基于苯并咪唑的多功能溶酶体pH探针及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 基于苯并咪唑的多功能溶酶体pH探针及其制备方法和应用 (Benzimidazole-based multifunctional lysosome pH probe and preparation method and application thereof ) 是由 文朝朝 梁文婷 董川 双少敏 于 2021-09-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于苯并咪唑的多功能溶酶体pH探针及其制备方法和应用,本发明的探针制备流程简单,仅需将2-甲基苯并咪唑在三甲基氯硅烷的保护下与对二甲氨基苯甲醛高温封管反应12-24小时,再对产物进行简单的分离纯化即可制得。该探针在pH2.5-7.0之间具有良好的比率型荧光特性,其pKa值为4.74,且对溶酶体具有高度靶向性,因此特别适合用于检测细胞溶酶体的pH值。此外,该探针还具有H～(+)选择性好、光稳定性好、可逆性好、斯托克斯位移大等优势。将其应用于对溶酶体自噬等细胞活动的监测中时,表现出了良好的生物相容性以及高灵敏度的实时原位监测能力。(The invention discloses a benzimidazole-based multifunctional lysosome pH probe and a preparation method and application thereof, the probe is simple in preparation process, and can be prepared by reacting 2-methylbenzimidazole with p-dimethylaminobenzaldehyde for 12-24 hours at a high temperature in a tube-sealing manner under the protection of trimethylchlorosilane and then simply separating and purifying the product. The probe has good ratio type fluorescence characteristics at pH2.5-7.0, the pKa value of the probe is 4.74, and the probe has high targeting property to lysosomes, so the probe is particularly suitable for detecting the pH value of cell lysosomes. In addition, the probe also has H + Good selectivity, good light stability, good reversibility, large Stokes displacement and the like. When the protein is applied to monitoring cell activities such as lysosome autophagy and the like, the protein shows good biocompatibility and high degree of biocompatibilityReal-time in-situ monitoring capability of sensitivity.)
技术领域
本发明涉及荧光探针，具体属于一种基于苯并咪唑的多功能溶酶体pH探针及其制备方法，以及该探针在监测溶酶体pH改变和自噬进程中的应用。
背景技术
pH的稳定是机体微环境稳态的重要指标，包括癌症、糖尿病、心梗在内的许多疾病都会导致组织或细胞微环境酸碱度的改变，或是由于pH的改变导致并发症的发生。因此，对细胞微环境pH的实时监测就成为了疾病分子诊断领域的一大研究热点。近年来，针对亚细胞结构的靶向探针受到了研究者们的青睐，这其中包括对溶酶体、线粒体、高尔基体等细胞器靶向探针的开发和应用。
