一种抑制病毒的核苷酸类化合物
阅读说明：本技术 一种抑制病毒的核苷酸类化合物 (Nucleotide compound for inhibiting virus ) 是由 沈振波 于 2021-02-07 设计创作，主要内容包括：本发明涉及抑制新冠病毒、流感病毒和仙台病毒的核苷酸类化合物,还涉及所述核苷酸类化合物或其在药学上可接受的盐或酯在制备用于预防和/或治疗新冠病毒、流感病毒、仙台病毒感染的药物中的用途。(The invention relates to a nucleotide compound for inhibiting new coronavirus, influenza virus and Sendai virus, and also relates to application of the nucleotide compound or pharmaceutically acceptable salt or ester thereof in preparing a medicament for preventing and/or treating infection of the new coronavirus, the influenza virus and the Sendai virus.)
技术领域
本发明涉及基于核苷酸结构的化合物，还涉及该基于核苷酸结构的化合物在抑制新冠病毒、流感病毒和仙台病毒中的用途。
背景技术
RNA聚合酶(RdRp)是病毒RNA复制的关键酶，具有依据模板链从5’端至3’端合成RNA的作用，由于功能的重要性使得RdRp成为病毒进化中最为缓慢的蛋白，其催化残基以及其它功能重要的残基在进化中总是倾向于保守。因此，RNA聚合酶(RdRp)很有可能成为预防/治疗病毒感染的药物靶点。
药物的本质是其与生命大分子发生分子之间的相互作用，进而影响大分子的生物学功能，故分子间的相互作用往往是药物发挥效用的基础。在物质的世界，化学结构是最真实的存在，每一个靶酶的抑制剂可以有成百上千种，比如黄嘌呤氧化还原酶抑制剂。但是靶酶的抑制剂在临床的疗效难于预估。因为临床疗效还与这些活性成分的吸收、分布、代谢以及穿透细胞膜的能力等相关。一些“前药”需在体内转化成活性形式才能起到药效作用。比如，阿昔洛韦往往需要转化成三磷酸形式才能起作用，但阿昔洛韦的磷酸化需要特定的疱疹病毒的胸苷激酶催化，故临床上阿昔洛韦在临床上主要用于疱疹病毒感染的相关疾病。其他病毒产生的酶类不一定具有催化阿昔洛韦磷酸化的能力，故临床应用阿昔洛韦对于其他病毒可能无效。比如，瑞德西韦通过抑制RNA聚合酶(RdRP)而提前终止病毒RNA的转录从而起到阻止病毒复制的作用，但是瑞德西韦在治疗埃博拉病毒试验中并未表现出显著疗效，但对于SARS-CoV和MERS-CoV却显示出较好的体内以及体外抗病毒活性。而在最新的一项评估瑞德西韦治疗新型冠状病毒肺炎的安全性和有效性的队列分析试验中并未得到令人期待的结果。
发明内容
本发明提供了基于核苷酸结构的化合物，该化合物对于新型冠状病毒COVID-19、流感病毒以及仙台病毒具有抑制作用。
本发明的技术方案如下：
结构如式I所示核苷酸类化合物或其在药学上可接受的盐或酯在制备用于预防和/或治疗COVID-19、流感病毒以及仙台病毒的药物中的用途：
其中：
R1独立地是鸟嘌呤、尿嘧啶或
R2是羟基、烷氧基或C1-C8烷基。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述C1-C8烷基为异丙基。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述化合物为以下结构所示化合物中的至少一种：
核苷酸类似物具有阻断作用的磷酸基团，使其能够进入受感染的真核细胞，是一种前药，通过细胞酶转化为活性三磷酸形式，激活后的药物结合在RNA聚合酶(RdRP)的活性部位，之后被整合到RNA中，由于在2’位的修饰，可抑制RNA链的进一步延伸并终止RNA的复制，它作为RNA聚合酶抑制剂可与天然核糖核苷酸竞争，本发明所述的化合物或其在药学上可接受的盐或酯可用于制备预防和/治疗新冠病毒、流感以及仙台病毒感染的药物。
具体实施方式
为了更充分的理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明。
以下实验由广州海关技术中心BSL-3级实验室进行。
实施例1
化合物1～3对新冠病毒抑制效果
Day 0细胞铺板
Vero E6细胞进行96孔细胞板铺板，1.6×104cells/well，D10培养基进行37℃、5％CO2培养过夜。
Day 1抗病毒实验
1.药物稀释：药物储存浓度为10mM，用DMEM培养基将其分别稀释至10μM、5μM、1μM作用浓度组和20μM、10μM、2μM作用浓度组。
2.预处理：实验分别设置细胞对照组、病毒感染组、药物病毒作用组、药物对照组共计4组实验，每种药物3个复孔。在Vero E6细胞感染病毒前吸弃细胞培养上清，在药物病毒作用组及药物对照组中加入相应10μM、5μM、1μM作用浓度培养液，100μL/well。37℃、5％CO2培养2h。
