一种针对关节软骨损伤的靶向纳米磁共振造影剂及其制备和应用
阅读说明：本技术 一种针对关节软骨损伤的靶向纳米磁共振造影剂及其制备和应用 (Targeting nano magnetic resonance contrast agent for articular cartilage damage and preparation and application thereof ) 是由 鹿蓉 陈爽 陶虹月 张宇阳 陆遥 周璐 李慧逖 于 2020-10-15 设计创作，主要内容包括：本发明属于分子影像学技术领域,涉及一种针对关节软骨损伤的靶向纳米磁共振造影剂及其制备和应用。本发明所述造影剂的结构为HA-DTPA-Gd,是通过二乙三胺五乙酸DTPA将透明质酸HA与钆离子Gd(III)链接,其分子结构式如式(I)所示。本发明造影剂可通过关节腔注射,尺寸为纳米级别,纳米颗粒基于其表面效应与软骨缺损区的细胞外基质结合,在软骨损伤区更易特异性聚集,MRIT1加权延迟增强后病灶区较临床含钆造影剂强化程度明显,从而能够准确、直观显示软骨损伤灶,有助于临床提高治疗的精确性和安全性,评价膝关节软骨损伤治疗方式的疗效、评估患者的预后。(The invention belongs to the technical field of molecular imaging, and relates to a targeted nano magnetic resonance contrast agent for articular cartilage damage, and preparation and application thereof. The contrast agent HAs a structure of HA-DTPA-Gd, hyaluronic acid HA is linked with gadolinium ions Gd (III) through diethylenetriaminepentaacetic acid DTPA, and the molecular structural formula of the contrast agent is shown as a formula (I). The contrast agent can be injected through a joint cavity, is nano-scale in size, is combined with extracellular matrix of a cartilage defect area based on the surface effect of nano-particles, is more easily and specifically aggregated in the cartilage damage area, and has MRIT1 weighted delay increaseThe strengthening degree of the strong posterior focal zone is obvious compared with the strengthening degree of a clinical gadolinium-containing contrast agent, so that the cartilage damage focus can be accurately and visually displayed, the accuracy and the safety of treatment can be clinically improved, the curative effect of a knee joint cartilage damage treatment mode can be evaluated, and the prognosis of a patient can be evaluated.)
技术领域