由于不同细胞器的酸性不同，因此针对特定细胞器的pH荧光探针需要具备独特的pH检测范围。例如溶酶体的pH约为4.7，因此这类荧光探针的检测范围至少应为pH3-6。而当检测如线粒体、高尔基体、内质网等酸性较弱或偏碱性的细胞器时，检测范围也应适当改变。此外，对特定细胞器进行pH检测时，应当具备一定的细胞器靶向能力。就溶酶体靶向探针而言，目前的研究用到的靶向基团有吗啉、咪唑基、二甲氨基等。在小分子探针的设计中引入一种或多种确定的溶酶体靶向单元，将赋予探针强有力的溶酶体靶向能力。
对于溶酶体的pH值在细胞自噬过程中的变化一直是人们所关注的生理现象。细胞自噬作为一种细胞自我保护的程序性机制，在细胞受到如缺氧、过氧化物刺激、能量供应不足等应激压力时会激发对损伤的应激反应。细胞自噬现象广泛存在于多种疾病，且近来在分子治疗领域兴起了通过细胞自噬进行癌症等疾病治疗的热潮。由于传统方法，例如透射电镜法，免疫荧光法，蛋白质印迹法等存在着效率较低、成本偏高、非实时观察等弊端，所以通过探针来监测细胞自噬发生的优势就很明显。但是目前，可以将适宜的pH检测范围、高溶酶体靶向性、低毒性、良好的光学性能以及灵敏的比率荧光成像能力等优势集于一体的pH荧光探针十分匮乏，而真正能够应用于对溶酶体自噬实时监测的探针更如凤毛麟角。因此，开发出这样一种探针对于溶酶体自噬监测领域来说将是众望所归的。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种基于苯并咪唑的多功能溶酶体pH探针，该探针在pH2.5-7.0范围内具有比率荧光特性；目的之二是提供该探针的制备方法，该方法流程简单、操作便捷、成本低廉；目的之三是提供该探针在细胞溶酶体靶向比率成像和实时监测溶酶体自噬中的应用。
本发明所提供的基于苯并咪唑的多功能溶酶体pH探针，其结构式为：
本发明提供的一种基于苯并咪唑的多功能溶酶体pH探针的制备方法，其合成路线如下：
其制备方法包括以下步骤：
(1)对二甲氨基苯甲醛与2-甲基苯并咪唑以摩尔比1.2-1.5:1在少量N,N-二甲基甲酰胺中混合。加入10-15个当量的三甲基氯硅烷后，混合物在110-120℃的条件下于厚壁耐压瓶中搅拌回流反应12-24小时；反应完成后，向溶液中加入饱和碳酸钠的水溶液，调节pH至8-10，继续搅拌20-30分钟；
(2)上一步的反应产物用二氯甲烷进行萃取，使用饱和氯化钠的水溶液冲洗有机相3-5次，直至水相变为无色，再向有机相中投入无水硫酸钠进行除水，并减压干燥；粗产物通过硅胶柱色谱提纯，洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯＝3:1，纯品呈亮黄色。
步骤(1)中所述的对二甲氨基苯甲醛与2-甲基苯并咪唑的摩尔比为1.2:1。
本发明的探针可在制备细胞溶酶体靶向比率成像试剂中应用，所述的细胞溶酶体靶向比率成像的pH值优选在4.0-6.5。本发明的探针还可在细胞溶酶体自噬实时监测中应用。
本发明的探针是将苯并咪唑与二甲基苯胺通过乙烯桥相连后形成了D-π-A“推-拉”共轭体系。该探针呈现出典型的分子内电荷转移(ICT)行为，苯并咪唑的内亚胺结构与H+结合后，增加了电荷从二甲苯胺向苯并咪唑的迁移，从而形成了光谱红移的现象，出现了比率荧光特性。
与现有的同类型荧光探针相比，本发明的探针具有以下明显的优点：(1)采用厚壁耐压瓶进行密封反应，可减少溶剂的使用和有害气体的释放，是一种环境友好型合成方案；(2)该探针的吸收光谱和荧光光谱均表现出比率特性，因此该探针不仅可进行比率荧光的应用，还能用于比率吸收的应用；(3)该探针的Stokes位移达130nm，这使得该探针的光漂白现象大大减轻，荧光分辨率大大提高；(4)该探针在pH2.5、4.7、7.0时均可表现出良好的H+选择性和光稳定性，且可逆性良好；(5)该探针的pKa值为4.74，且在pH4.06-5.20范围内呈现出比率信号与pH值的良好线性关系，因此该探针非常适合被用于监测溶酶体的pH；(6)该探针具有咪唑基、二甲氨基双重溶酶体靶向基团，表现出了良好的溶酶体靶向性能；(7)该探针具有良好的生物相容性；(8)该探针可根据正常细胞和癌细胞的溶酶体酸性不同，对细胞进行鉴别和区分；(9)该探针可对药物诱导的溶酶体pH变化进行快速检测；(10)该探针可对饥饿诱导的溶酶体自噬行为进行原位实时监测。
附图说明
