基于ugi反应合成的非天然肽类idh1抑制剂及其制法和应用
阅读说明：本技术 基于ugi反应合成的非天然肽类idh1抑制剂及其制法和应用 (Non-natural peptide IDH1 inhibitor synthesized based on UGI reaction and preparation method and application thereof ) 是由 李华 陈丽霞 周宜荣 郑梦竹 周雪琛 于 2021-11-04 设计创作，主要内容包括：一种基于UGI反应合成的非天然肽类IDH1抑制剂及其制法和应用,属于化学生物学技术领域。涉及了通式I所示的基于UGI反应合成的非天然肽类IDH1抑制剂,或其药学上可接受的盐、水合物或前药；以及含有该基于UGI反应合成的非天然肽类IDH1抑制剂的药物组合物,该基于UGI反应合成的非天然肽类新型IDH1抑制剂可与IDH1突变的蛋白结合,抑制IDH1突变酶的活性,减少细胞内2-HG的生成,用于治疗肿瘤和/或其他疾病。其中,通式I中的R～(1)、R～(2)、R～(3)和R～(4)如权利要求书和说明书所述。(An unnatural peptide IDH1 inhibitor synthesized based on UGI reaction, a preparation method and application thereof, belonging to the technical field of chemical biology. Relates to a non-natural peptide IDH1 inhibitor synthesized based on UGI reaction, or pharmaceutically acceptable salt, hydrate or prodrug thereof, which is shown in the general formula I; and pharmaceutical composition containing the UGI reaction-based synthetic non-natural peptide IDH1 inhibitor, and the UGI reaction-based synthetic non-natural peptide novel IThe DH1 inhibitor can bind with IDH1 mutant protein, inhibit activity of IDH1 mutant enzyme, reduce intracellular 2-HG production, and can be used for treating tumor and/or other diseases. Wherein R in the general formula I 1 、R 2 、R 3 And R 4 As described in the claims and specification.)
技术领域
本发明涉及新型IDH1抑制剂的合成，属于化学生物学技术领域。本发明具体涉及了一种基于UGI反应合成的非天然肽类IDH1抑制剂及其制法和应用。该基于UGI反应合成的非天然肽类新型IDH1抑制剂可与IDH1突变的蛋白结合，抑制IDH1突变酶的活性，减少细胞内2-HG的生成，用于治疗肿瘤和/或其他疾病。
背景技术
异柠檬酸脱氢酶(IDH)是三羧酸循环中催化异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸(α-KG)的关键性限速酶。同源的IDH1和IDH2分别位于细胞质的过氧化物酶体和线粒体中，结构相似，均依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADP+)。异柠檬酸脱氢酶的三个精氨酸残基发生的点突变(IDH1/R132、IDH2/R140和IDH2/R172)可导致低度胶质瘤、继发性胶质瘤、胶质母细胞瘤、急性骨髓性白血病(AML)和软骨肉瘤等的发生。其中，IDH1的132位精氨酸突变在胶质瘤中很常见(高达70％的继发性胶质瘤)。在AML病例中，10.9％的患者发现IDH1突变，12.1％的患者发现IDH2突变。
IDH1和IDH2的点突变使该酶具有催化NADPH依赖性的α-酮戊二酸还原为2-羟基戊二酸(2-HG)的新功能。2-HG已被证明是许多α-KG依赖的双加氧酶的抑制剂，包括引起广泛的组蛋白高甲基化的组蛋白脱甲基酶。组蛋白的甲基化状态会抑制细胞分化，而分化的缺乏是癌细胞的重要标志。在肿瘤细胞中观察到高浓度的2-HG，表明2-HG通过诱导表观遗传学变化促进癌症的发生。同时，2-HG还通过激活参与缺氧诱导信号通路的α-酮戊二酸依赖性HIF脯氨酸4-羟化酶(EGLN)来促进肿瘤基因转化。研究发现，IDH1突变体诱导的细胞内α-KG水平降低，导致HIF-1α在细胞内积累，从而诱导血管生成，介导肿瘤细胞的逃逸和转移(参考文献：Y.Dong,G.DIMOPOULOS,Glioma-derived mutations in IDH1 dominantlyinhibit IDH1catalytic activity and induce HIF-1a,J Biol Chem.284(15)(2009)9835–9844.)。
FDA于2018年批准了Agios Pharmaceuticals的Ivosidenib(AG-120)，用于治疗IDH1突变的复发/难治性AML(R/R AML)，而该AG-120制备方法繁琐，成本高，所用的原料均不能市场直接购买获得，需要多步合成制备。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供了一种基于UGI反应合成的非天然肽类IDH1抑制剂及其制法和应用，本发明通过设计并合成了一系列线性非天然肽类似物作为AG-120的类似物，用环己基代替了末端位置不可接触的二氟化环丁基，而焦谷氨酸部分则由丙氨酸代替，作为强效的突变IDH1抑制剂，可以靶向IDH1突变酶的非天然肽类IDH1抑制剂，为IDH1突变介导肿瘤和/或其他疾病提供非常有潜力的治疗方案。
本发明提供了如以下通式I所示的基于UGI反应合成的非天然肽类IDH1抑制剂，或其药学上可接受的盐、水合物或前药：
其中：R1选自环烷烃，叔丁基，苄基中的一种；R2选自环烷烃，取代苯基，萘基，噻吩，吡咯，吲哚基中的一种；R3选自环烃基，叔丁基，取代苯基，萘基，吡啶基中的一种；R4选自氢，烷烃，卤代烷烃，烯基，炔基，芳烃，杂环芳基中的一种。
本发明优选的基于UGI反应合成的非天然肽类IDH1抑制剂包括，但不限于以下结构：
