阅读说明：本技术 一种补加竞争性蛋白抑制重组人源胶原蛋白降解的生产工艺 (Production process for inhibiting degradation of recombinant human collagen by supplementing competitive protein ) 是由 殷世清 朱永真 张甲庆 徐靖洋 张凤龙 李艳琪 于 2021-10-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种补加竞争性蛋白抑制重组人源胶原蛋白降解的生产工艺,属于生物工程发酵技术领域,具体是在毕赤酵母发酵的诱导阶段,向发酵液中一次性补加竞争性蛋白来抑制人源胶原蛋白的降解,同时,发酵结束后,要进行升温处理,来灭活发酵液的酶活。本发明的生产工艺可保证胶原蛋白在纯化过程中的稳定性,有效地提高了产量和纯度,本工艺稳定易实现,适合大规模发酵生产。(The invention discloses a production process for inhibiting degradation of recombinant human collagen by supplementing competitive protein, belonging to the technical field of bioengineering fermentation. The production process can ensure the stability of the collagen in the purification process, effectively improve the yield and the purity, is stable and easy to realize, and is suitable for large-scale fermentation production.)

一种补加竞争性蛋白抑制重组人源胶原蛋白降解的生产工艺

技术领域

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本发明属于生物工程发酵技术领域，具体涉及一种通过补加竞争性蛋白的方法来抑制重组人源胶原蛋白降解的生产工艺。

背景技术

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胶原蛋白作为人体内的一种纤维蛋白，占人体蛋白含量的25%-33%，主要存在于皮肤、肌肉、骨骼等处，起到提高皮肤和肌肉弹性，增强钙质与骨细胞结合，保护骨骼健康等作用。

胶原蛋白因此独特的生物特性，可广泛应用于美容、临床医学、食品、化工等领域，随着中国护肤美容与营养保健需求的扩张，胶原蛋白市场需求将迎来持续扩张阶段，同时行业规范程度有待进一步提高。

采用基因工程方法将人源胶原蛋白基因加工后整合到毕赤酵母中，用发酵的方法生产出序列与天然胶原蛋白一致的胶原蛋白产品。与天然胶原不同的是，重组胶原为单链结构，天然胶原为三螺旋结构，从稳定性上讲，重组胶原的稳定性不如天然胶原，所以重组胶原的表达技术难度大，产物容易降解。重组胶原的优点是可以规模化生产、产品稳定、无动物源的病毒污染风险。因此，开发一种发酵过程中，抑制重组人源胶原蛋白降解的方法是一项非常有意义的事。

发明内容

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本发明的目的是提供一种补加竞争性蛋白抑制重组人源胶原蛋白降解的生产工艺。通过在毕赤酵母发酵的诱导阶段，向发酵液中补加竞争性蛋白，来竞争性地结合蛋白酶，减少蛋白酶对人源胶原蛋白的降解，提高胶原蛋白的纯度与收得率。

抑制重组人源胶原蛋白降解的工艺包括以下方面：

1）筛选不同的竞争性蛋白

在本发明中，发明人对不同来源与不同种类的蛋白进行了筛选，不同来源的蛋白包括酵母蛋白胨，胰酪蛋白胨，牛骨蛋白胨，鱼蛋白胨，大豆蛋白胨，酸水解酪蛋白等的一种或几种的复合。

2）竞争性蛋白的添加比例

在本发明中，发明人通过对竞争性蛋白的添加比例进行了优选，发现，在毕赤酵母发酵的诱导阶段，向发酵液中添加0.5%-2.5%的竞争性蛋白，能有效的抑制重组人源胶原蛋白的降解，重组人源胶原蛋白的稳定性由不添加竞争性蛋白的35%提高至84%，提高了胶原蛋白的纯度与产量。

3）在发酵结束后，进行升温灭酶

在发酵结束后，对发酵液进行升温，能够提高重组人源胶原蛋白的稳定性，使得在纯化过程中，胶原蛋白一直保持稳定，不再降解，升温灭酶的温度在60-75℃，时间在5-30min。升温结束后，快速降温至25℃。经过此步骤后，重组人源胶原蛋白能在室温条件下（25-30℃）保持24小时的稳定性，在4℃条件下，在48小时内保持稳定。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明创新点在于：在发酵的诱导阶段，向发酵液中加入竞争性蛋白，与发酵液中的蛋白本科竞争性结合，减少蛋白酶对胶原蛋白的降解，提高了胶原蛋白在发酵液中的稳定性，有效地提高了产量和纯度。本工艺稳定易实现，适合大规模发酵生产。

附图说明

附图1是实施例1-6的结果图。

附图2是实施例6不同参数实验组的结果图。

附图3是常规发酵人源胶原蛋白的电泳图。

附图4是实施例6添加竞争性蛋白发酵人源胶原蛋白的电泳图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例 1-6

在重组毕赤酵母诱导完成后，DO>20%，甲醇补料稳定，按15g/L的添加量一次性加入灭菌的竞争性蛋白，之后正常甲醇补料诱导。发酵结束后，进行升温，升温的温度为65℃，时间为30min，升温结束后，迅速降温至25℃。检测重组人源胶原蛋白（包括降解蛋白）的产量，并检测其中全序列目标胶原蛋白的产量量。由此确定重组人源胶原蛋白的稳定性。

在实施例1-6中，选择了酵母蛋白胨，胰酪蛋白胨，牛骨蛋白胨，鱼蛋白胨，大豆蛋白胨，酸水解酪蛋白等几个竞争性蛋白，其结果见附图1。

实施例 7

本实施例对酸水解酪蛋白作为竞争性蛋白进行不同参数的对比研究。

选择实施例6添加酸水解酪蛋白做进一步研究，在不同升温温度和保温时间的目标蛋白产量和蛋白稳定性。根据不同升温的温度和保温时间的组合进行分组实验。

在重组毕赤酵母诱导完成后，DO>20%，甲醇补料稳定，按15g/L的添加量一次性加入灭菌的酸水解酪蛋白，之后正常甲醇补料诱导。发酵结束后，进行升温，升温的温度选择60-75℃，保温时间选择10-30min，升温结束后，迅速降温至25℃。检测重组人源胶原蛋白（包括降解蛋白）的产量，并检测其中全序列目标胶原蛋白的产量，由此确定重组人源胶原蛋白的稳定性，具体结果见附图2。

实施例 8 对照例

本实施例提供一组对比实验，具体是现有技术中常规发酵生产工艺和实施例6的方法进行对比，将两种方法获得的蛋白进行电泳实验。

现有技术生产工艺的常规发酵是在重组毕赤酵母诱导完成后，DO>20%，进行正常甲醇补料诱导。发酵结束后，正常进行提取工艺，重组人源胶原蛋白（包括降解蛋白）的产量达到17.2g/L，其中全序列目标胶原蛋白的量为2.8g/L。重组人源胶原蛋白的稳定性为16.2%，电泳图见附图3和4。