小鼠双染透明骨骼塑封包埋标本制作方法
阅读说明：本技术 小鼠双染透明骨骼塑封包埋标本制作方法 (Method for manufacturing mouse double-dyeing transparent skeleton plastic package embedding specimen ) 是由 李雁羽 王磊 刘天润 吴启 徐莉 于 2021-08-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了小鼠双染透明骨骼塑封包埋标本制作方法,依次包括材料准备、梯度乙醇脱水固定、丙酮脱脂、混合染色剂染色、复水、预透明、脱色、梯度甘油透明处理、塑化、UV胶包埋,最终获得小鼠双染透明骨骼塑化染色包埋标本。本发明同传统的透明骨骼标本相比,这种标本采取先塑化后包埋的解决方案,有效地解决了传统透明骨骼标本必须保存在灌注甘油的容器之中,不易于携带和展示且会发生脱色的问题。采用本方法制作出的小鼠透明骨骼塑化包埋标本兼具透明骨骼标本,塑化标本,包埋标本三者之长,便于展示,携带,保存,运输。(The invention discloses a method for manufacturing a mouse double-dyed transparent skeleton plastic package embedded specimen, which sequentially comprises the steps of material preparation, gradient ethanol dehydration and fixation, acetone degreasing, mixed coloring agent dyeing, rehydration, pre-transparence, decoloration, gradient glycerol transparency treatment, plasticization and UV (ultraviolet) glue embedding, and finally the mouse double-dyed transparent skeleton plastic package embedded specimen is obtained. Compared with the traditional transparent bone specimen, the specimen adopts the solution of plasticizing and embedding, and effectively solves the problems that the traditional transparent bone specimen is required to be stored in a container filled with glycerol, is not easy to carry and display and can be decolorized. The mouse transparent skeleton plasticized and embedded specimen manufactured by the method has the advantages of being transparent, plasticized and embedded, and is convenient to display, carry, store and transport.)
