具体实施方式

为了能更好地理解本发明的上述技术方案，下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案。

结合图1所示，本发明所提供的一种RNA酶解液层析分离系统，包括柱层析系统、上样机构、水洗机构、洗脱液机构、收集器110、检测机构以及控制系统115；其中柱层析系统依次串联的1根强酸性阳离子交换树脂105以及由多根串联的强碱性阴离子交换树脂(比如106、107)构成的强碱性阴离子交换树脂单元；强酸性阳离子交换树脂105和强碱性阴离子交换树脂单元(106、107)之间设有单向阀K4；检测机构对柱层析系统的流出液进行检测，并将检测信息传递给控制系统115；控制系统115接收检测机构的检测信息，并根据检测信息生成水洗指令、洗脱指令和收集指令；控制系统115分别与上样机构、水洗机构、洗脱液机构、柱层析系统、收集器110、检测机构通过电信号来连接。

结合图1所示，其中上样机构包括上样罐101、与上样罐101连接的泵A以及与泵A连接的单向阀K1；水洗机构包括水洗罐102、与水洗罐102连接的泵B以及与泵B连接的单向阀K2；洗脱液机构包括第一洗脱罐103、第二洗脱罐104以及与第一洗脱罐103、第二洗脱罐104连接的泵C以及与泵C连接的单向阀K3；其中单向阀K1、单向阀K2、单向阀K3均为三通单向阀。

结合图1所示，强碱性阴离子交换树脂单元中的强碱性阴离子交换树脂至少设置2根，比如2根串联的强碱性阴离子交换树脂106、107；其中柱层析系统中的强酸性阳离子交换树脂105、强碱性阴离子交换树脂106、107都采用NaOH或HCl 再生，用去离子水洗至接近中性；其中强酸性阳离子交换树脂105为Na型，强碱性阴离子交换树脂106、107为Cl型；

结合图1、图4、图5所示，控制系统115包括上样控制器111、水洗控制器 112以及洗脱控制器113；其中上样控制器111根据控制系统115的上样指令控制泵A的启闭，用于将RNA酶解液泵入柱层析系统中，上样指令包括上样时间、上样量、泵A的流速以及单向阀K1的启闭等；水洗控制器112根据控制系统115的水洗指令控制泵B的启闭，用于将去离子水泵入柱层析系统中进行水洗，其中水洗指令包括单向阀K2的启闭、去离子水的使用量、泵B的流速等；洗脱控制器113 根据控制系统115的洗脱指令控制泵C的启闭，用于将洗脱液泵入柱层析系统中进行洗脱，洗脱指令包括洗脱液的种类、浓度以及使用量、泵C的流速、单向阀K3、单向阀K4的启闭等；收集器110根据控制系统115的收集指令将洗脱出来的核苷酸收集至对应容器中。

结合图1所示，检测机构包括分别与柱层析系统出液口连接的核酸蛋白检测仪108和HPLC检测器109；核酸蛋白检测仪108、HPLC检测器109与柱层析系统出液口之间的管道上均设有定时开关；

结合图1所示，RNA酶解液层析分离系统还包括监控系统114，该监控系统 114包括用于监控RNA酶解液的层析分离过程的摄像装置以及与摄像装置连接的显示器。

结合图2、图3所示，本发明提供的另一种RNA酶解液层析分离系统，与上述图1中的控制原理部分相同，主要区别在于柱层析系统和检测机构的设计上，图 2、图3所示的RNA酶解液层析分离系统包括柱层析系统、上样机构、水洗机构、洗脱液机构、收集器110、检测机构以及控制系统115；其中柱层析系统包括叠加的多层强碱性阴离子交换树脂(参见图2)或串联的多根强碱性阴离子交换树脂(参见图3)；多层/多根强碱性阴离子交换树脂之间设有单向阀3、5、7；检测机构对每层/每根强碱性阴离子交换树脂的流出液进行检测，并将检测信息传递给控制系统 115；控制系统115接收检测机构的检测信息，并根据检测信息生成水洗指令、洗脱指令和收集指令；控制系统115分别与上样机构、水洗机构、洗脱液机构、柱层析系统、收集器、检测机构连接。

