一种人白细胞介素2变体及其用途
阅读说明：本技术 一种人白细胞介素2变体及其用途 (Human interleukin 2 variant and application thereof ) 是由 陆雍涛 刘建光 于 2021-10-26 设计创作，主要内容包括：本公开涉及一种人白细胞介素2变体及其用途。具体而言,本公开涉及一种IL-2变体(或其衍生物),其对高亲和力受体IL-2Rα/β/γ具有消除或降低的亲和力,并保留对中等亲和力受体IL-2Rβ/γ的亲和力。(The present disclosure relates to human interleukin 2 variants and uses thereof. In particular, the disclosure relates to an IL-2 variant (or derivative thereof) that has an eliminated or reduced affinity for the high affinity receptor IL-2R α/β/γ and retains affinity for the intermediate affinity receptor IL-2R β/γ.)
本申请要求2021年7月30日提交的专利申请(申请号2021108684095，一种人白细胞介素2变体及其用途)的优先权。
技术领域
本公开涉及具有一个或多个氨基酸突变的人白细胞介素-2(IL-2)变体或其衍生物。所述IL-2变体或衍生物具有消除或降低的对高亲和力受体(IL-2Rα/β/γ)的亲和力，并保留对中等亲和力受体(IL-2Rβ/γ)的亲和力。本公开还涉及包含所述人IL-2变体的免疫缀合物、编码多核苷酸、载体、宿主细胞、药物组合物、制备方法及治疗方法和用途。
背景技术
人白细胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)，也称为T细胞生长因子(TCGF)。IL-2基因位于4号染色体(4q27)，包括共约7kb的序列。IL-2由约133个氨基酸组成，分子量约15kD。Doris Morgan等人1976和1977分别发现活化后的T细胞培养液可以促进T细胞增殖。培养液中的刺激因子被纯化并被鉴定为IL-2。
最初的体外细胞实验表明T细胞在通过TCR和CD28活化之后，可以分泌IL-2并在细胞表面表达IL-2受体(IL-2R)。IL-2和IL-2R的结合可以引起T细胞的增殖和使T细胞产生效应。IL-2是T细胞免疫反应中起到中心作用的分子。体内实验发现在敲除IL-2或其受体后，动物产生了自身免疫。IL-2不仅可以激活效应细胞(如T细胞和NK细胞)，还可以激活调节性T细胞，从而抑制过量针对自身的免疫。
IL-2通过IL-2R发生作用。IL-2R包括三个亚基：IL-2Rα(即CD25)、IL-2Rβ(即CD122)和IL-2Rγ(即CD132)。三个亚基可以形成三种受体形式：高亲和力受体包含所有三个亚基IL-2Rα/β/γ，中亲和力受体包含IL-2Rβ/γ和低亲和力受体IL-2Rα。IL-2Rβ和IL-2Rγ是IL-2激活下游信号通路所必需的，当IL-2同时结合IL-2Rβ和IL-2Rγ时，两个受体亚基形成异源二聚体，磷酸化细胞内的STAT5，进入细胞核导致相应的基因转录和表达；IL-2Rα并非信号所必需，但可以促进IL-2与IL-2Rβ和IL-2Rγ的结合。
IL-2Rγ在所有免疫细胞中均有表达；IL-2Rβ在CD8+T细胞、NK细胞、调节性T细胞中均有表达，而且在T细胞被激活后还会提升表达水平；IL-2Rα在调节性T细胞持续高表达，在被激活的CD8+T细胞中会有短暂表达，随即下调表达水平。
IL-2主要由活化的T细胞，尤其是CD4+辅助T细胞合成。它刺激T细胞的增殖和分化，诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的生成以及外周血淋巴细胞分化成细胞毒性细胞和淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞，促进T细胞表达细胞因子和细胞溶解分子，促进B细胞的增殖和分化以及通过B细胞的免疫球蛋白合成，并刺激天然杀伤(NK)细胞的生成、增殖和活化。IL-2在体内扩充淋巴细胞群体和提高这些细胞的效应器功能的能力使得其具有抗肿瘤效果，IL-2免疫疗法成为某些转移性癌症患者的治疗选择。目前，高剂量IL-2已被批准用于治疗转移性肾细胞癌和恶性黑素瘤。
