一种海洋生物多肽在制备治疗骨质疏松症药物中的应用
阅读说明：本技术 一种海洋生物多肽在制备治疗骨质疏松症药物中的应用 (Application of marine biological polypeptide in preparation of medicine for treating osteoporosis ) 是由 吴双俊 周鹏 孙晓敏 罗昕迪 霍雪琴 胡晓雪 于 2021-11-25 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种海洋生物多肽在制备治疗骨质疏松症药物中的应用,属于海洋生物学技术领域。本发明所要解决的技术问题是提供一种治疗骨质疏松的新药物。为解决该技术问题,本发明提供了一种可以用于制备骨质疏松药物的海洋多肽,本发明所提供的海洋生物多肽为皱纹蛤多肽,本发明通过实验发现,该多肽能够有效的促进骨髓间充质干细胞的成骨分化,并且可以促进骨髓间充质干细胞的增殖,因此后续可以将该多肽用于制备治疗骨质疏松的药物。(The invention provides application of marine biological polypeptide in preparing a medicine for treating osteoporosis, and belongs to the technical field of marine biology. The invention aims to solve the technical problem of providing a new medicament for treating osteoporosis. In order to solve the technical problem, the invention provides a marine polypeptide for preparing an osteoporosis medicine, the marine polypeptide provided by the invention is a wrinkle clam polypeptide, and experiments show that the polypeptide can effectively promote osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells and can promote proliferation of the bone marrow mesenchymal stem cells, so that the polypeptide can be subsequently used for preparing the medicine for treating osteoporosis.)
技术领域
本发明属于海洋生物学技术领域，尤其涉及一种海洋生物多肽在制备治疗骨质疏松症药物中的应用。
背景技术
骨质疏松症是一种以骨量持续丢失，骨代谢加快和容易发生骨折为特征的疾病。目前，骨质疏松症的主要治疗方式依然是以药物治疗为主，这种治疗方式不仅会花费高，而且患者需要长时间的治疗。同时，在治疗的过程中，药物会产生毒副作用，导致治疗效果不理想，因此，目前需要寻找新的治疗方式。
骨髓间充质干细胞的功能紊乱是骨质疏松的发病机制之一。骨髓间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，其可以向着骨，软骨或脂肪分化，因此，其是骨组织工程中常用的一种种子细胞。当骨髓间充质干细胞的成骨和成脂分化发生失衡，骨髓间充质干细胞成骨分化较少时，会导致骨髓内的脂肪含量增加，进而导致骨吸收增加，导致发生骨质疏松。因此，有效的促进骨髓间充质干细胞的成骨转化有助于实现骨质疏松的治疗。
皱纹蛤是帘蛤科皱纹蛤属的一种动物，目前，关于皱纹蛤多肽在骨髓间充质干细胞成骨分化中的功能尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以有效促进骨髓间充质干细胞成骨分化的海洋生物多肽，从而进一步将其用于制备治疗骨质疏松的药物。