技术领域
本发明涉及标本制作技术领域，尤其涉及小鼠双染透明骨骼塑封包埋标本制作方法。
背景技术
动物骨骼标本是自然科普教学的一部分，小鼠的骨骼标本是演示哺乳动物骨骼标本构造的重要教具。传统的展示小鼠骨骼系统的标本有两种，一种是将小鼠的肌肉全部去除殆尽的骨骼标本，另一种是将小鼠的肌肉经过透明化处理之后，使用特异性染色剂进行骨骼染色，而后对标本的肌肉进行脱色处理，凸显出小鼠的骨骼形态以及体内分布。传统的骨骼标本制作过程繁琐，需要组装骨骼，而传统的透明骨骼标本则由于必须保存在甘油里面，不利于展示以及携带，并且在长时间储藏的过程中还有失色，发霉的情况出现，需要定期更换甘油。因此，需要对目前小鼠的骨骼标本制作技术进行改进，使之美观，便携，方便展示，兼具科学性和教育性。我们需要一种新的方法，用来解决小鼠骨骼标本现存的上述问题。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了小鼠双染透明骨骼塑封包埋标本制作方法，可以在保持骨骼系统的完整性的同时，展示小鼠体内硬骨和软骨的分布情况以及小鼠骨骼和肌肉关系，并且制作方法快速，利于生产，制作出的标本便于保存、运输和展示。
本发明提出的小鼠双染透明骨骼塑封包埋标本制作方法，依次包括材料准备、梯度乙醇脱水固定、丙酮脱脂、混合染色剂染色、复水、预透明、脱色、梯度甘油透明处理、塑化、UV胶包埋，最终获得小鼠双染透明骨骼塑化染色包埋标本。
优选地，所述的丙酮梯度乙醇脱水固定步骤为：将经过材料准备步骤的小鼠依次浸泡在浓度梯度从低到高的乙醇中进行脱水固定处理。
优选地，所述的丙酮脱脂步骤为：将经过梯度乙醇脱水固定处理的小鼠从乙醇中取出，浸泡进无水丙酮中，进行脱脂处理，20-28h后把小鼠从无水丙酮中取出，置于水中浸泡10-14h。
优选地，所述的混合染色剂染色步骤为：将经过丙酮脱脂的小鼠用混合染色剂染液浸泡小鼠20-28h，所述的混合染色剂由茜素红原液、阿利新蓝原液、醋酸、75％乙醇溶液依次混合而成的混合物。
优选地，所述茜素红原液、阿利新蓝原液、醋酸、75％乙醇溶液的体积比为1:0.8-1.2:0.8-1.2:16-18。
优选地，所述的茜素红原液是25mg茜素红中和25ml体积浓度为95％的乙醇溶液混合而成的混合物，所述的阿利新蓝原液是75mg阿利新蓝和25ml体积浓度为95％的乙醇溶液混合合成的混合物。
优选地，所述的复水步骤为：将经过混合染色剂染色步骤的小鼠从混合染色剂中取出，依次浸泡于无水乙醇和纯水中各10-14h。
优选地，所述的预透明步骤为：将经过复水步骤的小鼠浸泡于质量分数为2％的氢氧化钾溶液中，停止浸泡的标准为能够透过半透明的小鼠肌肉看见其完整的脊椎，小鼠硬骨呈现淡粉色，软骨为蓝色。
优选地，所述的脱色步骤为：将经过预透明步骤之后的小鼠置于脱色液I中浸泡1-3d，再置于脱色液II中浸泡1-3d。
优选地，所述的透明液I是质量分数为1％的氢氧化钾溶液和纯甘油以体积比1:0.8-1.2的比例均匀混合而成的混合物，所述的透明液II是水和纯甘油以体积比1:0.8-1.2的比例均匀混合而成的混合物。
优选地，所述的梯度甘油透明处理为：将经过脱色步骤的小鼠依次浸入体积分数递增的甘油各1-3d，然后浸入纯甘油浸泡，直至肌肉无色透明，各骨骼结构清晰可见为止。
优选地，所述的塑化步骤为：选择PEG-600作为塑化剂，向质量分数0.5％的氢氧化钾溶液中加入麝香草酚晶体，充分混合，再使用所述的加入了麝香草酚晶体的氢氧化钾溶液和PEG-600按一定比例混合，分别配制成体积浓度为15％、25％、50％、75％、100％的混合物，将小鼠依次放入其中浸泡，其中15％浓度时浸泡1-2d，后续每个梯度的浸泡时间为2-3d，即可使PEG-600完全替换其中的甘油，完成塑化。
