明所述的N-乙酰神经氨酸钙盐晶体可以通过N-乙酰神经氨酸和钙源在水相环境中反应、进而结晶析出得到,其制备方法简单,产物的收率和纯度高,适宜规模化生产。本发明提供的高稳定性、高溶解度的N-乙酰神经氨酸钙盐晶体吸收率高,能够同时满足人体对钙和N-乙酰神经氨酸的补充需求,具有广阔的应用前景。(The invention provides an N-acetylneuraminic acid calcium salt crystal and a preparation method and application thereof, wherein the molecular formula of the N-acetylneuraminic acid calcium salt crystal is (C) 11 H 18 NO 9 ) 2 Ca has obvious diffraction peak in powder X-ray diffraction spectrum, excellent solubility and high temperature stability, and does not generate reaction at 184 deg.CAnd (5) changing color. The N-acetylneuraminic acid calcium salt crystal can be obtained by reacting N-acetylneuraminic acid and a calcium source in an aqueous environment and then crystallizing and separating out, and the preparation method is simple, high in product yield and purity and suitable for large-scale production. The N-acetylneuraminic acid calcium salt crystal with high stability and high solubility provided by the invention has high absorptivity, can simultaneously meet the supplement requirements of human bodies on calcium and N-acetylneuraminic acid, and has wide application prospects.)

一种N-乙酰神经氨酸钙盐晶体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种N-乙酰神经氨酸钙盐晶体及其制备方法和应用。

背景技术

N-乙酰神经氨酸(N-acetyl neuraminic acid，Neu5Ac)是目前已发现的五十多种唾液酸中最主要的一种，其含量占所有唾液酸的99％以上。Neu5Ac的分子中含有9个碳原子并具有吡喃糖结构，主要以α-糖苷的形式位于糖蛋白或糖脂类等非还原性寡聚糖的末端，是一种酸性氨基糖，易溶于水，在水溶液中能够稳定保存较长时间。Neu5Ac是细胞信息传递的第一接触位点，其分子结构具有多样性，能够参与细胞识别、信号转导、肿瘤发生、受精等多个生理过程，在食品、医药和疾病快速检测领域具有广泛的应用。此外，Neu5Ac还能调节IgG的抗炎活性，影响神经细胞的完整性、渗透性及活性，增强婴儿免疫力，促进婴儿大脑的发育。

近年来，关于N-乙酰神经氨酸医用价值及营养价值研究的成熟带动了该化合物制备工艺的发展，已被论证可行的N-乙酰神经氨酸制备方法包括天然提取法、微生物发酵法、酶催化法和化学合成法，合成的N-乙酰神经氨酸晶体包括二水合物晶体和无水物晶体。但是，在N-乙酰神经氨酸晶体的应用过程中，研究人员发现，N-乙酰神经氨酸水溶液显示出较强的酸性，且溶解度普遍较小，在常温下大约为100g/L，而且N-乙酰神经氨酸晶体及其水溶液的稳定性欠佳，在存储过程中会逐渐变为深褐色，极大地限制了Neu5Ac的应用。因此，提高N-乙酰神经氨酸的水溶性及稳定性，对进一步拓展其应用范围，具有重要意义。

将N-乙酰神经氨酸转化为N-乙酰神经氨酸中和盐是提高其溶解度的新思路，例如CN107207552A公开了一种N-乙酰神经氨酸铵盐无水物的晶体及其制造方法，该制造方法具体为：向pH为3.0～9.0的含有含铵化合物的N-乙酰神经氨酸的水溶液中添加或滴加醇类和酮类组成的溶剂，使N-乙酰神经氨酸铵盐无水物的晶体析出，得到产物；所述N-乙酰神经氨酸铵盐无水物的晶体熔点约167℃，在水中的溶解度和60℃高温下的稳定性显著提高。CN106573950A公开了一种N-乙酰神经氨酸碱金属盐无水物的晶体及其制造方法，所述制造方法为，向pH为3.0～9.0的含有碱金属化合物的N-乙酰神经氨酸的水溶液中添加或滴加醇类和酮类组成的溶剂，由此使N-乙酰神经氨酸碱金属盐无水物的晶体析出，从该水溶液中收集N-乙酰神经氨酸碱金属盐无水物的晶体。