本发明属于分子影像学
技术领域
，涉及一种针对关节软骨损伤的靶向纳米磁共振造影剂及其制备和应用，具体涉及一种基于透明质酸(Hyaluronic Acid，HA)的黏多糖修饰的关节软骨损伤特异性纳米磁共振造影剂及其制备方法和应用。背景技术
关节软骨损伤是临床常见病、多发病，影响人群广泛。所述软骨覆盖于关节表面，发挥减少关节运动产生的摩擦、吸收机械震荡、分配关节负荷的作用；软骨由分散的软骨细胞与细胞外基质组成，缺乏血供。细胞外基质主要包括胶原(15-20％)、蛋白多糖(3-10％)和水分(65-80％)。引起软骨损伤的病因很多，急慢性损伤、肥胖、增龄、遗传、免疫等因素均是引起软骨细胞损伤的因素，损伤的软骨细胞将释放中性蛋白酶、胶原酶等降解软骨基质中的蛋白聚糖与胶原纤维网络，使软骨结构破坏、水肿、粘弹性降低，软骨生物力学功能破坏，导致软骨损伤、变性。软骨损伤易引起关节疼痛、水肿、活动度减低，而体内关节软骨不能再生，自身修复能力极其有限，一旦发生损伤很难自愈，若不及时诊断治疗将导致不可逆的损伤，逐渐发展为继发性骨关节炎，最终导致关节功能丧失，严重影响患者的生活质量。因此，及时诊断关节软骨损伤是临床进行早期干预的关键。
目前，关节镜是诊断关节软骨损伤的重要手段，但关节镜属于有创性检查，对操作者的技术要求高，可能发生术后并发症，并且其对软骨厚度、软骨周围结构等无法评价。MRI具有多方位、多序列、多参数成像及组织分辨力高等优点，成为目前唯一能有效显示关节软骨形态学变化的无创性检查方法，能够显示软骨表面、内部特征及周围组织等。然而，早期软骨损伤或退变在形态学还没有发生改变前，就已出现软骨基质内蛋白多糖的丢失和胶原纤维网络的破坏。常规MRI序列只能显示软骨厚度、完整性等形态学结构的改变，而不能显示软骨内部蛋白多糖及胶原结构的改变，因而，无法早期检测到软骨的变性。随着运动损伤、肥胖的高发，以及我国人口老龄化的趋势，临床对关节软骨损伤诊断及其治疗评估的要求日益提高，希望MRI能在软骨损伤、退变的早期敏感地发现软骨形态学改变，甚至软骨基质生化成分的改变，在治疗后的随访过程中能定量定性评估软骨修复情况，达到关节镜甚至病理活检一样的效果；因此，软骨成像对影像医学及运动医学都是一个重要的研究领域，为临床决策和各种手术或非手术疗效评估提供重要依据。
随着MRI的发展，出现了很多能优越显示软骨的新序列，例如可高分辨显示软骨形态的序列(3D-FSPGR、3D-DESS、3D-FLASH、3D-SSFP等)，以及可以反映软骨基质生化构成的功能序列(T2-mapping、dGEMRIC、T1-mapping，DWI、T1ρmapping、UTE等)，一定程度上提高了对早期软骨损伤变性的诊断能力及治疗后的监测能力，但所述序列原理上都只是间接反映软骨基质内的蛋白多糖(如dGEMRIC、T1ρmapping)及胶原纤维成分(如T2-mapping、UTE)，容易受关节液、软骨基质内水分等的影响，缺乏特异性，同时不可避免受到魔角效应的影响，缺乏准确性。目前，在软骨MRI成像领域，软骨的特异性显像即软骨分子影像学探针的研究还是空白，软骨的成像还缺乏一种能与软骨内部结构特异性结合的靶向造影剂，对软骨的成像能达到既敏感又准确。所述MRI探针主要分为两类:一类是含有Gd的顺磁性探针，可加强T1WI的信号，另一类是含有超顺磁性氧化铁的探针，在T2WI中起到负对比的作用。而理想的磁共振分子影像学探针必须具备以下特点:1、标记的分子需要达到一定的化学纯度；2、标记的分子与靶的结合应有高度特异性；3、分子量要小，容易穿过细胞膜；4、成像期间，该化合物要保持稳定，以便得到清晰的图像。