通式I所示的基于UGI反应合成的非天然肽类IDH1抑制剂可以含有不对称或手性中心，因此可以以不同立体异构形式存在。本发明化合物的所有立体异构形式，包括但不限于非对映异构体、对映异构体和阻转异构体以及他们的混合物，如外消旋物，均包括在本发明的范围内。
根据本发明，基于UGI反应合成的非天然肽类IDH1抑制剂的药学上可接受的盐包括与下列酸或酸成盐形成的加成盐：所述的酸为盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、丙酸、乳酸、三氟乙酸、马来酸、柠檬酸、富马酸、草酸、酒石酸、苯甲酸中的一种或几种。酸成盐为盐酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、马来酸、苯磺酸、琥珀酸以及类似的已知可以接受的酸成盐的一种或几种。
此外，本发明还包括本发明基于UGI反应合成的非天然肽类IDH1抑制剂的前药。本发明基于UGI反应合成的非天然肽类IDH1抑制剂的前药是通式I的衍生物，它们自身可能具有较弱的活性甚至没有活性，但是在给药后，在生理条件下(如通过代谢、溶剂分解或另外的方式)被转化成相应的生物活性形式。
其中，所述的基于UGI反应合成的非天然肽类IDH1抑制剂的制备方法如下：
步骤：将当量的醛类化合物和胺类化合物加入甲醇溶剂中，室温搅拌均匀，优选为0.5小时，之后再加入当量的羧酸和异氰化合物，继续室温搅拌2-10小时，产物析出，抽滤洗涤，即可得到纯净的基于UGI反应合成的非天然肽类IDH1抑制剂。
一种药物组合物，含有治疗有效量的基于UGI反应合成的非天然肽类IDH1抑制剂作为活性成分。
所述的药物组合物，还包括上述任意一项基于UGI反应合成的非天然肽类IDH1抑制剂的药学上可接受的盐、水合物、前药以及药学上可接受的载体、稀释剂、辅剂、媒介物或它们的组合。
其中，所述的药物组合物的剂型为注射剂、片剂和胶囊剂中的任意一种。
上述的基于UGI反应合成的非天然肽类IDH1抑制剂及其药学上可接受的盐或上述的药物组合物在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用。
其中，所述肿瘤为多发性骨髓瘤、胃癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、结肠癌、髓母细胞瘤、急性髓细胞性白血病、慢性白血病、黑色素瘤、前列腺癌、肝细胞瘤、肾细胞瘤、宫颈癌、皮肤癌、卵巢癌、结肠癌、神经胶质瘤、甲状腺癌和胰腺癌任意一种。
本发明的基于UGI反应合成的非天然肽类IDH1抑制剂及其制法和应用，其有益效果是：
通过Ugi反应设计合成了一系列线性非自然肽类似物(1-80)，并评估了其潜在的IDH1突变体抑制作用和细胞毒性。SAR研究表明，末端炔基能显著提高细胞毒性，强的吸电子基团如硝基和氰基具有良好的酶抑制活性和细胞毒性。进一步研究发现，线性非自然肽类似物69具有较强的选择性酶抑制活性，并与突变体IDH1具有较强的结合亲和力。通过选择性抑制IDH1突变体的活性，可降低细胞内2-HG的浓度，抑制HT1080和IDH1突变的U-87细胞的增殖。此外，研究发现，AG-120和AGI-5198对实体肿瘤细胞的生长没有明显的抑制作用，但可以很好地清除细胞中的2-HG。本研究合成的化合物线性非自然肽类似物69不仅选择性抑制突变型IDH1酶的活性，而且对HT1080细胞和IDH1突变的U-87细胞均有较好的抑制作用。这一优势有助于开发IDH1抑制剂治疗实体瘤。
总的来说，本发明通过体外酶活性，结合力，细胞活性综合评价合成化合物的IDH1突变酶抑制活性，最终找到强有效的IDH1突变酶抑制剂69，为IDH1突变介导的肿瘤和/或其他疾病的治疗，提供新的治疗方式。
附图说明
图1为本发明的AG-120,线性非自然肽类似物43,线性非自然肽类似物71,线性非自然肽类似物69对野生型和突变型IDH1的IC50；
图2线性非自然肽类似物69的酶动力学研究的最佳拟合模型，其中，A,B使用Michaelis-Menten图和Lineweaver-Burk图揭示69与底物α-KG显非竞争性抑制模型；C,D使用Michaelis-Menten图和Lineweaver-Burk图揭示69与NADPH显非竞争性抑制模型；
图3线性非自然肽类似物43,线性非自然肽类似物71,线性非自然肽类似物69对于HT1080的细胞毒IC50；
图4线性非自然肽类似物43,线性非自然肽类似物71,线性非自然肽类似物69对于IDH mutant U87的细胞毒IC50；
图5用线性非自然肽类似物43,线性非自然肽类似物71,线性非自然肽类似物69处理24小时后，对突变体IDH1酶的有效抑制导致细胞内2-HG的产生减少；
图6用线性非自然肽类似物69处理细胞，用Annexin V-FITC/PI双重染色，然后用流式细胞仪检测IDH1-mutant-U-87细胞细胞周期分布及凋亡情况；图A、图B为用流式细胞仪分析IDH1-mutant-U-87细胞的细胞周期分布，图C、图D为通过Annexin V/PI染色分析IDH1-mutant-U-87细胞的细胞凋亡情况；
图7在标准处理的毛细血管中，通过MST测量AG-120(图A)、线性非自然肽类似物43(图B)、线性非自然肽类似物69(图C)、线性非自然肽类似物71(图D)与IDH1R132H的亲和力，根据结合曲线，计算出Kd值；
具体实施方式
通过实施例对本发明做进一步的说明。但不应理解为本发明的范围仅限于以下实施例。
实施例1-4线性非自然肽类似物1-4的合成
实施例1反应式：
将2-甲基苯甲醛(60mg，0.5mmol)溶解于2mL甲醇中，搅拌条件下，依次加入1.0当量的3-氟苯胺室温搅拌0.5小时，之后再加入1.0当量的甲酸和环己基异氰，继续室温搅拌2-10小时，产物析出，抽滤洗涤，即可得到纯净的得白色固体线性非自然肽类似物1，产率39％。通过核磁检测，确证1结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C22H25FN2NaO2calcd:391.1792,found:391.1785。
实施例2反应式：
同实施例1，不同之处在于，采用乙酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物2，产率49％。通过核磁检测，确证2结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C23H27FN2NaO2calcd:405.1949,found:405.1936。
实施例3反应式