为了实现上述的目的，本发明提供了如下的技术方案：
其一，本发明提供了一种皱纹蛤多肽在制备骨质疏松药物中的应用。
优选地，所述皱纹蛤多肽的制备方法包括如下步骤：
（1）将皱纹蛤清洗干净后，取皱纹蛤肉烘干，将烘干后的皱纹蛤肉放入粉碎机中粉碎，得到皱纹蛤肉粉末；
（2）将皱纹蛤肉粉末置于容器中，加入5倍粉末质量的蒸馏水混合均匀，调节PH为8后，加入0.5%倍溶液质量的胰蛋白酶，37℃水浴酶解6h；
（3）酶解结束后，升温至100℃，加热20min进行灭酶；
（4）离心收集上清后，用3000Da的超滤膜进行过滤，收集透过液，冷冻干燥得到皱纹蛤多肽。
其二，本发明提供了一种皱纹蛤多肽在制备骨髓间充质干细胞成骨分化增强药物中的应用。
优选地，所述皱纹蛤多肽的制备方法包括如下步骤：
（1）将皱纹蛤清洗干净后，取皱纹蛤肉烘干，将烘干后的皱纹蛤肉放入粉碎机中粉碎，得到皱纹蛤肉粉末；
（2）将皱纹蛤肉粉末置于容器中，加入5倍粉末质量的蒸馏水混合均匀，调节PH为8后，加入0.5%倍溶液质量的胰蛋白酶，37℃水浴酶解6h；
（3）酶解结束后，升温至100℃，加热20min进行灭酶；
（4）离心收集上清后，用3000Da的超滤膜进行过滤，收集透过液，冷冻干燥得到皱纹蛤多肽。
其三，本发明提供了一种皱纹蛤多肽在制备骨髓间充质干细胞成骨分化促进因子RUNX2蛋白表达增强药物中的应用。
优选地，所述皱纹蛤多肽的制备方法包括如下步骤：
（1）将皱纹蛤清洗干净后，取皱纹蛤肉烘干，将烘干后的皱纹蛤肉放入粉碎机中粉碎，得到皱纹蛤肉粉末；
（2）将皱纹蛤肉粉末置于容器中，加入5倍粉末质量的蒸馏水混合均匀，调节PH为8后，加入0.5%倍溶液质量的胰蛋白酶，37℃水浴酶解6h；
（3）酶解结束后，升温至100℃，加热20min进行灭酶；
（4）离心收集上清后，用3000Da的超滤膜进行过滤，收集透过液，冷冻干燥得到皱纹蛤多肽。
其四，本发明提供了一种皱纹蛤多肽在制备骨髓间充质干细胞ALP酶活性增强药物中的应用。
其五，本发明提供了一种皱纹蛤多肽在制备骨髓间充质干细胞的细胞钙化增强药物中的应用。
其六，本发明提供了一种皱纹蛤多肽在制备骨髓间充质干细胞的增殖增强药物中的应用。
优选地，所述皱纹蛤多肽的制备方法包括如下步骤：
（1）将皱纹蛤清洗干净后，取皱纹蛤肉烘干，将烘干后的皱纹蛤肉放入粉碎机中粉碎，得到皱纹蛤肉粉末；
（2）将皱纹蛤肉粉末置于容器中，加入5倍粉末质量的蒸馏水混合均匀，调节PH为8后，加入0.5%倍溶液质量的胰蛋白酶，37℃水浴酶解6h；
（3）酶解结束后，升温至100℃，加热20min进行灭酶；
（4）离心收集上清后，用3000Da的超滤膜进行过滤，收集透过液，冷冻干燥得到皱纹蛤多肽。
本发明的有益效果是：
本发明制备了一种皱纹蛤多肽，并且通过实验发现，本发明所制备的皱纹蛤多肽能够有效的促进骨髓间充质干细胞的成骨分化促进因子RUNX2的蛋白表达，并且可以有效的促进骨髓间充质干细胞的ALP酶活性和细胞钙化水平，同时，其可以有效的促进骨髓间充质干细胞的增殖。因此可以将本发明所制备的皱纹蛤多肽用于制备骨髓间充质干细胞成骨分化的促进药物，并进一步用于治疗骨质疏松。
附图说明
图1为皱纹蛤多肽对于骨髓间充质干细胞成骨分化促进因子RUNX2的蛋白表达的促进作用；
图2为碱性磷酸酶染色的实验结果；
图3为茜素红染色的实验结果；
图4为皱纹蛤多肽对于骨髓间充质干细胞增殖的促进作用。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。
实施例1
（1）将皱纹蛤清洗干净后，取皱纹蛤肉烘干，将烘干后的皱纹蛤肉放入粉碎机中粉碎，得到皱纹蛤肉粉末；
（2）将100g皱纹蛤肉粉末置于容器中，加入500g的蒸馏水混合均匀，调节PH为8后，加入3g的胰蛋白酶，37℃水浴酶解6h；
（3）酶解结束后，升温至100℃，加热20min进行灭酶；