近年来，磁共振造影剂的开发与应用研究的趋势是对二乙三胺五乙酸(Diethylene-triamine Pentaacetic Acid,DTPA)的基本骨架做化学修饰，以提高造影剂对特定脏器及病变的选择性与适应性。有研究报道过基于哺乳动物肝实质细胞表面存在大量脱唾液酸糖蛋白受体，能选择性识别结合含D-半乳糖基的糖蛋白，将D-半乳糖引入DTPA和DOTA可合成肝靶向性造影剂；利用肿瘤能选择摄取叶酸的特性，将叶酸与DTPA结合合成了含叶酸基团的造影剂，这类造影剂对肿瘤具有较好的靶向性；用维生素B6类衍生物修饰DTPA合成了一系列肝胆靶向造影剂；将系列疏水性氨基酸、短肽与DTPA反应，所得配体的Gd(III)配合物具有与Gd-DTPA相当的T1弛豫性能等等。基于上述研究的启发，本发明人将透明质酸和氨基葡萄糖作为亲和靶头，以DTPA为母体金属螯合剂分子，通过共价键进行偶联(酯键或酰胺键)，并引入Gd离子，初步合成Gd(DTPA-HA)及造影剂(具体合成路线如图1所示)。
目前应用较多的是以含钆(Gd(III))化合物和螯合剂为主要原料，经螯合反应而制得的一走很小分子钆类螯合物。公开号为CN109867635A的专利公开了一种T1型胶束磁共振成像造影剂及其制备方法,该胶束磁共振成像造影剂是基于两亲性小分子含钆配合物的溶液自组装成为胶束,同时具备了高弛豫率、极佳水溶性和良好生物相容性的优点。该发明所述MRI造影剂以氨基修饰Gd-HP-DO3A为基本框架通过酰胺键链接不同长度的烷基链,以此构造了疏水长链修饰的两亲性小分子造影剂,且能在水溶液中自组装为胶束实现弛豫率的突跃式增长；同时本发明提供的一种T1型胶束磁共振成像造影剂制备方法路线简短,操作容易。
有研究者把含金属离子造影剂吸附或包覆于微米级或纳米级的颗粒中，利用微粒的粒径、表面电荷、吸附性等特殊参数及性能增强造影剂的特定领域的应用效果。公开号为CN110755618A的专利公开了一种透明质酸-铜(II)复合纳米粒子及其制备方法,该铜(II)复合纳米粒子是通过二乙三胺桥联修饰的透明质酸与铜(II)盐为原料制备的。本发明的制备方法操作简单、方便、原料便宜且易得,通过透明质酸修饰的铜(II)复合纳米粒子,对癌细胞具有靶向性、生物相容性好,具有较低的毒副作用。并且,二乙三胺修饰的透明质酸-铜(II)复合纳米粒子在近红外区域有良好的吸收,具有光热转换的可能。光热性质研究证实了其具有良好的光热性能。透明质酸-铜(II)复合纳米粒子光热治疗,在癌症治疗领域具有广阔的应用前景。公开号为CN110787294A的专利公开了一种透明质酸-黑色素纳米粒子的制备方法,该方法通过Schiff base反应/Michael addition反应将氨基化的透明质酸与黑色素纳米粒子结合,得到透明质酸-黑色素纳米粒子,在增强天然黑色素纳米粒子生物相容性的同时,提高天然黑色素纳米粒子的细胞摄取效率,使天然黑色素纳米粒子对于癌细胞具有靶向识别特性；制得的透明质酸-黑色素纳米粒子具有优良的生物相容性,无毒性,分散性与稳定性均优于修饰前,且透明质酸表面富含羧基和羟基,可以通过修饰与多种抗癌药物连接,为抗癌治疗提供可利用的载体。公开号为CN101862461A的专利发明了一种用于淋巴系统特异成像的含钆大分子造影剂HA-DTPA-Gd及其制备方法。该造影剂的分子结构为：采用本发明所制备得到的大分子MRI造影剂,其分子量大,组织间隙给药后,主要被毛细淋巴管吸收而不能进入毛细血管；同时,造影剂的主链为透明质酸分子,因此极易被毛细淋巴管内的淋巴内皮透明质酸受体LYVE-1所摄取而进入淋巴系统,实现淋巴主动靶向,杜绝了在淋巴系统核磁共振检查中毛细血管的干扰,提高了淋巴定性诊断的敏感性和特异性。公开号为CN107802888A的专利发明了一种促进软骨再生的纳米纤维支架的制备方法,该纳米纤维支架生物相容性好,能保护生长因子的生物活性,延长生长因子的释放时间,有利于促进软骨修复和再生。
上述专利记载了靶向纳米造影剂多集中于肿瘤成像以及生物支架，软骨成像纳米造影剂的专利较少，公开号为CN109620974A的专利公开了一种骨关节炎软骨靶向钆基磁共振成像造影剂及其制备方法,该造影剂包括Gd2CO3纳米颗粒,在Gd2CO3纳米颗粒的表面包裹有多巴胺外壳,在多巴胺外壳的表面通过端基修饰的聚乙二醇负载有软骨靶向多肽,且该软骨靶向多肽的氨基酸序列为DWRVIIPPRPSA；该骨关节炎软骨靶向钆基磁共振成像造影剂实现了骨关节炎软骨特异性靶向及MRI成像。该类造影剂易通过自由扩散至关节腔与周围关节腔积液相混合，临床Gd剂弛豫率较低，软骨渗透性较差，不仅干扰了关节软骨缺损区域的成像效果，并且延迟强化程度较为不明显。