WO2009135615公开的IL-2变体在20、88或126位具有突变。WO2012062228公开的IL-2变体在38、42、45、62、68或88中的至少一个位置上具有突变。US8906356公开的IL-2变体在91、126位具有突变。US9732134公开的IL-2变体在15、16、22、84、88或95中的至少一个位置上具有突变。US7803361和US8124066公开的IL-2变体包含R38W突变。
发明内容
本公开涉及具有一个或多个氨基酸突变的IL-2变体(或其衍生物)、及其缀合物；还涉及所述IL-2变体的用途、制备方法。
IL-2变体或其衍生物
第一方面，本公开提供一种IL-2变体(或其衍生物)，其与成熟野生型人IL-2(SEQID No.11)相比包含一个或多个氨基酸突变。
“白介素-2”或“IL-2”指来自任何哺乳动物(如灵长类(如人)、啮齿动物(例如小鼠和大鼠))的任何天然的IL-2。该术语涵盖未加工的IL-2以及源自细胞中任何加工形式的IL-2。该术语还涵盖天然存在的IL-2变体(例如剪接变体或等位变体)。
“野生型人IL-2”在其它方面与IL-2变体相同，只是在IL-2变体的每个氨基酸位置具有野生型氨基酸的IL-2形式。术语“野生型”意图涵盖：包含一处或多处不影响对IL-2受体结合能力的天然存在的氨基酸突变。
“成熟野生型人IL-2”是指野生型人IL-2的成熟形式。未加工的人IL-2额外包含N端约20个氨基酸的信号肽，在成熟IL-2分子中缺乏信号肽。示例性成熟野生型人IL-2的氨基酸序列例如但不限于：数据库登录号INSDC的CAA25742.1、Swiss-Prot的P60568.1、Genbank中NP_000577.2的21-153段。在一些实施方案中，成熟野生型人IL-2是SEQ IDNO.11所示的氨基酸序列。应当注意的是，SEQ ID NO.11和数据库中的成熟人IL-2相比，出于重组表达的目的在N端额外包含甲硫氨酸M。然而，技术人员应当理解，无论有无首位M，均属于本申请中“成熟野生型人IL-2”的范畴。
一些实施方案中，与成熟野生型人IL-2相比，本申请所进行的氨基酸突变使得IL-2上与IL-2Rα相结合的区域(位于氨基酸约26至约47的位置)其长度变短。
一些实施方案中，氨基酸突变包括氨基酸的取代、缺失、插入、修饰及其任意组合。为了改变例如IL-2的结合特性，可以用氨基酸(例如，用具有不同结构和/或化学特性的氨基酸)取代另一种氨基酸替换。氨基酸的取代包括由非天然氨基酸或20种标准氨基酸。可以使用本领域中公知的方法生成氨基酸突变(包括定点诱变、PCR、基因合成、化学修饰等)。
一些实施方案中，根据本公开的IL-2变体(或其衍生物)与IL-2Rα的亲和力降低，维持与IL-2Rβ和/或IL-2Rγ的亲和力。
“亲和力”指分子的结合位点与其配体之间的非共价相互作用总强度。除非另外指示，本文的“亲和力”指反映结合对的成员(例如受体和配体)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。亲和力通常可以用解离常数(KD)来表述，其为解离与结合速率常数(分别为K解离和K结合)的比率。亲和力可以通过本领域常规的方法来测量，包括本文中所描述的方法。
一些实施方案中，根据本公开的IL-2变体(或其衍生物)与高亲和力受体(IL-2Rα/β/γ)的亲和力是降低的或缺失，但维持对中等亲和力受体(IL-2Rβ/γ)的亲和力。
一些实施方案中，“高亲和力IL-2受体”指IL-2受体的异三聚体形式，其由受体γ亚基(也称为通用细胞因子受体γ亚基、γc或CD132)、受体β亚基(也称为CD122或p70)和受体α亚基(也称为CD25或p55)组成。
一些实施方案中，“中等亲和力IL-2受体”指仅包含γ亚基和β亚基的IL-2受体，而无α亚基(参见Olejniczak和Kasprzak，MedSci Monit14，RA179-189，2008)。
一些实施方案中，根据本公开的IL-2变体(或其衍生物)对调节性T细胞(Treg)的激活降低，和/或对免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)的激活不受影响或增高。
一些实施方案中，根据本公开的IL-2变体(或其衍生物)，其中所述突变发生在选自第31至45位中任一个或多个位点(连续或不连续)(从SEQ ID NO:11的第2位开始计数)：
31位酪氨酸(Y)、32位赖氨酸(K)、33位天冬酰胺(N)、
34位脯氨酸(P)、35位赖氨酸(K)、36位亮氨酸(L)、
37位苏氨酸(T)、38位精氨酸(R)、39位甲硫氨酸(M)、
