一种复方鱼腥草喷雾剂及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种复方鱼腥草喷雾剂及其制备方法和应用 (Compound houttuynia cordata spray and preparation method and application thereof ) 是由 胡季强 王如伟 周祥 吴健 平夏婷 王建方 曹王丽 金辉辉 徐斌 于 2020-03-26 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种复方鱼腥草喷雾剂及其制备方法和应用,本发明产品可直接局部作用于黏膜及皮肤部位,阻断病毒体内扩散,起到消杀防治作用,特别是对冠状病毒具有很好的抑制作用。本发明未添加辅料,安全无刺激,制备工艺简单、绿色环保,适合工业化大生产。(The invention provides a compound houttuynia cordata spray and a preparation method and application thereof, and the product can directly and locally act on mucous membranes and skin parts, block the in-vivo diffusion of viruses, play a role in killing, preventing and treating, and particularly has a good effect of inhibiting coronaviruses. The invention has the advantages of no auxiliary material, safety, no stimulation, simple preparation process, environmental protection and suitability for industrial mass production.)
技术领域
本发明涉及抗菌消毒
技术领域
，尤其涉及一种用于皮肤及粘膜消毒的复方鱼腥草喷雾剂及其制备方法和应用。背景技术
病毒个体微小，结构简单，是由一种核酸分子(DNA或RNA)与蛋白质构成的非细胞形态的有机物种，在活细胞内寄生并以复制方式增殖，导致各种感染性疾病的发生。有数据显示，约有60％的流行性传染病是由病毒感染引起的。随着重症急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、埃博拉病毒(Ebola virus)、2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)等的肆虐，病毒已成为现代社会人们关注的一个沉重话题，抗病毒药物开发成为解决问题的关键。
临床上常用的抗病毒药物主要有：抑制病毒复制的抗病毒药、针对机体免疫功能的免疫调节剂。抗病毒药在某种意义上只是病毒抑制剂，不能直接杀灭病毒或破坏病毒体，否则也会损伤宿主细胞。由于病毒的多样性，至今仍缺乏广谱有效的病毒抑制剂。免疫调节剂以激素类药物为主，2003年时医生用了大量的激素来对患者进行治疗，效果显著但其副作用也对患者的身体造成了伤害，包括骨关节和软骨的坏死等。中药因其有效成分的多元化，病毒难以对其产生抗药性，部分药物还能增强机体免疫功能，使中药在防治病毒感染性疾病方面具有明显的优势。