透明质酸(Hyaluronic Acid，HA)是一种由葡萄糖酸和乙酰氨基己糖所组成的双糖单位聚合而成的黏多糖，分子式为(C14H2lOllN)n，分子量Mw＝n×378+18。高分子量透明质酸是关节滑液的主要成分，是软骨基质的成分之一。临床上，透明质酸及其制剂关节内注射被广泛应用于骨性关节炎的治疗，具有无菌、无毒、无抗原性、无趋化作用，不引起异物反应等特性。国内外大量研究证实骨性关节炎的机制的研究中，比较公认的有：1.HA能提高关节腔内透明质酸的含量，其覆盖于关节软骨和滑膜的表面，可修复已破坏的生理屏障，防止软骨基质进一步丢失，保护关节软骨；2.透明质酸可进入受损软骨层与蛋白多糖非共价结合，形成关节软骨基质特有的局分子，即聚合素，聚合素充填于受损的胶原网中，有助于将蛋白多糖锚固在基质中，防止基质的进一步丢失，修复软骨；3.增强关节滑液的润滑作用，改善关节的活动功能；4.限制炎性介质的扩散，对关节软骨起化学保护作用；5、促进滑膜细胞合成自身透明质酸；6.对伤害性感受器的稳定作用，抑制滑膜及滑膜下伤害感受器的兴奋性；其中，上述第2点：透明质酸能与受损软骨层内蛋白多糖非共价结合形成聚合素充填于受损的胶原网中，是本发明人设想利用透明质酸类多糖分子作为载体制备软骨磁共振分子影像学探针的重要依据。
根据上述背景，当其用于软骨造影时，经关节腔注射后可较快进入关节腔引流至软骨缺损区域，以上方法制备工艺简单，安全有效，本发明人拟以黏多糖复合物透明质酸为靶向功能分子，二亚乙基三酸钆(Diethylene-triamine Pentaacetic Acid-Gd(III),DTPA-Gd)为载体，提高该造影剂的弛豫率和延迟增强的信噪比变化程度，利用纳米颗粒的高渗透性和透明质酸的亲和力，构建一种全新的关节软骨靶向纳米磁共振造影剂。
发明内容
本发明克服现有技术中的缺陷，提供一种针对关节软骨损伤区域的靶向纳米磁共振造影剂及其制备和应用，具体涉及一种透明质酸修饰的纳米靶向造影剂。
本发明通过含钆造影剂将生物大分子透明质酸(HA)与钆(Gd(III))离子连接形成HA、Gd-DTPA二元偶联物，制备成纳米标靶造影剂，可通过关节腔与关节软骨特异性结合，直观显示软骨损伤区域的分布，提高软骨损伤区域的检出率和准确率。
本发明的另一个目在于提供了所述纳米级含钆造影剂的制备方法。
为达到上述目的，本发明采用如下步骤：将透明质酸(HA)与钆(Gd(III))离子连接形成HA、Gd-DTPA二元偶联物，冻干后形成纳米颗粒，纳米材料基于表面效应，通过关节腔软骨的亲和力，渗透入软骨的细胞外基质内，由于软骨损伤区域的纤维骨架紊乱，因此所述纳米材料富集于软骨损伤区域。
本发明中，所述造影剂的结构为HA-DTPA-Gd，其通过二乙三胺五乙酸(DTPA)将透明质酸(HA)与钆离子(Gd(III))连接，其分子结构如式(I)所示：
优选地，所述造影剂为含钆特异性纳米磁共振造影剂HA-DTPA-Gd NPs。
优选地，所述HA-DTPA-Gd NPs的直径在50～100nm；所述HA-DTPA-Gd NPs安全性高，可生物降解，主要提高组织T1强化时间，可与多种配体连接形成靶向造影剂，灵敏度、特异度高。
更优选地，所述HA-DTPA-Gd NPs的粒径为50～100nm。
优选地，所述免疫荧光标记物包括5-羧基荧光素(5-FAM SE)。
优选地，所述透明质酸的分子量为990,000Da。
本发明所述造影剂的制备方法，步骤为：
a.取200mg分子量为990,000Da透明质酸HA(0.5mM)充分溶解于50ml试管中，加入20mL双蒸水，室温下搅拌1h至澄清透明，加入1％(2-3mg)5-FAM SE搅拌1-2h；在600μL二甲亚砜中加入90mg的二亚乙基三胺五乙酸二酐(0.25mM)进行溶解，室温下搅拌2-3h；加入105mg六水合氯化钆(0.25mM)，搅拌0.5h，将反应溶液加入截留分子量为30000的透析袋中，在双蒸水中进行透析24h-48h，注意使用锡箔纸避光保护，最终配置成14.26mmol/L的溶液A：其中二亚乙基三胺五乙酸二酐、透明质酸、六水合氯化钆和5-羧基荧光素的分别质量比为：1：1：0.8：0.8；