40位亮氨酸(L)、41位苏氨酸(T)、42位苯丙氨酸(F)、
43位赖氨酸(K)、44位苯丙氨酸(F)突变、45位酪氨酸(Y)。
一些实施方案中，根据本公开的IL-2变体(或其衍生物)，其中所述突变发生在第31至32位的任一个或多个位点(连续或不连续)(从SEQ ID NO:11的第2位开始计数)。
一些实施方案中，根据本公开的IL-2变体(或其衍生物)，其中所述突变发生在第35至41位的任一个或多个位点(连续或不连续)(从SEQ ID NO:11的第2位开始计数)。
一些实施方案中，根据本公开的IL-2变体(或其衍生物)，其中所述突变发生在第43至45位的任一个或多个位点(连续或不连续)(从SEQ ID NO:11的第2位开始计数)。
一些实施方案中，当SEQ ID NO:11作为野生型成熟IL-2时，氨基酸突变位点是从SEQ ID NO:11的第2位开始计数(相当于，不考虑因重组表达而人为引入的甲硫氨酸)。
另一些实施方案中，当以公共数据库或公知文献中记载的天然序列作为野生型成熟IL-2时，氨基酸突变位点是从第1位氨基酸A开始计数。
一些具体的实施方案中，提供一种IL-2变体，其包含以下任一突变或其组合：
第31-45位突变为Gly-Gly-Asn-Pro-Met-His-Gly-Leu-Asp-Gly-Phe-Gly(SEQ IDNo.9)；
第31-32位突变为Gly-Gly；
第35-41位突变为Met-His-Gly-Leu-Asp-Gly(SEQ ID No.10)；
第43-45位突变为Gly。
一些具体的实施方案中，当IL-2变体包含选自以下突变或组合时，IL-2变体对IL-2Rα的亲和力降低，对IL-2Rβ/γ亲和力维持：
31-32位的YK突变为GG；突变后的序列为SEQ ID No.3或7。
一些具体的实施方案中，当IL-2变体包含选自以下突变或组合时，IL-2变体对IL-2Rα的亲和力降低，对IL-2Rβ/γ亲和力维持：
35-41位的KLTRMLT突变为MHGLDG；突变后的序列为SEQ ID No.2或6。
一些具体的实施方案中，当IL-2变体包含选自以下突变或组合时，IL-2变体对IL-2Rα的亲和力降低，对IL-2Rβ/γ亲和力维持：
43-45位的KFY突变为G；突变后的序列为SEQ ID No.4或8。
一些具体的实施方案中，当IL-2变体包含选自以下突变或组合时，IL-2变体对IL-2Rα的亲和力降低，对IL-2Rβ/γ亲和力维持：
(1)31-32位的YK突变为GG；且
(2)35-41位的KLTRMLT突变为MHGLDG；
突变后的序列为SEQ ID No.12或13。
一些具体的实施方案中，当IL-2变体包含选自以下突变或组合时，IL-2变体对IL-2Rα的亲和力降低，对IL-2Rβ/γ亲和力维持：
(1)35-41位的KLTRMLT突变为MHGLDG；且
(2)43-45位的KFY突变为G；
突变后的序列为：SEQ ID No.14或15。
一些具体的实施方案中，当IL-2变体包含选自以下突变或组合时，IL-2变体对IL-2Rα的亲和力降低，对IL-2Rβ/γ亲和力维持：
(1)31-32位的YK突变为GG；且
(2)43-45位的KFY突变为G；
突变后的序列为SEQ ID No.16或17。
一些具体的实施方案中，当IL-2变体包含选自以下突变或组合时，IL-2变体对IL-2Rα的亲和力降低，对IL-2Rβ/γ亲和力维持：
(1)31-32位的YK突变为GG；且
(2)35-41位的KLTRMLT突变为MHGLDG；且
(3)43-45位的KFY突变为G；
突变后的序列为SEQ ID No.1或5。
在一些具体的实施方案中，所述的IL-2变体(或其衍生物)的氨基酸序列选自SEQID No.NO：1-8和12-17。
表1.人IL-2野生型及变体序列
天然表达的人IL-2共153个氨基酸，1-20位氨基酸是信号肽。切除信号肽后共133个氨基酸(即成熟人IL-2)，对应于本公开SEQ ID No.1的2-134位。出于重组表达目的，人工生产的IL-2首位额外带有甲硫氨酸(对应起始密码子AUG)。因此，本公开的突变位点编号实际上从SEQ ID No.1的第二位计数，即从氨基酸A开始计数。
作为一个示例，表述“第31-32位的氨基酸突变为GG”是指：
在人IL-2成熟蛋白的序列MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID No.1共计133个氨基酸)中的第31-32位的YK突变为GG。
一些实施方案中，IL-2变体是单体形式。