金银花、鱼腥草、黄芩、连翘和板蓝根为临床常用清热解毒中药，研究表明其具有较好的抗病毒和免疫调节作用。然而植物的化学成分复杂，往往含有多种成分，对抗病毒植物有效部位进行筛选的研究很多，但众说纷纭。已有的研究表明，黄酮、多酚、多糖、生物碱类、挥发油、木脂素等对病毒均具有抑制作用。范路路等(范路路,侯林,刘苗苗,等.鱼腥草不同溶剂提取物的抗病毒活性研究[J].中国现代应用药学,2019,36(21):2643-2647)报道，鱼腥草醇提物中黄酮类成分含量较高，抗病毒活性相对较高，50％乙醇提取物总黄酮含量最高；其中30％乙醇提取物对单纯疱疹病毒I型(HSV-1)效果最好，50％乙醇提取物对手足口病毒(EV71)效果最好；对呼吸道合胞病毒(RSV)、柯萨奇病毒B3型(CV-B3)、柯萨奇病毒B5型(CV-B5)的效果甚微或无明显作用。HSV-1、EV71、RSV、CV-B3、CV-B5为不同类型病毒，鱼腥草不同提取物具有不同的抑制效果。
易文龙(双黄连、鱼腥草、大蒜新素注射液抗鼠冠状病毒MHV-3效应的体内外实验研究[D].华中科技大学,2006)报道，在体外细胞模型，鱼腥草注射液具有明显抗鼠冠状病毒MHV-3作用，其抑制效应呈剂量依耐性，可能涉及病毒吸附和穿入以及细胞内增殖等多个环节。K.H.Chiow等在Evaluation of antiviral activities of Houttuynia cordataThunb.extract,quercetin,quercetrin and cinanserin on murine coronavirus anddengue virus infection(鱼腥草提取物，槲皮素，槲皮苷和肉桂硫胺对鼠冠状病毒和登革热病毒的抗病毒活性评估)(Asian Pacific Journal of Tropical Medicine,2016,9(1):1-7.)报道了鱼腥草乙酸乙酯提取部分对小鼠肝炎病毒(MHV)的IC50是0.98μg/mL，且无相关毒性反应；给予小鼠2000mg/kg的鱼腥草乙酸乙酯提取物后也未见急性毒性反应；此外，提取物中的某些黄酮类成分及槲皮素具有较弱的抗病毒活性。MHV虽然是同属于冠状病毒科的单正链RNA病毒，敏感小鼠如Balb/c、C57/BL6感染可在肝血窦形成血栓，致肝脏微循环改变，大量肝细胞缺血坏死，引起暴发性病毒肝炎甚至死亡；但其与SARS-CoV-2在基因同源上有较大的差距，其所导致的临床症状也明显不同，尚未见到感染人的相关报道。因此如何发挥出中药组方的抗病毒作用成为开发的难点。
复方鱼腥草合剂/滴丸的研究表明，其针对呼吸道感染及肺炎的疗效优于利巴韦林等，但其为口服药物，提取成分多而杂不易附着，且存在色素等并不适合表皮粘膜消杀。喷雾剂具有速效和定位的独特药物递送作用，避免胃肠道的破坏和肝脏首过效应，且临床应用方便，可以准确控制剂量，得到普遍认可；同时喷雾剂在皮肤、鼻腔和口粘膜应用，可阻断病毒体内扩散，起到快速的防治效果。
因此针对上述问题，本发明在复方鱼腥草组方基础上开发一款中药抗病毒喷雾剂，解决现有抗病毒特异性药物缺乏、无法实现表面粘膜病毒消杀的不足。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种用于皮肤及粘膜消毒的复方鱼腥草喷雾剂及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明提供技术方案如下：
一种复方鱼腥草喷雾剂，其组方按重量比为：鱼腥草80-120份、金银花5-20份、连翘5-20份、黄芩15-40份、板蓝根15-40份、薄荷5-20份。更进一步，鱼腥草100份、金银花10份、连翘10份、黄芩25份、板蓝根25份、薄荷10份。
一种复方鱼腥草喷雾剂，其由以下方法制备获得：
(1)按照组方取鱼腥草、金银花、连翘、黄芩、板蓝根、薄荷，除杂粉碎，过筛，所得粉末加入3-8倍量的70％-90％乙醇混合，浸泡2-5h后，回流提取1-3次，分别收集提取液；
(2)合并上述所得提取液，冷却至3-8℃，过滤后减压蒸馏，加入20％-40％乙醇，搅匀，滤过，分装，即得。
优选的，所述复方鱼腥草喷雾剂的喷雾剂制备方法为：
(1)取鱼腥草100g、金银花10g、连翘10g、黄芩25g、板蓝根25g、薄荷10g，除杂粉碎，过50目筛，所得粉末加入6倍量的85％乙醇混合，浸泡3h后，回流提取2次，分别收集提取液；