结合图2、3所示，强碱性阴离子交换树脂至少设置3层或3根，比如图2中强碱性阴离子交换树脂设置4层：1#、2#、3#、4#，图3中强碱性阴离子交换树脂设置4根：1#、2#、3#、4#。其中采用强碱性阴离子交换树脂1#、2#、3#、4#均采用NaOH或HCl再生，用去离子水洗至接近中性，强碱性阴离子交换树脂1#、2#、 3#、4#为Cl型；柱层析系统的每层或每根强碱性阴离子交换树脂1#、2#、3#、4# 的进口端均与上样机构、水洗机构、洗脱液机构连通，且其上的管道上均设有单向阀，即单向阀1、10、11、12(参见图2或图3)。

结合图2、图3所示，控制系统115包括控制上样机构的上样控制器111、控制水洗机构的水洗控制器112以及控制洗脱液机构的洗脱控制器113；其中上样控制器111根据控制系统115的上样指令进行将RNA酶解液泵入柱层析系统中，上样指令包括上样时间、上样量、泵的流速以及单向阀的启闭等；水洗控制器112根据控制系统115的水洗指令将去离子水泵入柱层析系统中进行水洗，其中水洗指令包括单向阀的启闭、去离子水的使用量、泵的流速等；洗脱控制器113根据控制系统115的洗脱指令将洗脱液泵入柱层析系统中进行洗脱，洗脱指令包括洗脱液的种类、浓度以及使用量、泵的流速、单向阀的启闭等；收集器110根据控制系统115 的收集指令将洗脱出来的核苷酸收集至对应容器中。

结合图2、图3所示，检测机构包括分别与每层/每根强碱性阴离子交换树脂出液口连通的核酸蛋白检测仪14(简称检测仪)和第一HPLC检测器15以及与最后一层或最后一根强碱性阴离子交换树脂出液口连通的第二HPLC检测器16；第二 HPLC检测器与最后一层或最后一根强碱性阴离子交换树脂4#出液口的管道上设有单向阀9。

结合图2、图3所示，收集器110设置在用于收集强碱性阴离子交换树脂4# 出液口浓度合格的核苷酸溶液，其中收集器110设置在强碱性阴离子交换树脂4# 的出液口，收集器110与强碱性阴离子交换树脂4#之间的管道上设有单向阀9、单向阀13，单向阀9和单向阀13之间的管道上设有用于第二HPLC检测器的取样支管。

结合图2、图3所示，RNA酶解液层析分离系统还包括监控系统114，该监控系统114包括用于监控RNA酶解液的层析分离过程的摄像装置以及与摄像装置连接的显示器。

结合图1、图2、图3所示，基于智能控制的RNA酶解液层析分离方法及系统，其总体构想为：RNA酶解液通过板框或离心除去悬浮状颗粒后，用2mol/L NaOH 调节pH至10.0；整个层析分离过程可分为上样、水洗、梯度洗脱(或分段洗脱)3 个过程。结合图1，上样是过滤后RNA酶解液通过再生后的串联的多根离子交换树脂，其中115是强酸性阳离子交换树脂(阳离子交换树脂采用HCl再生，用去离子水洗至中性，呈Cl型)，作用是除去钙镁离子，部分色素和可溶性大分子蛋白质等杂质；116、117是强碱性阴离子交换树脂(阴离子交换树脂采用NaOH再生，用去离子水洗至中性，呈Na型)，其作用是通过离子交换树脂作用将含有磷酸键的产品(5’-CMP、5’-AMP、5’-UMP和5’-GMP等)交换吸附在柱上，上样过程中通过 115、116、117的流出液可连接核酸蛋白检测仪在线测量流出液A260值(即紫外光波长为260nm的吸光度)，当A260＜1时属于正常范围(也可根据A260换算成浓度，浓度C≤0.04g/L属于正常范围)，可以排废，反之，则需要将流出液将接入另外通道容器回收；上样结束后，用去离子水进行水洗，其过程也通过串联的115、 116、117柱，淋洗柱上不吸附的杂质，流出液也需经过核酸蛋白检测仪在线检测 260nm的紫外吸光度，同理，上样过程也通过流出液中A260值进行调节和控制；水洗后，可通过图1进行梯度洗脱或图2或图3的分段洗脱分别将4种核苷酸洗脱下来，其过程依据表1中的HPLC检测器检测的色谱图的出峰时间判断核苷酸的种类，并根据对应核苷酸的浓度C分别收集。