第二方面，本公开提供一种IL-2变体的衍生物，其包含本公开的IL-2变体，所述IL-2变体具有选自以下任一项所述的修饰或其组合：PEG化、糖基化、缀合至白蛋白、缀合至Fc、羟乙基化、去O-糖基化。
一些实施方案中，IL-2变体的衍生物包括本公开IL-2变体的全长、部分、或在本公开IL-2变体的基础上进一步获得的功能性衍生物、功能性片段、生物活性肽、融合蛋白、同种型或其盐。例如，包含IL-2变体的融合蛋白，所述IL-2变体的二聚物或三聚物或多聚物。所述IL-2变体的各种修饰形式(如PEG化、糖基化、缀合至白蛋白、缀合至Fc、羟乙基化、去除O-糖基化等)。
一些实施方案中，IL-2变体的衍生物是PEG化的(可以表示为PEG-IL-2)。
在另一些实施方案中，PEG-IL-2变体包含甲氧基-PEG-醛(mPEG-ALD)接头。在某些实施方案中，PEG的平均分子量在约5kD至约50kD；具体地5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50kD；或约5kD至约40kD；或约10kD至约30kD；或约10kD至约30kD之间；或约15kD至约20kD之间。
某些具体实施方案中，mPEG-ALD接头包括具有选自下列平均分子量的PEG分子：约5kDa、约10kDa、约12kDa、或约20kDa。在某些实施方案中，mPEG-ALD的醛基可以是乙醛、丙醛或丁醛等。
在一个实施方案中，IL-2变体的衍生物，相比于成熟野生型人IL-2具有延长的血清半衰期。
缀合物
第三方面，本公开提供一种缀合物，其包含第一组件和第二组件；其中第一组件直接缀合至(或通过接头间接缀合至)第二组件；第一组件是本公开的IL-2变体(或其衍生物)；第二组件不是IL-2，不是IL-2变体(或其衍生物)。
一些实施方案中，IL-2变体(或其衍生物)连接于至少一个第二组件。
一些实施方案中，IL-2变体(或其衍生物)通过肽键和第二组件形成融合蛋白。
一些具体的实施方案中，IL-2变体(或其衍生物)缀合至(或通过接头间接缀合至)第二组件的羧基端。
一些具体的实施方案中，IL-2变体(或其衍生物)缀合至(或通过接头间接缀合至)第二组件的氨基端。
一些实施方案中，第二组件为抗原结合组件。抗原结合组件指：特异性结合表位的多肽分子。
在一些实施方案中，抗原结合组件能指导与其连接的部分(例如，本公开的IL-2、其变体或衍生物)到达靶位点(例如到达肿瘤细胞或具有抗原决定簇的肿瘤间质)。所述抗原结合组件可以是抗体或抗原结合片段。
抗体在本文中以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，只要它们展现出抗原结合活性，所述抗体包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗原结合片段。抗体可以包括鼠源抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、骆驼抗体。
一些具体实施方案中，抗体或其抗原结合片段选自：包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区的多肽复合物、Fab、Fv、sFv、F(ab’)2、线性抗体、单链抗体、scFv、sdAb、sdFv、纳米抗体、肽抗体(peptibody)、结构域抗体和多特异性抗体(双特异性抗体、diabody、triabody和tetrabody、串联二-scFv、串联三-scFv)。
一些实施方案中，IL-2变体(或其衍生物)连接于超过一个抗原结合组件时，每个抗原结合组件可以独立地选自抗体和抗原结合片段；例如，第一抗原结合组件可以是Fab分子，而第二抗原结合组件可以是scFv分子。例如，第一抗原结合组件可以是scFv分子，而第二抗原结合组件也是scFv分子。一些实施方案中，第一和第二抗原结合组件独立地针对不同的抗原或针对同一抗原。一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段靶向肿瘤抗原。