优选地，所述的UV胶包埋步骤为：向硅胶模具中倾倒UV胶，待其没过模具底部1cm时停止倾倒，把模具置于紫外线照射环境中，待底层的UV胶固化之后，将经过塑化步骤的小鼠放入模具，调整姿势，再灌注UV胶，直至没过标本1cm左右，把模具置于紫外线照射环境下，待UV胶完全固化之后，把包埋好的标本脱模取出，打磨修整后即可获得小鼠双染透明骨骼塑封包埋标本。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果：
(1)同传统的小鼠骨骼标本相比，这种标本由于不会把骨骼完全拆分，所以避免了重新组装骨骼零件这个繁琐的过程，节省标本制作步骤。并且，由于茜素红与骨骼中的钙会发生特异性结合，阿利新蓝在合适的PH条件下可以和软骨中的硫酸角质素结合，所以这两种染色剂会显著的标识出硬骨和软骨在小鼠体内的分布，而这个功能是传统的小鼠骨骼标本不具备的。
(2)同传统的透明骨骼标本相比，这种标本采取先塑化后包埋的解决方案，有效地解决了传统透明骨骼标本必须保存在灌注甘油的容器之中，不易于携带和展示且会发生脱色的问题。采用本方法制作出的小鼠透明骨骼塑化包埋标本兼具透明骨骼标本，塑化标本，包埋标本三者之长，便于展示，携带，保存，运输。
附图说明
图1为本发明提出的小鼠双染透明骨骼塑封包埋标本的示意图；
图2为本发明提出的小鼠骨骼结构示意图。
具体实施方式
本发明中所涉及的各试剂均为市售。
实施例1
本发明提出的小鼠双染透明骨骼塑封包埋标本制作方法，方法步骤如下：
S1：材料准备：收集出生4d的死亡小白鼠，使用眼科镊小心的剥离小鼠的皮肤组织，为了避免剥离皮肤时，误对小鼠趾端以及尾部的结构造成损伤，可以不剥去四肢末端的皮肤，为了标本整体的美观，可以在这一步提前对肩胛以及颈部的脂肪组织进行剔除，但是要注意不要破坏小鼠骨骼的完整性，然后摘除小鼠的内脏，并且用清水对其进行冲洗；
S2：梯度乙醇脱水固定：将经过材料准备步骤的小鼠依次浸泡进80％、90％、100％三个浓度梯度的乙醇中进行脱水固定处理；
S3：丙酮脱脂：将经过梯度乙醇脱水固定处理的小鼠从乙醇中取出，浸泡进无水丙酮中，进行脱脂处理，24h后把小鼠从无水丙酮中取出，置于水中浸泡12h；
S4：混合染色剂染色：将经过丙酮脱脂的小鼠用混合染色剂染液浸泡小鼠24h，所述的混合染色剂由25mL茜素红原液、25mL阿利新蓝原液、25mL醋酸、425mL体积浓度为75％乙醇溶液依次混合而成的混合物；所述的茜素红原液是25mg茜素红中和25ml体积浓度为95％的乙醇溶液混合而成的混合物，所述的阿利新蓝原液是75mg阿利新蓝和25ml体积浓度为95％的乙醇溶液混合合成的混合物；
S5：复水：将经过混合染色剂染色步骤的小鼠从混合染色剂中取出，依次浸泡于无水乙醇和纯水中各12h；
S6：预透明：将经过复水步骤的小鼠浸泡于质量分数为2％的氢氧化钾溶液中，停止浸泡的标准为能够透过半透明的小鼠肌肉看见其完整的脊椎，小鼠硬骨呈现淡粉色，软骨为蓝色；
S7：脱色：将经过预透明步骤之后的小鼠置于脱色液I中浸泡2d，再置于脱色液II中浸泡2d；
S8：梯度甘油透明处理：将经过脱色步骤的小鼠依次浸入体积分数递增的甘油各2d，然后浸入纯甘油浸泡，直至肌肉无色透明，各骨骼结构清晰可见为止；透明液I是质量分数为1％的氢氧化钾溶液和纯甘油以体积比1:1的比例均匀混合而成的混合物，所述的透明液II是水和纯甘油以体积比1:1的比例均匀混合而成的混合物；