表1 某种5’-核苷酸的HPLC出峰时间和浓度C

其中核酸蛋白检测仪可采用国内已有的核酸蛋白检测仪，比如上海沪西 HD-21-1，量程为0.1-2(单位)；在上样、水洗过程中由于流出液核苷酸浓度较低，可以直接实现在线检测；而在洗脱过程，由于核苷酸浓度较高，通常在10-70g/L范围之内，需要稀释500-1000倍才能测定，此时需要智能机械臂定时(设定0.5-1h) 在线取样、稀释，再加入带有自动进样装置的HPLC测定。然后通过控制系统115 计算，根据工艺参数进行调控。

结合图1～5所示，本发明的基于智能控制的RNA酶解液层析分离方法，通过 RNA酶解液层析分离系统对RNA酶解液进行层析分离，实现RNA酶解液全流程的智能控制，该RNA酶解液层析分离方法包括以下步骤：

(1)上样，RNA酶解液层析分离系统的控制系统115将过滤后的RNA酶解液泵入柱层析系统中，RNA酶解液中的5’-CMP、5’-AMP、5’-UMP和5’-GMP四种核苷酸被吸附至柱层析系统中；

具体过程如下：结合图1所示的RNA酶解液层析分离系统的控制系统115，上样控制器111控制泵A和单向阀K1(单向阀为三通单向阀)进行上样，上样流程为强酸性阳离子交换树脂115→强碱性阴离子交换树脂106→强碱性阴离子交换树脂107→核酸蛋白检测仪108→排废，上样时RNA酶解液体积约为柱层析系统中树脂体积的8～12倍，设定泵A的流速为80～120L/h(即RNA酶解液的流速)，通过上样控制器111设定上样开始时间，上样结束后，泵A自动停止工作并启动泵 B进行水洗；上样过程中RNA酶解液经柱层析系统的115、116、117柱吸附后，采用核酸蛋白检测仪每小时检测流出液的A260值，当A260＜1时，排废，反之则用收集器110收集，回收利用；

也可以采用图2或图3所示的RNA酶解液层析分离系统进行上样，上样开始时，上样控制器111控制单向阀1、单向阀2开启，当核酸蛋白检测仪14检测的 A260≥1时，上样控制器111自动关闭单项阀2，开启单向阀3、单项阀4，继续第二层或第二根强碱性阴离子交换树脂2#上样，以此类推，直至第四层上样。

(2)水洗，上样结束后，采用去离子水对所述柱层析系统进行水洗，并采用核酸蛋白检测仪和HPLC检测器对所述柱层析系统的流出液定时检测；

具体过程如下：结合图1所示，上样结束后，水洗控制器112控制泵B和单向阀K2(单向阀为三通单向阀)进行水洗，水洗流程为强酸性阳离子交换树脂115→强碱性阴离子交换树脂106→强碱性阴离子交换树脂107→核酸蛋白检测仪108→排废，水洗时，设定泵B的流速为80～120L/h，去离子水经柱层析系统的115、116、 117柱后，采用核酸蛋白检测仪108和HPLC检测器109对柱层析系统流出液定时取样检测，其中通过核酸蛋白检测仪108每小时检测流出液的A260值，当A260＜ 1时，排废，采用4～10倍树脂柱体积的去离子水(即去离子水的体积是柱层析系统中每根树脂柱体积的4～10倍)进行水洗后泵B自动停止，洗脱控制器113控制泵C洗脱。采用核酸蛋白检测仪对柱层析系统流出液检测，当柱层析系统流出液的A260＜1时，排废；反之则收集器开始启动收集，同时反馈信息至控制系统115，需要调整上样量；