同实施例1，不同之处在于，采用丙酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物3，产率22％。通过核磁检测，确证3结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C24H29FN2NaO2calcd:419.2105,found:419.2108。
实施例4反应式：
同实施例1，不同在于，采用丁酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物4，产率50％。通过核磁检测，确证4结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C25H31FN2NaO2 calcd:433.2262,found:433.2262。
实施例5线性非自然肽类似物5的合成
同实施例1，不同为采用苯丙酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物5，产率64％。通过核磁检测，确证5结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C30H33FN2NaO2 calcd:495.2418,found:495.2410。
实施例6线性非自然肽类似物6的合成
同实施例1，不同之处在于，采用己二酸单甲酯替代甲酸，得到线性非自然肽类似物6，产率25％。通过核磁检测，确证6结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+forC28H35FN2NaO4calcd:505.2473,found:505.2467。
实施例7线性非自然肽类似物7的合成
同实施例1，不同之处在于，采用N-Boc氨基乙酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物7，产率60％。通过核磁检测，确证7结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+forC28H36FN3NaO4 calcd:520.2582,found:520.2586。
实施例8线性非自然肽类似物8的合成
同实施例1，不同之处在于，采用2苯硫醚乙酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物8，产率79％。通过核磁检测，确证8结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+forC29H31FN2NaO2S calcd:513.1982,found:513.1977。
实施例9-11线性非自然肽类似物9-11的合成
实施例9的反应式：
同实施例1，不同在于，采用氯乙酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物9，产率48％。通过核磁检测，确证9结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C23H26ClFN2NaO2calcd:439.1559,found:439.1563。
实施例10的反应式：
同实施例1，不同在于，采用溴乙酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物10，产率69％。通过核磁检测，确证10结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C23H26BrFN2NaO2calcd:483.1054,found:483.1058。
实施例11的反应式：
同实施例1，不同在于，采用碘乙酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物11，产率74％。通过核磁检测，确证11结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C23H26FIN2NaO2calcd:531.0915,found:531.0931。
实施例12-14线性非自然肽类似物12-14的合成
实施例12的反应式：
同实施例1，不同在于，采用氯丙酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物12，产率74％。通过核磁检测，确证12结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C24H28ClFN2NaO2calcd:453.1716,found:453.1706。
实施例13的反应式：
同实施例1，不同在于，采用溴丙酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物13，产率72％。通过核磁检测，确证13结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C24H28BrFN2NaO2calcd:497.1210,found:497.1214。
实施例14的反应式：
同实施例1，不同在于，采用碘丙酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物14，产率75％。通过核磁检测，确证14结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C24H28FIN2NaO2calcd:545.1072,found:545.1082。
实施例15-16线性非自然肽类似物15-16的合成
实施例15的反应式：
同实施例1，不同在于，采用氯丁酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物15，产率71％。通过核磁检测，确证15结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C25H30ClFN2NaO2calcd:467.1872,found:467.1887。
实施例16的反应式：
同实施例1，不同在于，采用溴丁酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物16，产率62％。通过核磁检测，确证16结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C25H30BrFN2NaO2calcd:511.1367,found:511.1380。