一些实施方案中，肿瘤抗原例如但不限于：MAGE家族(如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2、MAGE-B2、MAGE-Xp3、MAGE-B3、MAGE-Xp4、MAGE-B4、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、GAGE家族(如GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、MART-1/Melan-A、gp75、gp100、DPPIV、ADAbp、亲环素(cyclophilin)、CEA、CAP-1、CAP-2、etv6、aml1、PSA(PSA-1、PSA-2和PSA-3)、PSMA、T细胞受体、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-胎蛋白、E-钙粘蛋白、α-连环蛋白(catenin)、β-连环蛋白、γ-连环蛋白、p120ctn、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、SSX-1、SSX-2、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1、CT-7。
药物组合物
第四方面，本公开提供一种药物组合物，其含有根据本公开的IL-2变体(或其衍生物)、或缀合物，任选地可包含药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。所述药物组合物可以为冻干制剂或可注射溶液。
在一些具体实施方案中，药物组合物单位计量中可含有0.01重量％至99重量％的IL-2变体(或其衍生物)或缀合物；或药物组合物单位剂量中含有的IL-2变体(或其衍生物)或缀合物的量为0.1-2000mg(例如1-1000mg；1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、5、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000mg)。
多核苷酸
第五方面，本公开提供编码本公开的IL-2变体(或其衍生物)的多核苷酸。
技术人员理解，编码相同氨基酸序列的核苷酸序列可以不同，由于密码子的兼并性和不同宿主的密码子偏好性，不同的核苷酸序列能够编码相同的氨基酸序列，这些序列均属于本公开的范畴内。
表达载体
第六方面，本公开提供一种表达载体，其含有根据本公开的多核苷酸。表达载体可以是真核表达载体、原核表达载体或穿梭表达载体。
宿主细胞
第七方面，本公开提供一种宿主细胞，其包含根据本公开的表达载体、或表达根据本公开的IL-2变体、或表达根据本公开的缀合物。
一些实施方案中，宿主细胞包含(如已被转化或转染有)表达载体，所述表达载体包含根据本公开的多核苷酸。
一些实施方案中，所述宿主细胞是原核或真核细胞。
一些具体实施方案中，宿主细胞为细菌、酵母菌或哺乳动物细胞，具体可以为巴斯德毕赤酵母或酿酒酵母。
一些具体实施方案中，宿主细胞是原核微生物(如大肠杆菌)。
一些具体实施方案中，宿主细胞真核生物细胞。
一些实施方案中，使用表达糖基化多肽的宿主细胞，例如植物和昆虫细胞。脊椎动物细胞也可以用作宿主细胞，例如，悬浮生长的哺乳动物细胞系、猴肾CV1系(COS-7)、人胚胎肾系(293或293T细胞)、幼仑鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞)、猴肾细胞(CV1)、VERO-76、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、buffalo大鼠肝细胞(BRL3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳房肿瘤细胞(MMT060562)、MRC5细胞、FS4细胞、CHO细胞、骨髓瘤细胞系(如YO、NS0、P3X63和Sp2/0)。
用途、治疗方法
第八方面，本公开提供根据本公开的IL-2变体(或其衍生物)、缀合物、药物组合物的制药用途。
一些实施方案中，提供了IL-2变体(或其衍生物)用于治疗增生性疾病、免疫性疾病、调节T细胞介导的免疫应答、刺激个体免疫系统的用途。
一些实施方案中，所述增生性疾病可以是肿瘤或癌(例如转移性肿瘤或癌)，可以是实体瘤。
一些实施方案中，本公开的IL-2变体(或其衍生物)、缀合物、药物组合物可用于治疗刺激宿主的免疫系统(特别是增强细胞免疫应答)。
一些实施方案中，增强细胞免疫应答可以包括但不限于：T细胞功能升高、B细胞功能升高、淋巴细胞功能的恢复、IL-2受体表达提高、T细胞应答性提高、天然杀伤细胞活性或淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞活性升高。