也可以采用图2或图3所示的RNA酶解液层析分离系统进行水洗，原理同上。

(3)洗脱，水洗结束后，采用洗脱液对柱层析系统中的强碱性阴离子交换树脂进行洗脱，并分别收集5’-CMP、5’-AMP、5’-UMP和5’-GMP四种核苷酸溶液；

具体过程如下：

梯度洗脱：结合图1所示的RNA酶解液层析分离系统的控制系统115，柱层析系统包括依次串联的1根强酸性阳离子交换树脂105以及由多根强碱性阴离子交换树脂(比如2根强碱性阴离子交换树脂106、107)构成的强碱性阴离子交换树脂单元，强酸性阳离子交换树脂和强碱性阴离子交换树脂单元之间设有单向阀K4；在水洗结束后，洗脱控制器113控制单向阀K3打开、K4关闭，将强酸性阳离子交换树脂105与强碱性阴离子交换树脂106隔开，并控制泵C进行洗脱，其中此时的洗脱采用梯度洗脱，洗脱液采用0～5wt％的氯化钠溶液，梯度洗脱流程为：强碱性阴离子交换树脂106→强碱性阴离子交换树脂107→核酸蛋白检测仪108→收集器110，梯度洗脱时，设定泵流速为12～24L/h，洗脱控制器113控制泵C自动开启，洗脱液经106、107后，为便于流出液的测定，可采用机械臂定时取样稀释并通过HPLC 检测器109进行检测，其中：

当流出液中核苷酸的浓度C＜0.4g/L，排废；

当流出液中HPLC检测器109检测为CMP且浓度C≥0.4g/L，收集器110开始启动收集CMP；

当流出液HPLC检测为AMP，收集器110开始收集AMP；

当流出液HPLC检测为UMP，收集器110开始收集UMP；

当流出液HPLC检测为GMP，收集器110开始收集GMP；

当GMP浓度C≤10g/L时，收集器110停止收集GMP。

分段洗脱：采用图2或图3所示的RNA酶解液层析分离系统进行洗脱(分段洗脱)，结合图2或3所示，柱层析系统包括叠加的多层强碱性阴离子交换树脂或串联的多根强碱性阴离子交换树脂(比如设置4层叠加或4根柱串联)；多层/多根强碱性阴离子交换树脂之间设有单向阀，即图2或图3中，强碱性阴离子交换树脂 1#、2#、3#、4#之间分别设置单向阀3、4、5、7；在水洗结束后，洗脱液为甲酸溶液和/或甲酸钠溶液和/或氯化钠溶液，其流速为12～24L/h；在分段洗脱过程中，通过核酸蛋白检测仪和HPLC检测器对每层或每根强碱性阴离子交换树脂的流出液定时检测:

采用0.01mol/L的甲酸溶液分段洗脱5’-CMP，收集浓度为10～50g/L的5’-CMP，即首先打开单向阀1、单向阀3、单向阀5、单向阀7、单向阀9，采用0.01mol/L 的甲酸溶液洗脱5’-CMP，当第一HPLC检测器15检测强碱性阴离子交换树脂1# 出口5’-CMP的浓度≤0.05g/L时，洗脱控制器113关闭单向阀1、单向阀3，开启单向阀10，当第一HPLC检测器15检测强碱性阴离子交换树脂2#出口5’-CMP的浓度≤0.05g/L时，关闭单向阀5，开启单向阀11，当第一HPLC检测器15检测强碱性阴离子交换树脂3#出口5’-CMP的浓度≤0.05g/L时，关闭单向阀7，开启单向阀12；上述洗脱的同时，在单向阀9的出口，通过第二HPLC检测器16定时取样检测 5’-CMP的浓度，当其浓度范围在10～50g/L范围内，开启单向阀13，全部收集待用；