b.将溶液A进行冷冻干燥处理，生成纳米颗粒HA-DTPA-Gd NPs，得到产物即为纳米级透明质酸修饰的含钆Gd(III)造影剂；
上述的缓冲溶液为缓冲能力在pH值4.0～6.0的缓冲溶液；
上述的溶剂为非质子性极性溶液；
上述的非质子性极性溶液为：二甲亚砜；
上述的含钆Gd(III)离子化合物为在水溶液中能游离出Gd(III)离子的含钆化合物及其水合物；
上述的含钆Gd(III)离子化合物：氯化钆及其水合物。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)基于纳米材料的表面效应，更好地渗透入软骨细胞的细胞外基质中以及软骨细胞陷窝中；
(2)造影剂与透明软骨特异性结合，通过5-FAM SE和DAPI间接反映结合量，使用ICP-MS检测合成率，有助于更早提示软骨损伤区域分布，帮助临床提高治疗的精确性和安全性，评价疗效、评估预后；
(3)透明质酸类造影剂有提高软骨愈合程度药物组分，冀望通过靶向递药为及时干预提供帮助，实现显影与治疗一体化。
采用本发明所制备得到的纳米MRI造影剂，其尺寸为纳米级，因此组织间隙给药后，基于纳米的表面效应，能够更好地渗透入透明软骨中；同时，造影剂的主链为透明质酸分子，因此与软骨细胞外基质亲和性高，实现软骨缺损区域主动靶向，杜绝了软骨损伤磁共振成像检查中关节腔积液的干扰，提高了软骨损伤区域的延迟增强的高效性和安全性，提高了敏感性和特异性；在动物体内模拟实验中，此造影剂弛豫率较常规临床使用钆造影剂搞，证明了其有成像效果的高效性。同时，采用本方法所制备的MRI造影剂合成率搞，经ICP测试其合成率高达57.7％，有效保证了该造影剂的MRI信号强度。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为靶向纳米共振造影剂的作用原理示意图；
图2为靶向纳米共振造影剂的表征图；其中，a为化合物合成图，b、c为电镜图；d为粒径分布；
图3为靶向纳米共振造影剂的磁敏感特征；其中，a为Gd-HA NPs组、HA-DTPA-Gd组和Gd-DTPA组的弛豫率成像；b为不同浓度Gd-HA NPs组、HA-DTPA-Gd组和Gd-DTPA组的弛豫率线性回归图；
图4为三组MRI成像关节腔注射前、注射后1h、2h、3h的δSNR T1强化程度；其中，a、b为Gd-HA NPs组、HA-DTPA-Gd组和Gd-DTPA组在注射前、增强后1h、2h、3h的3D T1WI MR图像和伪彩图；c-d为Gd-HA NPs组、HA-DTPA-Gd组和Gd-DTPA组在注射前、增强后1h、2h、3h的软骨缺损区域SNR变化程度；e-f为Gd-HA NPs组、HA-DTPA-Gd组和Gd-DTPA组在注射前、增强后1h、2h、3h的正常软骨区域SNR变化程度。
图5为Gd-HA NPs和软骨的组织亲和力和渗透性。其中，a为5-羧基荧光素标记的Gd-DTPA-HA组和Gd-HA NPs组关节腔注射后2h的荧光染色图；b为两组间的平均荧光强度，Gd-HA NPs在软骨中的分布明显高于Gd-DTPA-HA组；c-e分别为H&E染色、番红固绿染色和PAS糖原染色的组织切片。
图6为；Gd-HA NPs组在动物体内代谢和毒性。其中，a、b为0h-7d体温和体重变化；c、d为Gd-HA NPs注射后1d、3d、7d与正常对照组之间的血常规和血生化检测结果；e、f为Gd-HA NPs注射后1d、3d、7d与正常对照组之间心肝肺肾、血尿粪的Gd(III)离子浓度代谢情况。
图7为建立体外细胞模型，分析靶向纳米磁共振造影剂对各细胞系的生存率的影响示意图，即MTT细胞活性检测图；体外实验4组细胞系在不同Gd(III)浓度下的细胞活性程度其中，a-d分别为L929、HUVEC、MC3T3和ATDC5细胞系。