一些实施方案中，本公开的IL-2变体(或其衍生物)、缀合物、药物组合物用于治疗增殖性病症(例如癌症)。癌症的非限制性例子包括膀胱癌、脑癌、头和颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血液癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌和肾癌。
一些实施方案中，本公开的IL-2变体(或其衍生物)、缀合物、药物组合物用于治疗位于以下位置的赘生物：腹部、骨、乳房、消化系统、肝、胰、腹膜、内分泌腺(肾上腺、副甲状腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头和颈、神经系统(中枢和外周)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾、胸部、和泌尿生殖系统。
一些实施方案中，本公开的IL-2变体(或其衍生物)、缀合物、药物组合物用于治疗癌前状况或癌症转移。癌症选自以下：肾细胞癌、皮肤癌、肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、脑癌、头和颈癌。
一些实施方案中，本公开的IL-2变体(或其衍生物)、缀合物、药物组合物用于治疗：高丙种球蛋白血症(hypergammaglobulinemia)、淋巴增生性病症、病变蛋白血症(paraproteinemias)、紫癜(purpura)、结节病、塞扎里综合征(Sezary Syndrome)、Waldenstron's巨球蛋白血症、高歇氏病(Gaucher's Disease)、组织细胞增多病(histiocytosis)。
一些实施方案中，本公开的IL-2变体(或其衍生物)、缀合物、药物组合物用于治疗自身免疫疾病、移植排斥、外伤后免疫应答和传染性疾病。
一些实施方案中，自身免疫性疾病可以是选自：I型糖尿病(type I diabetesmellitus)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、多发性硬化症(multiplesclerosis)、慢性胃炎(chronic gastritis)、克罗恩病(Crohn’s disease)、巴塞多病(Basedow disease)、别赫捷列夫病(Bechterew disease)、银屑病(psoriasis)、重症肌无力(myasthenia gravis)、自身免疫肝炎(autoimmune hepatitis)、APECED、变应性肉芽肿血管炎(Chrug-Strauss syndrome)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、肾小球肾炎(glomerulonephritis)、吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barrésyndrome)、桥本甲状腺炎(Hashimoto thyroiditis)、硬化萎缩性苔藓(lichen sclerosus)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematodes)、PANDAS、风湿热(rheumatic fever)、结节病(sarcoidosis)、舍格伦综合征(syndrome)、僵人综合症(Stiff-Man syndrome)、硬皮病(scleroderma)、韦格纳肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)、白斑(vitiligo)、自身免疫性肠病(autoimmune enteropathy)、肺出血肾炎综合征(Goodpasturesyndrome)、皮肌炎(dermatomyositis)、多发性肌炎(polymyositis)、自身免疫性过敏症(autoimmuneallergy)、哮喘(asthma)。
在一些实施方案中，IL-2变体(或其衍生物)可以与免疫抑制剂联用。
一些实施方案中，免疫抑制剂选自：糖皮质激素(glucocorticoid)；硫唑嘌呤(azathioprine)；环孢素A(cyclosporin A)；吗替麦考酚酯(mycophenolatemofetil)；他克莫司(tacrolimus)；抗CD3抗体；抗CD25抗体；抗TNF-α抗体；甲氨蝶呤(methotrexate)；环孢素(cyclosporin)；西罗莫司(sirolimus)；依维莫司(everolimus)；芬戈莫德(fingolimod)；以及环磷酰胺(cyclophosphamide)。
在一些实施方案中，向受试者施用治疗有效量的：本公开的IL-2变体(或其衍生物)、缀合物、药物组合物。