5’-CMP收集完毕后采用同样的方法收集5’-AMP、5’-UMP和GMP，其中采用0.1mol/L的甲酸溶液洗脱5’-AMP，收集浓度为10～50g/L的5’-AMP；采用0.1 mol/L甲酸溶液和0.1mol/L甲酸钠溶液洗脱5’-UMP；采用pH为3.0、浓度为3wt％的氯化钠溶液洗脱5’-GMP，并收集浓度为10～50g/L的5’-GMP。

上述分离后的四种核苷酸溶液，分别进行浓缩、结晶、干燥得到对应的结晶：将收集的5’-CMP、5’-AMP、5’-UMP分别浓缩至10～20％，脱色过滤，然后分别加2～3倍的95％乙醇，获得结晶产品，再经过滤、干燥，分别得到含量99％以上的单一结晶产品5’-CMP、5’-AMP、5’-UMP，由于5’-GMP的收集液浓度较高，无需进行浓缩，可直接脱色过滤，加2～3倍的95％乙醇，获得结晶产品，再经过滤、干燥，得到99％以上的5’-GMP。

上述无论采用分段洗脱还是梯度洗脱，上样时均可采用图2或图3所示的RNA 酶解液层析分离系统，即当第一层或第一根柱上样饱和时，可自动切换第二层或第二根柱，如此类推可以叠加4层、5层或更多，或串联4根、5根或更多。这样按图2或图3所示的4层或4根组合，则第一层或第一根柱上样时是100％通过层析柱，第二层或第二根柱上样是75％通过层析柱，第三层或第三根柱上样是50％通过，第四层或第四根柱上样是25％通过。酶解液中含有很多杂质，对层析柱污染是很大的，这样多层多根分部上样，则可以使层析柱污染减少到最低程度，这样对于提高上样量即增加产量、提高分离效率和提高产品质量是非常有利的。一般工厂都是每天投一次料，因为分离周期长，如果分离周期是6天，则有6套柱在运转，如果没有在线检测和智能化控制，单靠人工监测或控制是很难办到的。

而洗脱时，在采用中国专利CN1177859C分段洗脱方式，可按图2或图3所示的RNA酶解液层析分离系统进行，即当第一种较低浓度洗脱时，第一层或第一根 5’-CMP全部洗尽时，可断开第一层或第一根，洗第二层或第二根，以后依此类推。当第二种较高浓度洗脱5’-AMP时，同上也可以分别依次洗脱。5’-UMP和5’-GMP 以此类推；这样可使吸附在柱上杂质，尽可能少洗脱下来，有利于收率和产品质量的提高。在采用中国专利CN108752405A梯度洗脱方式时，由于层析带是连续推进和洗脱下来，则不能分层或分段洗脱，无论叠加或串联只能连成一起了，但上样时污染也是与分段洗脱同样的减少。

本发明的基于智能控制的RNA酶解液层析分离方法及系统，不仅是摆脱了繁琐的人工操作，而且是对整个层析分离工艺的革新，它可对该工艺进一步精细化控制、提高上样量10～15％(即产能)和产品质量(99％以上)，并且更加节能和环保。

下面结合具体的例子对本发明的基于智能控制的RNA酶解液层析分离方法及系统进一步介绍。

实施例1

本实施例中采用图1所示的RNA酶解液层析分离系统对RNA酶解液进行层析分离，具体过程如下：

1)酶解

称取14kg RNA定容200L水中溶解，升温至72℃，加入0.6kg磷酸二酯酶保温反应4h，此时RNA水解成5’-AMP、5’-GMP、5’-CMP、5’-UMP等4种核苷酸，转化率75％，升温至85-90℃，灭酶，迅速冷却至45℃以下，用6mol/L NaOH调pH10.0，加硅藻土过滤，澄清滤液用去离子水稀释至1600L，备用。

2)上样层析分离

准备工作：结合图1，在柱层析系统的105柱中装732阳离子交换树脂60L， 106柱、107柱分别装入201X7阴离子交换树脂60L，用1.2mol/LHCl或NaOH再生，用去离子水洗至接近中性，最终强酸性阳离子交换树脂105为Na型，强碱性阴离子交换树脂106、107为Cl型。