钙为凝血因子，能降低神经、肌肉的兴奋性，是构成人体骨骼的基石，补钙对婴幼儿的成长以及成年人的身体健康都具有重要意义。用于人体补钙的钙剂分为无机钙和有机钙两种，无机钙的代表是碳酸钙，这类钙制品的特点是溶解度一般，吸收率一般；有机钙的代表是葡萄糖酸钙，这类钙制品特点是溶解较好，吸收率较高。

由于钙元素和N-乙酰神经氨酸都有助于人体健康、尤其有助于婴幼儿的生长发育，因此，开发一种同时含有钙元素和N-乙酰神经氨酸的物质，在生物医药以及保健食品等方面都具有十分重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种N-乙酰神经氨酸钙盐晶体及其制备方法和应用，所述N-乙酰神经氨酸钙盐晶体具有良好的稳定性和溶解度，吸收率高，能够同时满足人体对钙和N-乙酰神经氨酸的补充需求。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种N-乙酰神经氨酸钙盐晶体，所述N-乙酰神经氨酸钙盐晶体的分子式为(C₁₁H₁₈NO₉)₂Ca。

优选地，所述N-乙酰神经氨酸钙盐晶体的粉末X射线衍射谱图中，在2θ衍射角为15.98±0.2°、17.70±0.2°、22.46±0.2°、25.16±0.2°、26.86±0.2°、28.62±0.2°、29.34±0.2°、32.46±0.2°、33.48±0.2°、35.68±0.2°、38.12±0.2°、42.98±0.2°、44.10±0.2°、46.88±0.2°、51.80±0.2°、61.96±0.2°、65.82±0.2°处有衍射峰。

所述N-乙酰神经氨酸钙盐晶体的粉末X射线衍射谱图中，±0.2为测试时的误差。

优选地，所述N-乙酰神经氨酸钙盐晶体的熔点为232～235℃，例如232.1℃、232.3℃、232.5℃、232.7℃、232.9℃、233℃、233.2℃、233.4℃、233.6℃、233.8℃、234℃、234.2℃、234.4℃、234.6℃、234.8℃或234.9℃等。

优选地，所述N-乙酰神经氨酸钙盐晶体的熔点为233.35℃。

另一方面，本发明提供一种如第一方面所述的N-乙酰神经氨酸钙盐晶体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)将N-乙酰神经氨酸、钙源和水混合，反应，得到反应液；

(2)向步骤(1)得到的反应液中加入结晶溶剂，静置结晶，固液分离，得到的固相为所述N-乙酰神经氨酸钙盐晶体。

优选地，步骤(1)所述钙源为氢氧化钙或碳酸钙。

优选地，步骤(1)所述N-乙酰神经氨酸与钙源的摩尔比为(1.9～2.1):1，例如1.91:1、1.93:1、1.94:1、1.95:1、1.97:1、1.99:1、2:1、2.02:1、2.04:1、2.05:1、2.07:1或2.09:1等，进一步优选为2:1。

优选地，步骤(1)所述N-乙酰神经氨酸与水的质量体积比为10～200g/L，例如12g/L、15g/L、17g/L、20g/L、23g/L、25g/L、28g/L、30g/L、33g/L、35g/L、38g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L、85g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L、130g/L、140g/L、150g/L、160g/L、170g/L、180g/L、190g/L或195g/L，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

优选地，步骤(1)所述反应的温度为20～60℃，例如22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃、42℃、45℃、48℃、50℃、52℃、55℃、57℃或59℃，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

优选地，步骤(1)所述反应的时间为2～8h，例如2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h、6h、6.5h、7h或7.5h，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

优选地，步骤(1)所述反应在搅拌条件下进行。

优选地，所述步骤(1)还包括反应液的脱色处理。

优选地，所述脱色处理的脱色剂为活性炭。

优选地，所述活性炭的添加量为反应液质量的0.1～1.0％，例如0.15％、0.18％、0.2％、0.23％、0.25％、0.28％、0.3％、0.33％、0.35％、0.37％、0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％或0.95％等。