实施例17-18线性非自然肽类似物17-18的合成
实施例17的反应式：
同实施例1，不同在于，采用三氯乙酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物17，产率12％。通过核磁检测，确证17结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C23H24Cl3FN2NaO2calcd:507.0780,found:507.0784。
实施例18的反应式：
同实施例1，不同在于，采用二氟乙酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物18，产率62％。通过核磁检测，确证18结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C23H25F3N2NaO2calcd:441.1760,found:441.1774。
实施例19-22线性非自然肽类似物19-22的合成
实施例19的反应式：
同实施例1，不同在于，采用丙炔酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物19，产率19％。通过核磁检测，确证19结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C24H25FN2NaO2calcd:415.1792,found:415.1795。
实施例20的反应式：
同实施例1，不同在于，采用丁炔酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物20，产率67％。通过核磁检测，确证20结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C25H27FN2NaO2calcd:429.1949,found:429.1958。
实施例21的反应式：
同实施例1，不同在于，采用戊炔酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物21，产率48％。通过核磁检测，确证21结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C26H29FN2NaO2calcd:443.2105,found:443.2105。
实施例22的反应式：
同实施例1，不同在于，采用庚炔酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物22，产率66％。通过核磁检测，确证22结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C28H33FN2NaO2calcd:471.2418,found:471.2418。
实施例23线性非自然肽类似物23的合成
同实施例1，不同在于，采用2-丁炔酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物23，产率49％。通过核磁检测，确证23结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C25H27FN2NaO2calcd:429.1949,found:429.1950。
实施例24线性非自然肽类似物24的合成
同实施例1，不同之处在于，采用2-甲基丙烯酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物24，产率34％。通过核磁检测，确证24结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+forC25H29FN2NaO2 calcd:431.2105,found:431.2111。
实施例25线性非自然肽类似物25的合成
同实施例1，不同在于，采用2丁烯酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物25，产率11％。通过核磁检测，确证25结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C25H29FN2NaO2calcd:431.2105,found:431.2118。
实施例26线性非自然肽类似物26的合成
同实施例1，不同在于，采用肉桂酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物26，产率68％。通过核磁检测，确证26结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C30H31FN2NaO2calcd:493.2262,found:493.2259。
实施例27线性非自然肽类似物27的合成
同实施例1，不同在于，采用吲哚-3-乙酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物27，产率62％。通过核磁检测，确证27结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+forC31H32FN3NaO2calcd:520.2371,found:520.2375。
实施例28线性非自然肽类似物28的合成
同实施例1，不同在于，采用吲哚-2甲酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物28，产率71％。通过核磁检测，确证28结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+forC30H30FN3NaO2calcd:506.2214,found:506.2215。
实施例29线性非自然肽类似物29的合成
同实施例1，不同在于，采用N-甲基吲唑-3-甲酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物29，产率65％。通过核磁检测，确证29结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+forC30H31FN4NaO2 calcd:521.2323,found:521.2320。
实施例30线性非自然肽类似物30的合成