一些实施方案中，需要治疗的受试者(如患者或个体)通常为哺乳动物，例如人。
一些实施方案中，每日至少2次、每日至少1次、每48小时至少1次、每72小时至少一次、每周至少一次、每2周至少一次、每个月至少一次、每2个月至少一次、或每3个月至少一次向受试者施用本公开的IL-2变体(或其衍生物)、缀合物、药物组合物。
一些实施方案中，通过任何途径施用本公开的IL-2变体(或其衍生物)、缀合物、药物组合物。例如，通过肠胃外注射(例如，皮下、静脉注射)施用。
附图说明
图1.野生型人IL-2和IL-2受体α的相互作用曲线。
图2.IL-2变体和IL-2受体α的相互作用曲线。
图3.野生型人IL-2和IL-2Rβ/γ的相互作用曲线。
图4.IL-2变体和IL-2Rβ/γ的相互作用曲线。
具体实施方式
以下结合实施例用于进一步描述本公开，但这些实施例并非限制本公开的范围。
实施例1.野生型人IL-2及IL-2变体的重组表达与制备
合成、表达和纯化IL-2变体的核酸序列。
1.采用密码子优化软件MaxCodonTM Optimization Program V13对编码野生型人IL-2及变体的序列进行优化。合成用全基因，并通过双酶切法将IL2的编码序列亚克隆到表达载体pcDNA3.1中；通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性，最终转到DH5α克隆菌株中。通过质粒提取试剂盒提取转染级质粒，将质粒通过转染试剂转染到哺乳动物细胞HEK293中进行瞬时表达，通过亲和层析纯化IL2蛋白。
2.质粒转化DH5α
吸取含有IL2编码序列的表达质粒80-100ng加入已制备的DH5α感受态细胞中。将加入质粒后的感受态细胞通过热激进行转化。
将转化后的感受态细胞加入LB液体培养基，放入摇床37℃，200rpm震荡培养约30min。将培养后的感受态细胞取出，吸取部分悬液涂在含有氨苄抗性的平板上，放入培养箱37℃过夜培养。
从新鲜的培养板中挑取单克隆于2-5mL LB培养基，37℃ 200rpm培养8h。按1/500比例接种于200mL LB培养基中，37℃ 200rpm培养16h。收集培养后的菌液离心，去掉上清。
3.HEK293细胞复苏与传代
将水浴调节至37℃；培养基在37℃预热。
从液氮罐中取出HEK293细胞，立即投入37℃水浴中，轻微摇动使其快速融化(约1min)。
用75％乙醇消毒管外壁，放入生物安全柜内；将细胞转移到含10mL培养基的15mL离心管中，离心800rpm 5min。离心后的细胞去掉上清，取少许新鲜培养基重悬细胞，再转移到培养瓶中；加入新鲜培养基轻轻摇动，使细胞分散均匀，取细胞计数及活力检测。使密度控制在3×105至4×105细胞/mL，活力>95％。
将细胞置于培养箱中110rpm，37℃5％CO2培养。细胞培养2-3天，密度达到2.0×106/mL时，通过补加新鲜培养基对细胞进行传代。对细胞密度及活力检测进行监测。
4.质粒转染HEK293细胞
转染前1天，将HEK293细胞悬浮培养至1L，接种密度为1×106/mL，置于培养箱中110rpm，37℃ 5％CO2培养。转染当天，使细胞密度控制在1×106/mL至1.5×106/mL。
DNA-转染试剂混合物：向转染缓冲液中加入DNA和转染试剂混匀，37℃温育。将DNA-转染试剂混合物加入待转染细胞中，放入培养箱中110rpm，37℃ 5％CO2培养。转染后约4-6天，取出细胞培养物，离心，收集上清和细胞。
5.蛋白纯化
取培养5天后的细胞培养液，离心后取上清用0.22μm滤器进行过滤。在4℃下对缓冲液1×PBS pH7.4进行透析。透析结束后，用Ni-IDA柱进行纯化，获得目的蛋白。
实施例2.测定野生型人IL-2及变体IL-2对IL-2Rα的亲和力
通过Octet检测实施例1中获得的野生型人IL-2及其变体IL-2对IL-2Rα的结合特性。Octet平台是基于生物膜干涉技术(Bio-Layer Interferometry,BLI)对生物分子相互作用进行检测分析。
1.实验仪器及试剂耗材
Octet RED96e system(Pall Fortebio Corp,Menlo Park,CA)；
分析缓冲液SD Buffer(PBS(pH 7.4)+0.01％BSA+0.02％Tween20)；
醋酸缓冲液(10mM，pH4.0、5.0、6.0)；
AR2G(Fortebio，货号：18-5092)；
96-孔板(Greiner Bio-One part no.655209)；