优选地，所述脱色处理的方法为：将反应液与活性炭混合，脱色，固液分离，得到的液相为经过脱色的反应液。

优选地，所述脱色在搅拌或震荡条件下进行。

优选地，所述脱色的温度为30～70℃，例如32℃、35℃、38℃、40℃、42℃、44℃、46℃、48℃、50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃或69℃等。

优选地，所述脱色的时间为10～60min，例如12min、15min、18min、20min、23min、25min、28min、30min、33min、35min、37min、40min、45min、50min或55min等。

优选地，所述固液分离的方法为膜分离。

优选地，所述膜分离中膜的孔径为0.22μm。

优选地，所述步骤(1)还包括反应液的浓缩处理。

优选地，所述浓缩处理的方法为：将反应液加热使溶剂挥发，直至反应液中N-乙酰神经氨酸钙的浓度为0.15～2.5mol/L，例如0.17mol/L、0.19mol/L、0.2mol/L、0.25mol/L、0.3mol/L、0.35mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L、1mol/L、1.2mol/L、1.4mol/L、1.6mol/L、1.8mol/L、2mol/L、2.2mol/L或2.4mol/L等。

优选地，步骤(2)所述结晶溶剂选自醇类溶剂、酮类溶剂、乙腈或四氢呋喃中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述醇类溶剂为C1～C5(例如C1、C2、C3、C4或C5)醇类溶剂。

优选地，所述结晶溶剂为甲醇和/或乙醇。

优选地，所述结晶溶剂和反应液的体积比为(2.5～5):1，例如2.6:1、2.8:1、3:1、3.2:1、3.5:1、3.8:1、4:1、4.2:1、4.4:1、4.6:1、4.8:1或4.9:1等，进一步优选为(3～5):1。

作为本发明的优选技术方案，所述结晶溶剂的加入方式可以为一次性全部加入，或先加入反应液2倍体积的结晶溶剂、然后在加热条件下(60～80℃，例如62℃、65℃、68℃、70℃、73℃、75℃或78℃等)继续滴加结晶溶剂至体系中出现浑浊为止。

本发明提供的N-乙酰神经氨酸钙盐晶体的制备方法中，步骤(2)所述结晶溶剂的添加量优选为反应液体积的2.5～5倍。若结晶溶剂的添加量过少，则晶体的析出量极少，析出速度慢，甚至不析晶；若结晶溶剂的添加量过多，则造成有机溶剂的浪费，增加了工业三废的后处理成本。若制备方法中没有步骤(2)所述的结晶过程、直接将步骤(1)得到的反应液干燥，则产物为无定形态的钙盐，而非高稳定性的N-乙酰神经氨酸钙盐晶体。

优选地，步骤(2)所述静置结晶的温度为0～10℃，例如1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或9.5℃等，进一步优选为3～5℃。

优选地，步骤(2)所述静置结晶的时间为8～24h，例如9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h或23.5h，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

优选地，步骤(2)所述固液分离的方法为膜分离。

优选地，所述膜分离中膜的孔径为0.22μm。

优选地，所述步骤(2)还包括后处理步骤。

优选地，所述后处理步骤包括洗涤和干燥。

优选地，所述洗涤的溶剂为C1～C5(例如C1、C2、C3、C4或C5)醇类溶剂或C1～C5(例如C1、C2、C3、C4或C5)醇类溶剂的水溶液。

示例性的，所述洗涤的溶剂包括但不限于：无水乙醇、无水甲醇、75％的乙醇水溶液或75％的甲醇水溶液等。

优选地，所述干燥的温度为50～80℃，例如52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃、70℃、72℃、74℃、76℃、78℃或79℃等。

优选地，所述干燥为减压干燥或常压干燥。

优选地，所述干燥的时间为5～12h，例如5.5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h或11.5h等。

优选地，所述制备方法包括以下步骤：

(1)将N-乙酰神经氨酸、钙源和水混合，20～60℃搅拌反应2～8h，得到反应液；其中，所述N-乙酰神经氨酸与钙源的摩尔比为(1.9～2.1):1，所述N-乙酰神经氨酸与水的质量体积比为10～200g/L，所述钙源为氢氧化钙或碳酸钙。