(2)合并上述提取液，冷却至5℃，过滤后减压蒸馏，加入30％乙醇至950mL，搅匀，滤过，调整总量至1000mL，分装，即得。
优选的，本发明所述的复方鱼腥草喷雾剂中，控制粒度分布为0.5μm-5μm的雾滴占雾滴总体积的百分比为70％以上。
本发明复方鱼腥草喷雾剂，可用于口腔、鼻腔和皮肤预防或治疗细菌或病毒感染的应用。
优选的，本发明复方鱼腥草喷雾剂可用于预防或治疗冠状病毒的应用。
所述的冠状病毒优选为SARS-CoV-2。
此外，Vero E6细胞试验显示，复方鱼腥草喷雾剂对SARS-CoV-2的CC50＝630μL/mL，EC50＝17μL/mL，其SI为37.06。故复方鱼腥草喷雾剂在浓度m的条件下，具有抑制SARS-CoV-2活性且无细胞毒性，所述m的范围在10μL/mL<m<500μL/mL。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、复方鱼腥草组方鱼腥草、金银花、连翘、黄芩、板蓝根和薄荷是以传统中药配方为基础开发的广谱抗炎药物，但目前已报道的均为口服剂型，其由于含有蜂蜜等不适合体外应用；本发明采用喷雾剂型，可直接局部作用于黏膜及皮肤部位，阻断细菌或病毒体内扩散，起到消杀防治作用。
2、复方鱼腥草口服制剂以传统水提醇沉工艺为主，提取有效成分虽然多，但含有多糖等易于变质沉淀，不利于喷雾剂的制备；且复方鱼腥草合剂所含的成分以黄芩苷等水溶性成分为主，鱼腥草素、金丝桃苷、甲基正壬酮等脂溶性成分特别少。
3、本发明提取物直接采用高浓度的70％-90％乙醇提取，冷却至5℃以下过滤制得，所得提取物在不添加助溶剂、稳定剂的情况下，稳定地溶解于30％乙醇，可直接用于喷雾剂的制备。产品未添加辅料，安全无刺激；同时本发明提取物中含有丰富的脂溶性成分，具有很好的抑制细菌和病毒的作用，特别是对冠状病毒具有很好的抑制作用。尤其是复方鱼腥草喷雾剂在浓度m的条件下，具有抑制SARS-CoV-2活性且无细胞毒性，所述m的范围在10μL/mL<m<500μL/mL。
4、中药多具有苦涩等难以接受的气味，特别是方中鱼腥草具有鱼腥味，本发明虽然加入薄荷，但仅用70％-90％乙醇提取后有较浓的鱼腥味；为获得稳定的提取物，本发明同时采取将提取液冷却至5℃以下过滤的方法，结果意外发现处理后的药物气味得到明显的改善，具有较好的口感气味。
5、本发明制备工艺简单、绿色环保，适合工业化大生产。
附图说明
图1为黄芩苷、鱼腥草素对照品高效液相图谱，其中峰1为黄芩苷，对应的保留时间为20.326min；峰2为鱼腥草素，对应的保留时间为22.820min。
图2为复方鱼腥草水煎液高效液相图谱，其中峰1为黄芩苷，对应的保留时间为20.216min。
图3为复方鱼腥草80％醇提液高效液相图谱，其中峰1为黄芩苷，对应的保留时间为20.429min；峰2为鱼腥草素，对应的保留时间为23.001min。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：抑菌研究
采用平板菌落计数法计算抑菌率：将灭菌后的牛肉汤液体培养基和沙氏液体培养基培养金黄色葡萄球菌和白色念珠菌在37℃下恒温振荡培养24h，用无菌培养基分别梯度稀释至10-7，备用。
在无菌的牛肉汤琼脂培养基平板和沙氏琼脂培养基平板中各加入2mL复方鱼腥草组方水煎液、30％乙醇提取液、50％乙醇提取液、80％乙醇提取液、无菌水，涂布均匀。其中无菌水作空白对照。
分别将稀释后的带菌液体培养基，分别均匀涂布在加样后的牛肉汤琼脂培养基和沙氏琼脂培养基上，37℃培养12h后，挑选菌落数在30～300的平板计数，计算抑菌率。
表1不同工艺抑菌研究
实验结果如表1所示，复方鱼腥草组方水煎液、乙醇提取液均有一定的抑菌作用，其中50％乙醇和80％乙醇提取液的抑菌作用更优。