开启控制系统115，上样控制器111打开泵A，RNA酶解液由105、106、107 柱串联上样，流速80-120L/h，约20-30h上样结束。上样控制器111关闭泵A，水洗控制器112开启泵B，进行水洗，流速同上，水洗结束后关闭泵B，洗脱控制器 113开启泵C，开始梯度洗脱。梯度洗脱条件：洗脱罐103中为水300L、洗脱罐104 中采用质量百分浓度为5％NaCl溶液300L，共600L，形成质量百分浓度为0～5的 NaCl溶液，控制流速为12～24L/h，约50～100h洗脱结束；洗脱时断开强酸性阳离子交换树脂105，直接串联洗脱强碱性阴离子交换树脂106、107。流出液通过定时取样，自动稀释，自动进样经HPLC检测器109，并经控制洗脱开启收集器分部收集。当5’-CMP峰出现且浓度C≥0.4g/L启动收集5’-CMP；当5’-AMP峰出现时开始收集5’-AMP；当5’-UMP峰出现时开始收集5’-UMP；当5’-GMP峰出现时开始收集5’-GMP；当5’-GMP浓度C＜10g/L时停止收集。

3)浓缩、结晶、干燥

将5’-CMP、5’-AMP、5’-UMP收集液分别浓缩至10-20％，脱色过滤，加入2～ 3倍95％乙醇，将获得结晶产品，再经过过滤、干燥，分别可得到2kg的5’-CMP，含量99.2％；2.1kg的5’-AMP，含量99.5％；2.1kg的5’-UMP，含量99.1％。5’-GMP 由于浓度较高，一般洗脱液浓度在50～80g/L，无需浓缩，可直接脱色过滤，加入2～ 3倍95％乙醇结晶、干燥，可得2.2kg的5’-GMP，含量99.1％。

实施例2

按实施例1酶解方法增加10％投料量，即15.4kg的RNA和0.66kg的酶，制备处理核苷酸，最终稀释至1760L备用。

按照图2所示的RNA酶解液层析分离系统上样，每层约装填再生后的阴离子交换树脂30L Cl型，总共120L。第一层约可上样370～420L，上样开始开启单向阀1、单向阀2，当核酸蛋白检测仪检测A260≥1时，控制器自动关闭阀2，开启单向阀3、单向阀4，继续第二层上样；当其流出液A260≥1时，关闭单向阀4，开启单向阀5、单向阀6，继续第三层上样；当其流出液A260≥1时，关闭单向阀6，开启单向阀7、单向阀8，继续第四层上样。其中第二层约可上样800～840L，第三层约可上样1240～1300L，第四层约可上样1760L，甚至更多，总上样量可增10～ 15％。

上样结束用600L纯化水洗。

然后按照实施例1中的梯度洗脱方法。

4种核苷酸分别浓缩、结晶、干燥，最终获得2.2kg的5’-CMP，含量99.4％； 2.3kg的5’-AMP，含量99.6％；2.4kg的5’-UMP，含量99.3％，2.5kg的5’-GMP，含量99.3％。

实施例3

本实施例采用图2所示的RNA酶解液层析分离系统对RNA酶解液进行层析分离；

按照实施例2进行酶解、上样、水洗。

洗脱时采用分段洗脱方法。

先开启单向阀1、单向阀3、单向阀5、单向阀7、单向阀9，用0.01mol/L甲酸洗脱5’-CMP，当第一HPLC检测器15检测第一层出口5’-CMP浓度≤0.05g/L时，关闭单向阀1、单向阀3，开启单向阀10，当第二层出口5’-CMP浓度≤0.05g/L时，关闭阀5，开启阀11，当第三层出口5’-CMP浓度≤0.05g/L时，关闭单向阀7，开启单向阀12。同时，在单向阀9出口第二HPLC检测器16定时取样检测5’-CMP 浓度，当其浓在10～50g/L范围开启单向阀13，全部收集待用。

5’-CMP收集完毕，开启单向阀1、单向阀3、单向阀5、单向阀7、单向阀9，用0.1mol/L甲酸洗脱5’-AMP，当第一HPLC检测器15检测第一层出口5’-AMP浓度≤0.05g/L时，关闭单向阀13，开启单向阀10。以下同上。当单向阀9出口5’-AMP 浓度在10～50g/L范围，全部收集待用。