(2)向步骤(1)得到的反应液中加入2.5～5倍体积的结晶溶剂，所述结晶溶剂选自醇类溶剂、酮类溶剂、乙腈或四氢呋喃中的任意一种或至少两种的组合；0～10℃静置结晶8～24h，固液分离后收集固相，洗涤、干燥，得到所述N-乙酰神经氨酸钙盐晶体。

另一方面，本发明提供一种如第一方面所述的N-乙酰神经氨酸钙盐晶体在药物、保健品、食品或护肤品中的应用。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的N-乙酰神经氨酸钙盐晶体的分子式为(C₁₁H₁₈NO₉)₂Ca，在粉末X射线衍射谱图中有明显的衍射峰；在水中的溶解性能好，室温下的溶解度可以达到400g/L以上；具有优异的稳定性，184℃高温处理20min后仍为白色固体，其水溶液在120℃高温下保持无色澄清透明、不会发生变色现象。本发明所述的N-乙酰神经氨酸钙盐晶体可以通过N-乙酰神经氨酸和钙源在水相环境中反应、进而结晶析出得到，其制备方法简单，产物的收率高，可达到70～85％，适宜规模化生产。本发明提供的高稳定性、高溶解度的N-乙酰神经氨酸钙盐晶体吸收率高，能够同时满足人体对钙和N-乙酰神经氨酸的补充需求，在保健品、食品、生物医药和化妆品中都具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例1提供的N-乙酰神经氨酸钙盐晶体的红外光谱图；

图2为原料N-乙酰神经氨酸的红外光谱图；

图3为实施例1提供的N-乙酰神经氨酸钙盐晶体的多晶X射线衍射图；

图4为对比例2提供的N-乙酰神经氨酸钙盐的多晶X射线衍射图；

图5为实施例1提供的N-乙酰神经氨酸钙盐晶体和原料N-乙酰神经氨酸的水溶液稳定性对比图；

图6为实施例1提供的N-乙酰神经氨酸钙盐晶体和原料N-乙酰神经氨酸的溶解度对比图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

本发明以下实施例中，原料N-乙酰神经氨酸(无水物)可通过市场途径获得，可以为天然物提取法、化学合成法、酶催化法或微生物发酵法制备得到的N-乙酰神经氨酸(无水物)，本发明不对其来源进行特殊限定。

实施例1

本实施例提供一种N-乙酰神经氨酸钙盐晶体，制备方法如下：

(1)将氢氧化钙0.74g(0.01mol)、N-乙酰神经氨酸6.48g(0.021mol)和500mL水混合，室温下搅拌反应8h，得到反应液；向反应液中加入0.2％的活性炭，60℃脱色30min，用0.22μm的滤膜过滤，收集滤液，并将滤液浓缩为15mL反应液；

(2)向步骤(1)得到的反应液中加入3倍体积的乙醇，在4℃条件下静置结晶8h，然后用0.22μm的滤膜过滤，收集固相；所述固相用75％乙醇水溶液洗涤2次，60℃减压干燥12h，得到所述N-乙酰神经氨酸钙盐晶体，产率为75％。

实施例2

本实施例提供一种N-乙酰神经氨酸钙盐晶体，制备方法如下：

(1)将氢氧化钙0.74g(0.01mol)、N-乙酰神经氨酸6.18g(0.02mol)和500mL水混合，室温下搅拌反应8h，得到反应液；向反应液中加入0.2％的活性炭，60℃脱色30min，用0.22μm的滤膜过滤，收集滤液，并将滤液浓缩为60mL反应液；

(2)向步骤(1)得到的反应液中加入2倍体积的乙醇，然后将混合液升温至70℃，70℃持温条件下向混合液中滴加乙醇至混合液中出现浑浊；缓慢降温至4℃，在4℃条件下静置结晶12h，然后用0.22μm的滤膜过滤，收集固相；所述固相用无水乙醇洗涤2次，50℃减压干燥12h，得到所述N-乙酰神经氨酸钙盐晶体，产率为70％。