实施例2：复方鱼腥草组方合剂和80％乙醇提取液成分考察
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.01mol/L四丁基溴化胺为流动相B，以二乙胺为流动相C，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为280nm；流速为1.0mL/min。
对照品溶液的制备取黄芩苷对照品、鱼腥草素对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含黄芩苷20μg、鱼腥草素5μg的溶液，即得
供试品溶液的制备精密量取本品1mL，置5mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
实验结果如图1-图3所示：复方鱼腥草组方合剂和80％乙醇提取液均具含有黄芩苷，但合剂中不含有鱼腥草素，且其他脂溶性成分含量较少，而80％乙醇提取液中含有鱼腥草素、金丝桃苷、甲基正壬酮等脂溶性成分。
实施例3：复方鱼腥草喷雾的制备1
取鱼腥草100g、金银花10g、连翘10g、黄芩25g、板蓝根25g、薄荷10g，除杂粉碎，过50目筛；所得粉末加入6倍量的85％乙醇溶液混合，浸泡3h后55℃回流提取2次，分别收集提取液；合并上述所得提取液，冷却至5℃，过滤后减压蒸馏，加入30％乙醇至950mL，搅匀，滤过，调整总量至1000mL，分装，即得。
实施例4：复方鱼腥草喷雾的制备2
取鱼腥草100g、金银花10g、连翘10g、黄芩25g、板蓝根25g、薄荷10g，除杂粉碎，过50目筛；所得粉末加入3倍量的90％乙醇溶液混合，浸泡5h后55℃回流提取3次，分别收集提取液；合并上述所得提取液，冷却至3℃，过滤后减压蒸馏，加入30％乙醇至950mL，搅匀，滤过，调整总量至1000mL，分装，即得。
实施例5：复方鱼腥草喷雾的制备3
取鱼腥草100g、金银花10g、连翘10g、黄芩25g、板蓝根25g、薄荷10g，除杂粉碎，过50目筛；所得粉末加入8倍量的70％乙醇溶液混合，浸泡2h后55℃回流提取1次；合并上述所得提取液，冷却至1℃，过滤后减压蒸馏，加入30％乙醇至950mL，搅匀，滤过，调整总量至1000mL，分装，即得。
实施例6：复方鱼腥草喷雾的制备4
取鱼腥草100g、金银花10g、连翘10g、黄芩25g、板蓝根25g、薄荷10g，除杂粉碎，过50目筛；所得粉末加入10倍量的50％乙醇溶液混合，浸泡1h后55℃回流提取3次，分别收集提取液；合并上述所得提取液，冷却至5℃，过滤后减压蒸馏，加入30％乙醇至950mL，搅匀，滤过，调整总量至1000mL，分装，即得。
实施例7：复方鱼腥草喷雾的制备5
取鱼腥草100g、金银花10g、连翘10g、黄芩25g、板蓝根25g、薄荷10g，除杂粉碎，过50目筛；所得粉末加入2倍量的95％乙醇溶液混合，浸泡6h后55℃回流提取3次，分别收集提取液；合并上述所得提取液，冷却至10℃，过滤后减压蒸馏，加入40％乙醇至950mL，搅匀，滤过，调整总量至1000mL，分装，即得。
实施例8：气味考察
通过志愿者对实施例3-实施例7制备的喷雾剂的气味进行考察。
表2喷雾剂气味考察情况
实验结果如表2所示，实施例3-实施例6采用本发明方法步骤(2)中冷却至5℃处理后，提取液无鱼腥味，有淡淡薄荷香，具有较好的口感气味；而实施例7采用冷却至10℃处理，具有鱼腥味。
实施例9：稳定性考察
将实施例3-实施例7中的喷雾剂液体分别封装于透明喷瓶中，于37℃的恒温箱内放置1个月左右观察液体状态；加速静置3个月，检测槲皮素含量变化情况。
表3喷雾剂稳定性考察情况
实验结果如表3所示，实施例3-实施例5采用本发明方法制备的喷雾剂液体澄清，无沉淀；且加速3个月槲皮素含量无变化，稳定性好；实施例6制备的喷雾剂放置1个月后略有沉淀，3个月槲皮素含量下降0.1％；实施例7制备的喷雾剂放置1个月后有分层，稳定性一般。因此本发明的喷雾剂质量最佳。