5’-AMP收集完毕，用0.1mol/L甲酸和0.1mol/L甲酸钠洗脱5’-UMP，操作方法，步骤同上。当单向阀9出口5’-UMP浓度在10～50g/L范围，全部收集待用。

5’-UMP收集完毕，用pH3.0的3％Nacl洗脱5’-GMP，操作方法，步骤同上。最后当单向阀9出口5’-GMP浓度在10～50g/L范围，全部收集待用。

4种核苷酸分别浓缩、结晶、干燥，最终获得2.4kg的5’-CMP，含量99.3％； 2.4kg的5’-AMP，含量99.6％；2.5kg的5’-UMP，含量99.5％；2.5kg的5’-GMP，含量99.5％。

实施例4

本实施例按照图3所示的RNA酶解液层析分离系统对RNA酶解液进行层析分离；

按照实施例3制备处理RNA，最终RNA酶解液稀释至1760L备用。然后按照图3所示串联方法上样。每根装填30L阴离子交换树脂，再生后Cl型，总共120 L。第一根柱约可上样370～420L，上样开始开启阀1、2，当流出液浓度A260≥1 时，关闭阀2，开启阀3、4；当阀4流出液A260≥1时，关闭阀4，开启阀5、6；当阀6流出液浓度A260≥1时，关闭阀6，开启阀7、8。第一根柱约可上样370～ 420L，第二根柱约可上样800～840L，第三根柱约可上样1240～1300L，第四根柱约可上样1760L，总上样量可增加10～15％。

上样结束用600L纯化水(或去离子水)洗。

然后按照实施例2方法梯度洗脱。

4种核苷酸分别浓缩、结晶、干燥，最终获得2.3kg的5’-CMP，含量99.6％； 2.3kg的5’-AMP，含量99.8％；2.5kg的5’-UMP，含量99.6％；2.5kg的5’-GMP，含量99.5％。

实施例5

本实施例照图3所示的RNA酶解液层析分离系统对RNA酶解液进行层析分离；

按照实施例4的方法酶解、上样、水洗。

洗脱时采用分段洗脱方法。

先开启单向阀1、单向阀3、单向阀5、单向阀7、单向阀9，用0.01mol/L甲酸洗脱5’-CMP，当第一HPLC检测器检测第一根出口5’-CMP浓度≤0.05g/L时，关闭单向阀1、单向阀3，开启单向阀10，当第二根出口5’-CMP浓度≤0.05g/L时，关闭单向阀5，开启单向阀11，当第三根出口5’-CMP浓度≤0.05g/L时，关闭单向阀7，开启单向阀12。同时，在单向阀9出口第二HPLC检测器定时取样检测5’-CMP 浓度，当其浓在1％～5％范围开启单向阀13，全部收集待用。

5’-CMP收集完毕，开启单向阀1、单向阀3、单向阀5、单向阀7、单向阀9，用0.1mol/L甲酸洗脱5’-AMP，当第一HPLC检测器检测第一根出口5’-CMP浓度≤0.05g/L时，关闭单向阀13，开启单向阀10。以下同上。当单向阀9出口5’-AMP 浓度在1％～5％范围，全部收集待用。

5’-AMP收集完毕，用0.1mol/L甲酸和0.1mol/L甲酸钠洗脱5’-UMP，操作方法，步骤同上。当单向阀9出口5’-UMP浓度在10～50g/L范围，全部收集待用。

5’-UMP收集完毕，用pH3.0的3％Nacl洗脱5’-GMP，操作方法，步骤同上。最后当单向阀9出口5’-GMP浓度在10～50g/L范围，全部收集待用。

4种核苷酸分别浓缩、结晶、干燥，最终获得5’-CMP 2.3kg，含量99.5％；5’-AMP2.4kg，含量99.5％；5’-UMP 2.5kg，含量99.5％；5’-GMP 2.6kg，含量99.5％。

本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求书范围内。