实施例3

本实施例提供一种N-乙酰神经氨酸钙盐晶体，制备方法如下：

(1)将N-乙酰神经氨酸61.8g(0.2mol)加入1500mL水中，常温搅拌溶解完全、得到N-乙酰神经氨酸水溶液；搅拌条件下在30min内将10g碳酸钙(0.1mol)缓慢分批加入上述N-乙酰神经氨酸水溶液中，待碳酸钙加入完毕后在40℃持温条件下搅拌反应5h，得到反应液；向反应液中加入0.2％的活性炭，70℃脱色15min，用0.22μm的滤膜过滤，收集滤液，并将滤液浓缩为40mL反应液；

(2)向步骤(1)得到的反应液中加入5倍体积的乙醇，在4℃条件下静置结晶8h，然后用0.22μm的滤膜过滤，收集固相；所述固相用75％乙醇水溶液洗涤2次，60℃减压干燥12h，得到所述N-乙酰神经氨酸钙盐晶体，产率为85％。

实施例4

本实施例提供一种N-乙酰神经氨酸钙盐晶体，制备方法如下：

(1)将N-乙酰神经氨酸20g(0.065mol)加入100mL水中，40℃搅拌溶解完全、得到N-乙酰神经氨酸水溶液；搅拌条件下在5min内将3.4g碳酸钙(0.034mol)缓慢分批加入上述N-乙酰神经氨酸水溶液中，待碳酸钙加入完毕后在60℃持温条件下搅拌反应2h，得到反应液；向反应液中加入0.8％的活性炭，60℃脱色45min，用0.22μm的滤膜过滤，收集滤液，即反应液；

(2)向步骤(1)得到的反应液中加入4倍体积的甲醇，在0℃条件下静置结晶12h，然后用0.22μm的滤膜过滤，收集固相；所述固相用75％甲醇水溶液洗涤2次，60℃减压干燥12h，得到所述N-乙酰神经氨酸钙盐晶体，产率为80％。

实施例5

本实施例提供一种N-乙酰神经氨酸钙盐晶体，制备方法如下：

(1)将N-乙酰神经氨酸61.8g(0.2mol)加入1500mL水中，常温搅拌溶解完全、得到N-乙酰神经氨酸水溶液；搅拌条件下在15min内将10.3g碳酸钙(0.103mol)缓慢分批加入上述N-乙酰神经氨酸水溶液中，待碳酸钙加入完毕后在50℃持温条件下搅拌反应6h，得到反应液；向反应液中加入0.5％的活性炭，40℃脱色30min，用0.22μm的滤膜过滤，收集滤液，并将滤液浓缩为120mL反应液；

(2)向步骤(1)得到的反应液中加入4倍体积的乙腈，在10℃条件下静置结晶24h，然后用0.22μm的滤膜过滤，收集固相；所述固相用75％乙醇水溶液洗涤2次，80℃减压干燥6h，得到所述N-乙酰神经氨酸钙盐晶体，产率为80％。

对比例1

本对比例与实施例3的区别在于，将步骤(1)中的碳酸钙用等摩尔量的氯化钙替换；氯化钙无法与N-乙酰神经氨酸反应得到钙盐晶体。

对比例2

本对比例与实施例3的区别在于，步骤(2)中不加入乙醇，而是将步骤(1)得到的反应液直接在60℃减压干燥12h，得到白色粉末状产物。

对比例3

本对比例与实施例1的区别在于，步骤(2)中加入2倍体积的乙醇，在4℃条件下静置结晶8h，无晶体析出；延长静置结晶时间至24h，仍无晶体析出。

性能测试：

(1)元素分析

使用有机元素分析仪(德国Elementar vario EL cube)测试C、H、O、N四种元素；使用电感耦合等离子体质谱仪(PlasmaQuad 3，美国热电VG分公司)测试Ca元素。测试步骤参考仪器的操作手册进行，每个样品重复测试3次，取平均值。

以实施例1、实施例3中提供的N-乙酰神经氨酸钙盐晶体为例，其元素分析的测试结果如表1所示。

表1

	N/％	C/％	H/％	O/％	Ca/％
						实施例1	4.26	40.5	5.48	43.9	5.90
实施例3	4.24	40.6	5.49	43.7	5.98