实施例10：刺激性考察
采取动物实验对实施例3-实施例5制备的喷雾剂进行刺激性考察。取豚鼠32只，随机分成4组，多次给药同单次给药方式在同一部位连续给药，给药时间和计量相同，连续使用7d。参照《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》的皮肤刺激反应评分标准进行评分。
表4喷雾剂对皮肤刺激性平均分值
皮肤测试评分结果如表4所示：实施例3-实施例5制备的喷雾剂单次及多次给药后，实验豚鼠无红斑和水肿(平均反应值，分值0-0.49为无刺激性)；其中实施例2的喷雾剂多次给药后，实验豚鼠出现好转现象，提示本品具有一定皮肤修复作用。
实施例11：药物细胞毒性试验
(1)无菌96孔培养板，每孔加入100μL浓度为5×104cell/mL Vero E6细胞，37℃5％CO2孵箱培养24h；
(2)实施例3药物用DMEM培养基(含2％双抗和16μg/mL胰蛋白酶)稀释至1000μL/mL、500μL/mL、100μL/mL、50μL/mL、10μL/mL；
(3)弃去步骤(1)中96孔培养板中细胞培养液，分别加入步骤(2)稀释好的药物，每个浓度4个复孔，每孔100μL，然后每孔再加入等体积100μL DMEM培养基(含2％双抗和16μg/mL胰蛋白酶)；
(4)同时设立细胞对照：每孔200μL DMEM培养基(含2％双抗和16μg/mL胰蛋白酶)加入至长成每层的Vero E6细胞96孔培养板中，共4个复孔；
(5)37℃，5％CO2孵箱孵育3d；
(6)光学显微镜下观察细胞病变(CPE)。细胞有病变记录为“+”，细胞无CPE变化或正常细胞形态记为“-”。
以上实验操作均在BSL-3实验室内完成。试验结果如表5所示。
表5药物细胞毒性试验结果
“+”为细胞CPE变化，“-”为细胞无CPE变化或正常细胞形态。
结果表明：100μL/mL以内(即原液稀释10倍)的实施例3药物无细胞毒性，500μL/mL(即原液稀释2倍)可能存在细胞毒性。根据药物对细胞半数中毒浓度CC50计算公式，得出CC50为630μL/mL。
实施例12：抗SARS-CoV-2病毒研究
(1)无菌96孔培养板，每孔加入100μL浓度为5×104cell/mL Vero E6细胞，37℃5％CO2孵箱培养24h；
(2)实施例3药物用DMEM培养基(含2％双抗和16μg/mL胰蛋白酶)稀释至500μL/mL、100μL/mL、50μL/mL、10μL/mL、1μL/mL，每个浓度4个复孔，每孔100μLDMEM培养基(含2％双抗和16μg/mL胰蛋白酶)，然后每孔再加入等体积100TCID50的SARS-CoV-2病毒(中国医学科学院医学实验动物研究所病原中心保存)，37℃，5％CO2孵箱作用1h；
(3)1h后，弃去步骤(1)中96孔培养板中细胞培养液，加入步骤(2)药物混合液；
(4)同时设立细胞对照和病毒对照(阴性对照)；
(5)细胞37℃，5％CO2孵箱孵育4-5d；
(6)光学显微镜下观察细胞病变(CPE)。以上实验操作均在BSL-3实验室内完成。实验结果如表6所示。
表6.药物抗SARS-CoV-2效果
“+”为细胞CPE变化，“-”为细胞无CPE变化或正常细胞形态。
结果表明：Vero E6细胞中感染100TCID50的SARS-CoV-2同时加入实施例3药物，10μL/mL药物(即原液稀释100倍)对SARS-CoV-2即具有抑制活性。根据药物抑制病毒半数有效浓度EC50计算公式，得出EC50为17μL/mL。
根据药效评价指标，计算选择指数(Selection Index,SI)＝CC50/EC50＝37.06(选择指数大于1.00为药物有效，指数越大安全范围越大，安全性越高。
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