图8为靶向纳米磁共振对比剂体内各主要器官的毒性研究；小鼠Gd-HA NPs注射后1d、3d、7d与正常对照组的心肝脾肺肾组织切片。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进一步说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进，这些都属于本发明的保护范围。
实施例1：靶向纳米磁共振造影剂的制备与理化表征
a.取200mg分子量为990,000Da透明质酸HA(0.5mM)充分溶解于50ml试管中，加入20mL双蒸水，室温下搅拌1h至澄清透明，加入1％(2-3mg)5羧基荧光素(5-FAM SE)搅拌1-2h；在600μL二甲亚砜中加入90mg的二亚乙基三胺五乙酸二酐(0.25mM)进行溶解，室温下搅拌2-3h；加入105mg六水合氯化钆(0.25mM)，搅拌0.5h，将反应溶液加入截留分子量为30000的透析袋中，在双蒸水中进行透析24h-48h，注意使用锡箔纸避光保护，最终配置成14.26mmol/L的溶液A：其中二亚乙基三胺五乙酸二酐、透明质酸、六水合氯化钆和5-羧基荧光素的分别质量比为：1：1：0.8：0.8；
b.将溶液进行冷冻干燥处理，生成纳米颗粒Gd-HA NPs，得到产物即为纳米级透明质酸修饰的含钆Gd(III)造影剂；
将纳米造影剂溶解于无水乙醇中，超声15-20min，12000rpm，获得水分散纳米粒；
靶向纳米磁共振造影剂的表征：采用透射电子显微镜观察粒子形态，运用傅里叶变换红外光谱进行分析结合产物，结果如图2所示，Gd-HA NPs形状规则圆整，呈分散的单球雪花状，平均粒径为50nm。傅里叶变换红外光谱分析得出HA的特征峰分别位于1613和1567cm-1，Gd-DTPA的吸收峰在1633cm-1附近，Gd-DTPA-HA展示出HA和Gd-DTPA的特征峰。Gd-DTPA的峰；C-N和N-H的震动强度增加，Gd-DTPA-HA的峰转换到1591和1024cm-1。
实施例2：靶向纳米磁共振造影剂体外弛豫率研究
取适量纳米磁共振造影剂溶液样品，用双蒸水配置不同浓度的HA-DTPA-Gd NPs溶液，Gd(III)浓度0.0005–0.06mM，分别置于2ml离心管内。再分别配置相应钆浓度的DTPA-Gd作对照。各管按顺序放在塑料试管架上，然后放在装满水的盒子里。运用临床3.0T MRsystem(Discovery MR750，GE Medical System，USA)及配套动物线圈进行T1 Map序列扫描，评价负性强化效果。采用GE Function Tool 4.6专用软件对T1 Map图进行后处理。
磁敏感如图3a所示，与对照组比较，随着钆离子浓度的逐渐增加，T1逐渐升高。经过测定与计算，T1吃鱼时间与造影剂浓度呈良好的线性关系，随着造影剂浓度的增加，相应线性曲线的斜率逐渐增加。以上两组溶液中不同Gd(III)浓度和响应呢1/T1作散点图。如图3b-d所示，Gd-HA NPs线性回归方程为：y＝＝12.51x+0.4725(R2＝0.9850，P<0.05)，其T1弛豫率12.51mM-1·s-1；Gd-DTPA-HA线性回归方程为：y＝8.37x+0.4857(R2＝0.9932，P<0.05),其T1弛豫率8.37mM-1·s-1；Gd-DTPA线性回归方程为：y＝3.72x+0.5578(R2＝0.8953，P<0.05)，其T1弛豫率3.72mM-1·s-1。
实施例3：靶向纳米磁共振造影剂体内信噪比变化研究。
将Gd-HA-NPs、Gd-DTPA-HA和Gd-DTPA分别注射如兔膝关节软骨损伤模型。注射后，用配有兔膝线圈的西门子Verio 3T磁共振成像系统对膝关节进行成像。
如图4a、b两组造影剂注射前关节软骨(红色虚线)及损伤区(蓝色虚线)均未清晰可见。Gd-DTPA关节内注射1h后，整个关节腔的信号强度增加，但病变图像仅轻微增强，软骨轮廓仍不清楚。注射后2h和3h，软骨和损伤部位的信号强度保持非常接近。注射后1h，Gd-DTPA-HA组和Gd-HA-NP组的软骨和损伤部位出现了信号强度增加。注射后2h，软骨和病变的MRI信号明显增强。注射后3h的MRI信号强度略有下降，表明造影剂开始代谢。