从表1的数据可知，本发明实施例1、实施例3中以氢氧化钙或碳酸钙为钙源，得到的产物分子式为(C₁₁H₁₈NO₉)₂Ca，是N-乙酰神经氨酸钙盐。

(2)红外光谱分析

使用傅里叶变换红外光谱仪(美国Nicolet 8700)分别测试实施例1提供的N-乙酰神经氨酸钙盐晶体和原料N-乙酰神经氨酸的红外光谱图，图1为实施例1中提供的N-乙酰神经氨酸钙盐晶体的红外光谱图，图2为原料N-乙酰神经氨酸的红外光谱图。对比图1和图2可知，产物N-乙酰神经氨酸钙盐晶体在1700cm^-1处无吸收峰，在1650～1550cm^-1和1400cm^-1附近出现两个类似羧酸1700cm^-1的羰基峰的双峰，证明产物中羧基与钙离子相互作用形成了羧酸盐。

(3)晶体结构分析

使用样品水平型大功率X射线粉末衍射仪(PXRD，TTR-III，日本理学电机公司)测试产物的晶体结构，实施例1提供的N-乙酰神经氨酸钙盐晶体的多晶X射线衍射图如图3所示，从图3中可以看出，所述N-乙酰神经氨酸钙盐晶体在固定角度具有明显的衍射现象，有明显的衍射峰，2θ衍射角及其相对强度的具体数据如表2所示。

表2

对比例2提供的产物N-乙酰神经氨酸钙盐的的多晶X射线衍射图如图4所示，从图4中可知，该测试样品没有明显的衍射峰，即不具有晶体结构，是无定形态的N-乙酰神经氨酸钙盐。

(4)晶体熔点测试

使用熔点测试仪(上海精密WRS-1A)分别测试实施例1～5提供的N-乙酰神经氨酸钙盐晶体的熔点；以实施例1中的N-乙酰神经氨酸钙盐晶体为例，其熔点为233.35℃。

(5)稳定性测试

i、将实施例1提供的N-乙酰神经氨酸钙盐晶体和原料N-乙酰神经氨酸分别配制成5g/L的水溶液，水溶液均为无色澄清透明的液体；然后将二者置于121℃环境中高温灭菌15min，观察其颜色变化。

图5为实施例1提供的N-乙酰神经氨酸钙盐晶体和原料N-乙酰神经氨酸的水溶液稳定性对比图，从图5中可知，本发明提供的N-乙酰神经氨酸钙盐晶体水溶液高温处理后仍然保持无色澄清透明的状态，稳定性好；N-乙酰神经氨酸水溶液高温处理后从无色转变为深色，稳定性欠佳。

ii、将实施例1提供的N-乙酰神经氨酸钙盐晶体和对比例2提供的N-乙酰神经氨酸钙盐(无定形态)置于184℃的高温环境中20min，N-乙酰神经氨酸钙盐晶体仍然为白色粉末，而对比例2中的N-乙酰神经氨酸钙盐(无定形态)变为黑色粉末，证明对比例2中的无定形态N-乙酰神经氨酸钙盐稳定性明显低于本发明提供的N-乙酰神经氨酸钙盐晶体。

(6)溶解度测试

分别配制实施例1提供的N-乙酰神经氨酸钙盐晶体和原料N-乙酰神经氨酸无水物晶体在各温度下的饱和水溶液(即溶液中有溶解残留，测试时取上清液)，使用液相色谱仪(HPLC，SHIMADZU LC-15C)精确测试其溶解度。

色谱条件如下：色谱柱型号为Aminex HPX-87H，300mm×7.8mm(catalog#125-0140)，检测器为UV检测器。检测波长：210nm；柱温：60℃；流动相：0.005M硫酸；流速：0.60mL/min；进样体积：20μL。

以温度为横轴、溶解度为纵轴制图，得到实施例1提供的N-乙酰神经氨酸钙盐晶体和原料N-乙酰神经氨酸的溶解度对比图如图6所示，与N-乙酰神经氨酸相比，本发明提供的N-乙酰神经氨酸钙盐晶体在水中的溶解度显著提升，室温下的溶解度可以达到400g/L以上，可以充分满足N-乙酰神经氨酸钙盐晶体的应用需求。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的N-乙酰神经氨酸钙盐晶体及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。