2.参考下面的实验设计进行实验，整个实验是在1000rpm，30℃，220μl/孔的条件下完成。
待测物样品为：IL-2RA(即IL-2受体α)，稀释缓冲液为SD Buffer；
待测物浓度范围为：1000nM、500nM、250nM、125nM、62.5nM。
3.实验数据及处理
通过Data Analysis software 9.0对实验数据进行处理。拟合模型选择1:1模型，即1个野生型人IL-2或IL-2变体(具体为IL-2-1变体)结合1个IL-2RA。拟合方式为global；即把5个浓度作为一组进行分析。拟合结果参见图1。
实验得到的数据以1:1binding模型进行拟合，得出实施例1中野生型人IL-2或IL2变体对低亲和力受体IL-2Rα的亲和力数值。
根据相互作用曲线图1，野生型人IL-2与IL-2RA间的相互作用动力学实验数据，可以看出随着待测物的浓度增加，实验数据中结合信号(Response)数值有明显的统计学正相关性。因此，判定野生型人IL-2与IL-2RA间有相互作用。
根据相互作用曲线图2，IL-2-1变体同IL-2RA间的相互作用动力学实验数据，可以看出随着待测物的浓度增加，实验数据中结合信号的数值无明显的统计学正相关性。因此，判定IL-2-1变体同IL-2RA间的相互作用降低或缺失。
IL-2-1(-M)、IL-2-2、IL-2-3、IL-2-4、IL-2-5、IL-2-6、IL-2-7、IL-2-2(-M)、IL-2-3(-M)、IL-2-4(-M)、IL-2-5(-M)、IL-2-6(-M)、IL-2-7(-M)同IL-2RA间无相互作用(曲线未显示)。
实施例3.野生型人IL-2及IL-2变体对IL-2Rβ/γ的亲和力测定
通过Octet实验来检测实施例1中野生型人IL-2及其变体对IL-2Rβ/γ的亲和力。
1.实验仪器及试剂耗材
Octet RED96e system(Pall Fortebio Corp,Menlo Park,CA)；
分析缓冲液SD Buffer(PBS(pH 7.4)+0.01％BSA+0.02％Tween20)；
醋酸缓冲液(10mM，pH4.0、5.0、6.0)；
AR2G(Fortebio，货号：18-5092)；
96-孔板(Greiner Bio-One part no.655209)。
对IL-2Rβ和IL-2Rγ亚基分别进行克隆、融合到Fc hole和Fc knob上，用于制备IL-2Rβ/γ-Fc异源二聚体。IL-2Rβ-Fc-hole和IL-2Rγ-Fc-knob同时转染到HEK293细胞中。异源二聚体用Protein A和分子筛Superdex 200纯化。
2.整个实验是在1000rpm，30℃，220μl/孔条件下完成。
待测物样品为IL-2Rβ/γ，稀释缓冲液为SD Buffer。待测物浓度范围为1000nM、500nM、250nM、125nM、62.5nM。
3.实验数据及处理
通过Data Analysis software 9.0对实验数据进行处理。拟合模型选择1:1模型，即1个野生型人IL-2或IL-2变体(IL-2-1)结合1个IL-2Rβ/γ。拟合方式global，即把5个浓度作为一组进行分析。拟合结果如图3。
实验得到的数据以1:1binding模型进行拟合，得出实施例1中野生型人IL-2或IL2变体与中亲和力受体IL-2Rβ/γ的亲和力数值。
根据相互作用曲线图3，野生型人IL-2与IL-2Rβ/γ间的相互作用动力学实验数据，可以看出随着待测物的浓度增加，实验数据中结合信号的数值有明显的统计学正相关性。因此，判定野生型人IL-2与IL-2Rβ/γ间有相互作用。
根据相互作用曲线图4，IL-2变体与IL-2Rβ/γ间的相互作用动力学实验数据，可以看出随着待测物的浓度增加，实验数据中结合信号的数值有明显的统计学正相关性。因此，判定IL-2变体与IL-2Rβ/γ之间相互作用维持。
IL-2-1(-M)、IL-2-2、IL-2-3、IL-2-4、IL-2-5、IL-2-6、IL-2-7、IL-2-2(-M)、IL-2-3(-M)、IL-2-4(-M)、IL-2-5(-M)、IL-2-6(-M)、IL-2-7(-M)同IL-2Rβ/γ间维持了相互作用(曲线未显示)。
序列表
<110> 西安龙腾景云生物科技有限公司
<120> 一种人白细胞介素2变体及其用途
<130> 310279CG-310195
<150> 2021108684095
<151> 2021-07-30
<160> 17
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