图1为本发明实施例1中探针在pH7.0-2.5的溶液中的吸收光谱变化。
图2为本发明实施例1中探针在pH7.0、4.5、2.5的溶液中日光灯下的颜色对比。
图3为本发明实施例1中探针在pH7.0-2.5的溶液中的荧光光谱变化。
图4为本发明实施例1中探针在pH7.0、4.5、2.5的溶液中紫外灯下的颜色对比。
图5为本发明实施例1中探针的荧光强度比值(F487nm/F534nm)与pH关系的拟合曲线。
图6为本发明实施例1中探针的荧光强度比值(F487nm/F534nm)在pH4.06-5.20范围内与pH的线性关系。
图7为本发明实施例1中探针在30种干扰物的存在下对H+的选择性。
图8为本发明实施例1中探针在120分钟内于不同pH溶液中的光稳定性。
图9为本发明实施例1中探针在5次7.0-2.5的酸碱滴定循环中的可逆性。
图10为本发明实施例1中探针与市售溶酶体标记物的荧光共定位结果。
图11为本发明实施例1中探针与不同pH值的SNU-423细胞共孵育后的共聚焦成像图。
图12为本发明实施例1中探针与SNU-423及HL-7702细胞共孵育后的共聚焦成像图。
图13为本发明实施例1中探针与SNU-423细胞共孵育后经不同药物处理的共聚焦成像图。
图14为本发明实施例1中探针与SNU-423细胞共孵育后经饥饿诱导产生自噬后的共聚焦成像图。
具体实施方式
实施例1
(1)将0.53g(3.6mmol)的对二甲氨基苯甲醛和0.40g(3.0mmol)的2-甲基苯并咪唑加入厚壁耐压瓶中以少量N,N-二甲基甲酰胺完全溶解，再滴加2mL三甲基氯硅烷，在110℃油浴中搅拌，密封回流反应24h。
(2)反应结束后待冷却到室温，向溶液中加入饱和碳酸钠的水溶液，调节pH至10，继续搅拌30min。反应产物用二氯甲烷进行萃取，使用饱和氯化钠的水溶液冲洗有机相3次，再向有机相中投入无水硫酸钠进行除水。减压蒸馏除去溶剂后得到粗品。
(3)通过硅胶柱色谱对粗产物进行提纯，洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯＝3:1，洗脱完成后蒸干溶剂，得到亮黄色纯品。
实施例2
将实施例1中的探针溶解于DMSO中配制成储备液，进行光谱测量时，用超纯水将储备液稀释至10μM。以光程为1cm的石英比色皿进行测定，通过添加极少量的0.1mol/L的盐酸或氢氧化钠使溶液的pH产生微小的变化，对不同pH环境下探针的吸收光谱进行测定。如图1，滴定使溶液pH从7.0变到2.5，354nm处的吸收强度在逐渐降低，而405nm处的吸收强度却逐渐升高。这些吸收峰在378nm处形成一个等吸收点。图2为pH7.0、4.5、2.5时的溶液图像，颜色由淡黄色变为无色。
实施例3
用超纯水将实施例2中的探针储备液稀释至10μM，并使用0.1mol/L的盐酸或氢氧化钠滴定并测定荧光发射光谱(图3)。随着溶液中氢离子的逐渐增多，波长487nm处的荧光信号不断减弱，波长534nm的强度不断增强，这些荧光曲线同样相交于一点，其波长为510nm。图4为pH7.0、4.5、2.5时溶液在紫外灯下的图像，颜色为蓝色、青色和绿色。根据荧光光谱数据，对487nm与534nm处的荧光比值和pH值进行曲线拟合(图5)，认为探针的pKa值为4.74。其中，荧光比值在4.06-5.20范围内与pH具有良好的线性关系(图6)，线性方程为：荧光强度比值(F487nm/F534nm)＝-6.16194+1.54819·pH(R2＝0.95756)。
实施例4
通过向实施例1中的探针溶液中加入少量干扰物来检测探针对H+的选择性，选择了30种不同的干扰物进行评估，分别为(1)对照；(2)Na+(10mM))；(3)K+(10mM)；(4)Mg2+(10mM)；(5)Cd2+(0.5mM)；(6)Ca2+(0.5mM)；(7)Co2+(0.5mM)；(8)Ba2+(0.5mM)；(9)Cu2+(0.5mM)；(10)Zn2+(0.5mM)；(11)Fe3+(0.5mM)；(12)Al3+(0.5mM)；(13)NH4+(0.5mM)；(14)氯喹(0.5mM)；(15)过氧化氢(0.5mM)；(16)N-乙酰半胱氨酸(0.5mM)；(17)谷氨酸(0.5mM)；(18)亮氨酸(0.5mM)；(19)缬氨酸(0.5mM)；(20)丝氨酸(0.5mM)；(21)半胱氨酸(0.5mM)；(22)天冬氨酸(0.5mM)；(23)苯丙氨酸(0.5mM)；(24)维生素C(0.5mM)；(25)Cl-(100mM)；(26)SO4 2-(10mM)；(27)NO3 -(0.5mM)；(28)PO4 3-(0.5mM)；(29)CO3 2-(0.5mM)；(30)C2H3O2-(0.5mM)。如图7所示，探针在pH2.5、4.7、7.0的溶液中均能够保持可忽略变化的荧光信号，表明探针对H+的选择性很好。实施方案中激发波长为380nm。