3.抗病毒作用：预处理之后在BSL-3实验室中，吸弃所有细胞板内上清，用D2培养基稀释2019-nCoV(COVID-19)病毒，使其MOI＝0.05，体积为25μL/well。将稀释好的病毒25μL/well与药物20μM、10μM、2μM作用浓度组(25μL/well)混合，形成药物病毒作用组50μL/well。其余的组用相应的D2培养基来代替药物或病毒进行混合。将混合后的培养基孵育细胞，37℃、5％CO2培养1h。
4.细胞培养：混合孵育后的细胞吸弃上清，分别药物病毒作用组内加入10μM、5μM、1μM药物培养基(D2作为稀释液)100μL/well。在其他组内加入相应的D2或药物培养基100μL/well，37℃、5％CO2培养24h。
Day 2IFA检测
1.细胞板固定：在BSL-3级实验室，细胞板内弃去培养上清，加入4％PFA 200μL/well，室温固定大于3h。
2.IFA检测：Triton打孔破膜封闭后，SARS-N兔单抗作为一抗作用1h，A488anti-Rabbit IgG为二抗作用1h，洗板，荧光观察。
实验结果如下表1所示：
表1
化合物名称
浓度
新冠病毒抑制率(％)
化合物1
10μM
50.35％
化合物2
10μM
50.88％
化合物3
10μM
29.74％
由对新冠病毒的抑制实验可知，本发明所述化合物1～3可有效抑制新冠病毒，本发明所述的化合物或其在药学上可接受的盐或酯可用于制备治疗新冠病毒感染的药物。
实施例2
化合物1～3对流感病毒抑制效果
病毒感染性测定(TCID50的测定)
取出病毒液溶解后，用无血清无双抗培养基进行连续10倍的梯度稀释，可稀释为101～109(可按情况增加或减少稀释度)将各稀释度的病毒接种于相应的宿主细胞中，其中流感病毒H1N1接种于MDCK(NBL-2)细胞，每个稀释度设6-8个复孔，将不同浓度的病毒液分别接种到相应的长成单层细胞的96孔板中，每孔100μL，置于5％CO2恒温培养箱内，流感病毒(H1N1)于35℃，吸附1-2h后弃上清，以PBS洗1-2次；加细胞维持液每孔100μL继续培养，同时设正常细胞对照组6-8个，分别置35℃、37℃5％CO2培养箱培养，每日观察病毒生长情况，在倒置显微镜下观察细胞的形态变化并记录特征性细胞病变(CPE)的孔数，3-7d后记录结果，细胞病变率达50％及以上的培养孔计为病变孔，细胞病变率小于50％者计为非病变孔。
细胞出现病变(CPE)程度按6级标准记录：
-：细胞生长正常，无病变出现；
±：细胞病变少于整个单层细胞的10％；
+：细胞病变少于整个单层细胞的25％；
++：细胞病变少于整个单层细胞的50％；
+++：细胞病变少于整个单层细胞的75％；
++++：细胞病变占整个单层细胞的75％以上。
结果判定及计算方法：
根据Reed-Muench法，计算病毒的半数感染量TCID50。
比例距离(PD)＝(病变高于50％的百分数-50％)/(病变高于50％的百分数-病变低于50％的百分数)
其中细胞病变率达50％及以上的培养孔计为病变孔，细胞病变率小于50％者计为非病变孔。
体外抗病毒试验
(1)实验方法
待96孔板细胞长成单层后进行体外抗病毒试验。病毒攻击量为10～100TCID50。病毒吸附单层细胞1-2h后，洗去病毒液，各孔分别加入100μL药液和100μL维持液，同时设病毒对照，空白细胞对照。置于相应温度的CO2培养箱内培养，每天在倒置显微镜下观察病变，连续观察数天，记录各孔CPE。当病毒对照组细胞病变达到“++++”，且正常细胞对照组无病变时，确定为CCK-8检测的最适时间点，进行CCK-8检测，在酶标仪450nm波长处测定吸光度值(OD值)。实验重复2次，计算3次实验结果的平均值。
(2)计算方法：
根据Reed-Muench法，计算药物50％有效浓度(IC50)和治疗指数(TI)。
病毒抑制率＝(药物组OD450-病毒对照组OD450)/(正常细胞对照组OD450-病毒对照组OD450)。
TI＝TC50/IC50。
实验结果如下表2所示：
表2
化合物名称
浓度
H1N1病毒抑制率(％)
化合物1
10μM
50.28％
化合物2
10μM
46.39％
化合物3
10μM
27.73％
由对流感病毒的抑制实验可知，本发明所述化合物1～3可有效抑制H1N1病毒，本发明所述的化合物或其在药学上可接受的盐或酯可用于制备治疗流感病毒感染的药物。
实施例3
化合物1～3对仙台病毒抑制效果
实施例3的基本步骤同实施例1，只是将病毒更换为仙台病毒。其中，仙台病毒于37℃吸附1-2h后弃上清。
化合物1～2对仙台病毒抑制效果如下表3所示。
表3
由对仙台病毒的抑制实验可知，本发明所述化合物1～3可有效抑制仙台病毒，本发明所述的化合物或其在药学上可接受的盐或酯可用于制备治疗仙台病毒感染的药物。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。
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