根据软骨和损伤部位的T1加权MRI图像确定了SNR值。与Gd-DTPA-HA和Gd-DTPA组相比，Gd-HA-NP组在损伤部位表现出显著更高的ΔSNR量级(图4c、d)。Gd-DTPA组测得的ΔSNR值在1.3左右波动，表明这些病变产生的信号受临床应用Gd-DTPA的影响较小。注射Gd-HA NPs后2h，病灶的ΔSNR显著增加2.3倍，注射后3h仍明显高于Gd-DTPA-HA组和Gd-DTPA组。此外，NPs还增强了获得的软骨图像，而Gd-HA-NP组的ΔSNR值非常接近Gd-DTPA-HA组(图4e、f)。因此，合成的Gd-HA-NPs比其它两种造影剂对软骨损伤更敏感，可以增强MRI对软骨损伤的检测。
实施例4：靶向纳米磁共振造影剂软骨切片的病理组织学和荧光素分布研究
注射5-羧基荧光素标记的Gd-DTPA-HA后2h，仅在软骨表面观察到绿色荧光(图5a)；相反，在5-FAM标记的Gd-HA-NP组，在整个软骨厚度上检测到强荧光。值得注意的是，Gd-HA NPs组即使在软骨陷窝处也能观察到荧光，提示Gd-HA-NPs可以穿透软骨深度以提高MR成像质量。此外，注射后对软骨进行H&E、Safranin O-fast和PAS染色。与健康对照组相比，H&E和Safranin O-fast染色结果显示，Gd-DPTA-HA和Gd-HA NPs组的软骨在暴露于造影剂后均未损伤或有炎症反应(图5c、5d)；同时，由于糖蛋白或其它结构蛋白的低聚糖的存在，软骨在PAS染色后变成紫红色，表明Gd-HA NPs对软骨结构或组成没有任何不利影响(图5e)；上述结果表明，合成的NPs可作为一种有效的MRI造影剂，用于活体软骨损伤的检测。
实施例5：纳米磁共振造影剂体外细胞系毒性研究
MTT细胞活性检测：取对数期生长状态的细胞系L929、HUVEC、MC3T3和ATDC5，以1×103/孔的密度接种于96孔培养板内，每孔200μl培养液，置于37℃、含5％CO2、湿度>95％培养箱中培养24h，待细胞近于融合时，弃去培养液，加入不同浓度Gd-HA NPs，PBS洗两遍，每孔加入MTT溶液(0.05％)200μL,37℃继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养液，每孔加入150μL DMSO，振荡10min，使甲臜充分溶解。比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值。
MTT细胞活性检测结果显示不同浓度(0,0.01,0.02,0.05,0.1,0.2,和0.4mM)的纳米磁共振造影剂对四组细胞系L929、HUVEC、MC3T3和ATDC5增殖无明显抑制效应，细胞毒性低，如图7所示。
实施例6：纳米磁共振造影剂体内毒性研究
正常对照组、1天组、3天组、7天组小鼠共4组，关节腔注射纳米造影剂，将四组小鼠进行体重、体温、血尿粪、血生化、血常规监测；心肝脾肺肾组织进行王水溶解，分别进行电感耦合等离子体-质谱法测定Gd(III)含量。
体内实验结果显示该NPs造影剂对小鼠生长、血液系统和主要脏器功能无毒副反应；首先由肾脏和肝脏代谢，然后随尿液排出体外，具有良好的生物安全性。
实施例7：体内各重要脏器组织切片
分别建立正常对照组、1天组、3天组、7天组小鼠共4组，关节腔注射纳米造影剂，将四组小鼠的心肝脾肺肾分别进行H&E染色切片。
H&E染色切片结果如图8显示，小鼠心肝脾肺肾微观结构无显著细胞毒性和结构损害。
以上对本发明的具体实施例进行了描述，需要理解的事，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
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