实施例5
考察实施例1中探针的光稳定性，对不同pH溶液(2.5、4.7、7.0)中探针荧光强度连续监测2小时。如图8所示，溶液中的荧光信号在两小时内虽然微有波动，但是在整体上较为稳定，表明光稳定性很好。同时考察该探针的可逆性，通过酸碱滴定的方式使溶液pH值在7.0和2.5之间转变，并记录荧光信号(图9)。在5个循环滴定测试过程中始终能够释放出较为稳定的荧光信号，表明可逆性良好。实施方案中激发波长为380nm。
实施例6
考察实施例1中探针的溶酶体靶向能力。将贴壁的人源肝癌细胞SNU-423与50nmol/L市售溶酶体标记物和10μmol/L实施例1中的探针共孵育20分钟，并对标记位置进行荧光共定位测试。其中，溶酶体标记物的激发波长为552nm，收集560-620nm荧光信号，探针的激发波长为408nm，收集510-560nm荧光信号。结果如图10所示，(a)为探针的荧光图，(b)为溶酶体标记物的荧光图，(c)为明场图，(d)为叠加后的图像。本发明的探针与市售标记物叠加程度良好，体现出了溶酶体靶向性。
实施例7
考察实施例1中探针对溶酶体pH的检测能力。将贴壁的SNU-423细胞与本发明探针进行共孵育5分钟，再用不同pH值的磷酸盐缓冲液调节培养环境的pH值至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，并在激光共聚焦显微镜下观察，激发波长为408nm，蓝色通道波长为460-500nm，绿色通道波长为510-560nm。结果显示，酸性时，绿色通道荧光强于蓝色通道，中性时相反，同时这两个通道的图像进行比值计算后呈现出比率荧光特性(图11)。
实施例8
将实施例1中的探针分别与人源肝细胞HL-7702和人源肝癌细胞SNU-423进行共孵育5分钟，再将两种细胞置于共聚焦显微镜下以相同的参数进行观察，对比两者的荧光信号。激发波长为408nm，蓝色通道波长为460-500nm，绿色通道波长为510-560nm。结果如图12所示，SNU-423细胞的蓝色通道荧光较暗，绿色通道荧光较亮，HL-7702细胞则相反。从比率图像可以看到，SNU-423细胞呈黄色，HL-7702细胞呈淡绿色。因此该探针能够对正常细胞核癌细胞加以区分。
实施例9
将实施例1中的探针与贴壁的SNU-423共孵育5分钟，向对照组中加入新鲜培养基，向实验组培养皿中分别加入含有0.1mmol/L氯喹、0.5mmol/L过氧化氢、5mmol/L N-乙酰半胱氨酸的培养基。30分钟后，在激光扫描共聚焦显微镜下进行观察。激发波长为408nm，蓝色通道波长为460-500nm，绿色通道波长为510-560nm。与对照组相比，氯喹和过氧化氢组蓝色荧光增强，绿色荧光减弱，比率图像呈现黄绿色，表明溶酶体pH有所升高；过氧化氢组的蓝色荧光减弱，绿色荧光略有增强，比率图像呈现橙黄色，表明溶酶体已经酸化(图13)。由此可见，该探针可用于检测药物诱导的溶酶体pH变化。
实施例10
将实施例1中的探针与贴壁的SNU-423共孵育5分钟，弃去原有的培养基，再向细胞培养皿中加入不含任何营养物质的汉克斯平衡盐溶液，诱导细胞因饥饿产生自噬。在激光扫描共聚焦显微镜下每隔30分钟对同一位置的细胞进行拍照，连续拍摄3小时，期间保持显微镜参数不变。激发波长为408nm，蓝色通道波长为460-500nm，绿色通道波长为510-560nm。结果如图14，随着时间的推移，蓝色通道的荧光信号逐渐减弱，绿色通道的荧光信号略有增强，比率图像的颜色逐渐由黄绿色转变为黄色和橙黄色，这表示细胞溶酶体正在逐渐酸化，细胞自噬活动也在缓慢发生。这表明该探针可以很好地应用于对细胞自噬的实时动态监测。
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