S9：塑化：选择PEG-600作为塑化剂，向质量分数0.5％的氢氧化钾溶液中加入麝香草酚晶体，充分混合，再使用所述的加入了麝香草酚晶体的氢氧化钾溶液和PEG-600按一定比例混合，分别配制成体积浓度为15％、25％、50％、75％、100％的混合物，将小鼠依次放入其中浸泡，其中15％浓度时浸泡2d，后续每个梯度的浸泡时间为3d，即可使PEG-600完全替换其中的甘油，完成塑化；
S10：UV胶包埋：向硅胶模具中倾倒UV胶，待其没过模具底部1cm时停止倾倒，把模具置于紫外线照射环境中，待底层的UV胶固化之后，将经过塑化步骤的小鼠放入模具，调整姿势，再灌注UV胶，直至没过标本1cm左右，把模具置于紫外线照射环境下，待UV胶完全固化之后，把包埋好的标本脱模取出，打磨修整后即可获得小鼠双染透明骨骼塑封包埋标本，所述的硅胶模具是长方体硅胶模具(50×85×50，单位mm)。
实施例2
本发明提出的小鼠双染透明骨骼塑封包埋标本制作方法，方法步骤如下：
S1：材料准备：收集出生4d的死亡小白鼠，使用眼科镊小心的剥离小鼠的皮肤组织，为了避免剥离皮肤时，误对小鼠趾端以及尾部的结构造成损伤，可以不剥去四肢末端的皮肤，为了标本整体的美观，可以在这一步提前对肩胛以及颈部的脂肪组织进行剔除，但是要注意不要破坏小鼠骨骼的完整性，然后摘除小鼠的内脏，并且用清水对其进行冲洗；
S2：梯度乙醇脱水固定：将经过材料准备步骤的小鼠依次浸泡进80％、90％、100％三个浓度梯度的乙醇中进行脱水固定处理；
S3：丙酮脱脂：将经过梯度乙醇脱水固定处理的小鼠从乙醇中取出，浸泡进无水丙酮中，进行脱脂处理，20h后把小鼠从无水丙酮中取出，置于水中浸泡10h；
S4：混合染色剂染色：将经过丙酮脱脂的小鼠用混合染色剂染液浸泡小鼠20h，所述的混合染色剂由25mL茜素红原液、20mL阿利新蓝原液、20mL醋酸、400mL体积分数的75％乙醇溶液依次混合而成的混合物；所述的茜素红原液是25mg茜素红中和25ml体积浓度为95％的乙醇溶液混合而成的混合物，所述的阿利新蓝原液是75mg阿利新蓝和25ml体积浓度为95％的乙醇溶液混合合成的混合物；
S5：复水：将经过混合染色剂染色步骤的小鼠从混合染色剂中取出，依次浸泡于无水乙醇和纯水中各10h；
S6：预透明：将经过复水步骤的小鼠浸泡于质量分数为2％的氢氧化钾溶液中，停止浸泡的标准为能够透过半透明的小鼠肌肉看见其完整的脊椎，小鼠硬骨呈现淡粉色，软骨为蓝色；
S7：脱色：将经过预透明步骤之后的小鼠置于脱色液I中浸泡1d，再置于脱色液II中浸泡1d；
S8：梯度甘油透明处理：将经过脱色步骤的小鼠依次浸入体积分数递增的甘油各1d，然后浸入纯甘油浸泡，直至肌肉无色透明，各骨骼结构清晰可见为止；透明液I是质量分数为1％的氢氧化钾溶液和纯甘油以体积比1:0.8的比例均匀混合而成的混合物，所述的透明液II是水和纯甘油以体积比1:0.8的比例均匀混合而成的混合物；
S9：塑化：选择PEG-600作为塑化剂，向质量分数0.5％的氢氧化钾溶液中加入麝香草酚晶体，充分混合，再使用所述的加入了麝香草酚晶体的氢氧化钾溶液和PEG-600按一定比例混合，分别配制成体积浓度为15％、25％、50％、75％、100％的混合物，将小鼠依次放入其中浸泡，其中15％浓度时浸泡1d，后续每个梯度的浸泡时间为2d，即可使PEG-600完全替换其中的甘油，完成塑化；