（4）离心收集上清后，用3000Da的超滤膜进行过滤，收集透过液，冷冻干燥得到皱纹蛤多肽。
实施例2
皱纹蛤多肽对于成骨分化过程中RUNX2蛋白的调控作用
（1）将生长状态良好的1.5×104的P3代人骨髓间充质干细胞接种于6孔板中；
（2）待细胞密度达到80%时，对照组：采用完全培养基培养，实验组1：成骨分化培养基培养，实验组2:添加有250ug/ml皱纹蛤多肽的成骨分化培养基培养；实验组3：添加有500ug/ml皱纹蛤多肽的成骨分化培养基培养；
（3）培养7天后，去除培养基，加入细胞裂解液，使用细胞刮刀将细胞刮下，之后将裂解液收集至EP管中；
（4）裂解30min之后，置于离心机中离心收集上清，测量蛋白浓度后，制成蛋白样品；
（5）配置浓缩胶和分裂胶，进行蛋白样品上样，恒压80V至溴酚蓝到达分离胶，之后调整为120V直至电泳结束；
（5）将PVDF膜置于甲醇中浸泡15s，活化后进行电转夹安装，调整电源为恒流250mA1.5h；
（6）电转结束后将PVDF膜取出置于5%脱脂奶粉中，封闭1h；
（7）封闭结束后孵育RUNX2和GAPDH一抗， 4℃孵育过夜，孵育结束后，TBST清洗PVDF膜3次，每次10min；
（8）之后，孵育相应的二抗，室温下孵育1h后，使用TBST清洗PVDF膜3次，每次10min；
（9）避光条件下，对PVDF膜进行显影。
实验所得到的结果如图1所示，可以看出，添加皱纹蛤多肽后，在人骨髓间充质干细胞的成骨分化过程中，成骨分化促进因子RUNX2的蛋白表达水平明显提高，说明本发明所提供的皱纹蛤多肽可以有效的促进RUNX2的蛋白表达。
实施例2
皱纹蛤多肽对于成骨分化过程中ALP酶活性的调控
（1）将生长状态良好的1.5×104的P3代骨髓间充质干细胞接种于6孔板中；
（2）待细胞密度达到80%时，对照组添加成骨分化培养基培养，实验组添加有500ug/ml皱纹蛤多肽的成骨分化培养基培养，每2-3天进行一次换液，每组设置有3个重复；
（3）培养7天后，将培养基去除，使用PBS轻轻的清洗细胞，加入4%多聚甲醛固定细胞，固定时间为30min；
（4）去除多聚甲醛，使用PBS清洗细胞，参照碱性磷酸酶试剂盒说明书处理细胞；
（5）处理结束后，进行拍照。
实验所得到的结果如图2所示，从中可以看出，实验组中ALP染色的程度要显著的高于对照组，该结果说明本发明所制备的皱纹蛤多肽可以有效的促进骨髓间充质干细胞中ALP酶的活性。
实施例3
皱纹蛤多肽对于成骨分化过程中细胞钙化的调控
（1）将生长状态良好的1.5×104的P3代骨髓间充质干细胞接种于6孔板中；
（2）待细胞密度达到80%时，对照组添加成骨分化培养基培养，实验组添加有500ug/ml皱纹蛤多肽的成骨分化培养基培养，每2-3天进行一次换液，每组设置有3个重复；
（3）培养7天后，将培养基去除，使用PBS轻轻的清洗细胞，加入4%多聚甲醛固定细胞，固定时间为30min；
（4）去除多聚甲醛，使用PBS清洗细胞，使用茜素红染色液室温避光孵育30min；
（6）去除茜素红染色液，使用PBS清洗细胞2次，进行拍照。
实验所得到的结果如图3所示，从中可以看出，实验组的细胞矿化结节的说明明显多于对照组，该结果说明本发明所制备的皱纹蛤多肽可以有效的促进骨髓间充质干细胞的钙化。
实施例4
（1）将生长状态良好P3代骨髓间充质干细胞制成的1×104/ml的单细胞悬液，每孔接入100ul，设置3个复孔；
（2）接种后，放入细胞培养箱中，24h后进行换液，对照组添加完全培养基培养，实验组添加有500ug/ml皱纹蛤多肽的完全培养基培养基；
（3）分别在培养1,3,5天取出，每孔加入10ul CCK-8，置于细胞培养箱中继续孵育4h；
（4）孵育结束后，使用酶联免疫检测仪测定各组的OD平均值，检测波长为450nm。
实验得到的结果如图4所示，从图中可以看出，在培养3d和5d时，实验组的OD值显著高于对照组，且差异具有统计学意义，该结果说明添加皱纹蛤多肽能够有效的促进骨髓间充质干细胞的增殖能力。
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