S10：UV胶包埋：向硅胶模具中倾倒UV胶，待其没过模具底部1cm时停止倾倒，把模具置于紫外线照射环境中，待底层的UV胶固化之后，将经过塑化步骤的小鼠放入模具，调整姿势，再灌注UV胶，直至没过标本1cm左右，把模具置于紫外线照射环境下，待UV胶完全固化之后，把包埋好的标本脱模取出，打磨修整后即可获得小鼠双染透明骨骼塑封包埋标本，所述的硅胶模具是长方体硅胶模具(50×85×50，单位mm)
实施例3
本发明提出的小鼠双染透明骨骼塑封包埋标本制作方法，方法步骤如下：
S1：材料准备：收集出生4d的死亡小白鼠，使用眼科镊小心的剥离小鼠的皮肤组织，为了避免剥离皮肤时，误对小鼠趾端以及尾部的结构造成损伤，可以不剥去四肢末端的皮肤，为了标本整体的美观，可以在这一步提前对肩胛以及颈部的脂肪组织进行剔除，但是要注意不要破坏小鼠骨骼的完整性，然后摘除小鼠的内脏，并且用清水对其进行冲洗；
S2：梯度乙醇脱水固定：将经过材料准备步骤的小鼠依次浸泡进80％、90％、100％三个浓度梯度的乙醇中进行脱水固定处理；
S3：丙酮脱脂：将经过梯度乙醇脱水固定处理的小鼠从乙醇中取出，浸泡进无水丙酮中，进行脱脂处理，28h后把小鼠从无水丙酮中取出，置于水中浸泡14h；
S4：混合染色剂染色：将经过丙酮脱脂的小鼠用混合染色剂染液浸泡小鼠28h，所述的混合染色剂由25mL茜素红原液、30mL阿利新蓝原液、30mL醋酸、450mL体积分数的75％乙醇溶液依次混合而成的混合物；所述的茜素红原液是25mg茜素红中和25ml体积浓度为95％的乙醇溶液混合而成的混合物，所述的阿利新蓝原液是75mg阿利新蓝和25ml体积浓度为95％的乙醇溶液混合合成的混合物；
S5：复水：将经过混合染色剂染色步骤的小鼠从混合染色剂中取出，依次浸泡于无水乙醇和纯水中各14h；
S6：预透明：将经过复水步骤的小鼠浸泡于质量分数为2％的氢氧化钾溶液中，停止浸泡的标准为能够透过半透明的小鼠肌肉看见其完整的脊椎，小鼠硬骨呈现淡粉色，软骨为蓝色；
S7：脱色：将经过预透明步骤之后的小鼠置于脱色液I中浸泡3d，再置于脱色液II中浸泡3d；
S8：梯度甘油透明处理：将经过脱色步骤的小鼠依次浸入体积分数递增的甘油各3d，然后浸入纯甘油浸泡，直至肌肉无色透明，各骨骼结构清晰可见为止；透明液I是质量分数为1％的氢氧化钾溶液和纯甘油以体积比1:1.2的比例均匀混合而成的混合物，所述的透明液II是水和纯甘油以体积比1:1.2的比例均匀混合而成的混合物；
S9：塑化：选择PEG-600作为塑化剂，向质量分数0.5％的氢氧化钾溶液中加入麝香草酚晶体，充分混合，再使用所述的加入了麝香草酚晶体的氢氧化钾溶液和PEG-600按一定比例混合，分别配制成体积浓度为15％、25％、50％、75％、100％的混合物，将小鼠依次放入其中浸泡，其中15％浓度时浸泡2d，后续每个梯度的浸泡时间为3d，即可使PEG-600完全替换其中的甘油，完成塑化；
S10：UV胶包埋：向硅胶模具中倾倒UV胶，待其没过模具底部1cm时停止倾倒，把模具置于紫外线照射环境中，待底层的UV胶固化之后，将经过塑化步骤的小鼠放入模具，调整姿势，再灌注UV胶，直至没过标本1cm左右，把模具置于紫外线照射环境下，待UV胶完全固化之后，把包埋好的标本脱模取出，打磨修整后即可获得小鼠双染透明骨骼塑封包埋标本，所述的硅胶模具是长方体硅胶模具(50×85×50，单位mm)
图1-2为采用实施例1的方法获得的小鼠双染透明骨骼塑封包埋标本，保证了小鼠骨骼的完整性，显著地标识了小鼠硬骨和软骨的分布。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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