同实施例1，不同在于，采用噻吩-3-甲酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物30，产率60％。通过核磁检测，确证30结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+forC26H27FN2NaO2Scalcd:473.1669,found:473.1665。
实施例31线性非自然肽类似物31的合成
同实施例1，不同在于，采用2,6-二氯烟酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物31，产率70％。通过核磁检测，确证31结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+forC27H26Cl2FN3NaO2 calcd:536.1278,found:536.1279。
实施例32线性非自然肽类似物32的合成
同实施例1，不同在于，采用4-甲氧基苯甲酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物32，产率65％。通过核磁检测，确证32结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+forC29H31FN2NaO3 calcd:497.2211,found:497.2220。
实施例33线性非自然肽类似物33的合成
同实施例1，不同在于，采用4-硝基苯甲酸替代甲酸，得到线性非自然肽类似物33，产率75％。通过核磁检测，确证33结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+forC28H28FN3NaO4calcd:512.1956,found:512.1968。
实施例34线性非自然肽类似物34的合成
同实施例19，不同在于，采用4-氟苯胺替代3-氟苯胺，得到线性非自然肽类似物34，产率21％。通过核磁检测，确证34结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+forC24H25FN2NaO2 calcd:415.1792,found:415.1790。
实施例35线性非自然肽类似物35的合成
同实施例19，不同在于，采用4-氯苯胺替代3-氟苯胺，得到线性非自然肽类似物35，产率59％。通过核磁检测，确证35结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+forC24H25ClN2NaO2 calcd:431.1497,found:431.1491。
实施例36线性非自然肽类似物36的合成
同实施例19，不同在于，采用4-溴苯胺替代3-氟苯胺，得到线性非自然肽类似物36，产率69％。通过核磁检测，确证36结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+forC24H25BrN2NaO2 calcd:475.0992,found:477.0990。
实施例37线性非自然肽类似物37的合成
同实施例19，不同在于，采用4-碘苯胺替代3-氟苯胺，得到线性非自然肽类似物37，产率28％。通过核磁检测，确证37结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+forC24H25IN2NaO2 calcd:523.0853,found:523.0853。
实施例38线性非自然肽类似物38的合成
同实施例19，不同在于，采用4-甲基苯胺替代3-氟苯胺，得到线性非自然肽类似物38，产率69％。通过核磁检测，确证38结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+forC25H28N2NaO2calcd:411.2043,found:411.2041。
实施例39线性非自然肽类似物39的合成
同实施例19，不同在于，采用4-甲氧基苯胺替代3-氟苯胺，得到线性非自然肽类似物39，产率30％。通过核磁检测，确证39结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+forC25H28N2NaO3 calcd:427.1992,found:427.1999。
实施例40线性非自然肽类似物40的合成
同实施例19，不同在于，采用4-叔丁基苯胺替代3-氟苯胺，得到线性非自然肽类似物40，产率31％。通过核磁检测，确证40结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+forC28H34N2NaO2 calcd:453.2512,found:453.2504。
实施例41线性非自然肽类似物41的合成
同实施例19，不同在于，采用4-N,N-二甲胺基苯胺替代3-氟苯胺，得到线性非自然肽类似物41，产率50％。通过核磁检测，确证41结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+forC26H31N3NaO2 calcd:440.2308,found:440.2315。
实施例42线性非自然肽类似物42的合成
同实施例19，不同在于，采用4-三氟甲基苯胺替代3-氟苯胺，得到线性非自然肽类似物42，产率38％。通过核磁检测，确证42结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+forC25H25F3N2NaO2 calcd:465.1760,found:465.1774。
实施例43线性非自然肽类似物43的合成
同实施例19，不同在于，采用4-硝基苯胺替代3-氟苯胺，得到线性非自然肽类似物43，产率67％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.98(d,J＝8.8Hz,2H),7.40(brs,2H),7.18–7.12(m,2H),6.92(t,J＝8.0Hz,1H),6.82(d,J＝8.0Hz,1H),6.43(s,1H),5.50(d,J＝7.6Hz,1H),3.88–3.81(m,1H),2.87(s,1H),2.41(s,3H),1.97–1.87(m,2H),1.73–1.59(m,3H),1.38–1.32(m,2H),1.19–0.98(m,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ168.1,153.1,147.5,144.4,138.0,132.0,131.6,131.0,130.3,129.6,126.6,123.6,81.6,75.8,60.9,49.4,33.0,32.9,25.6,25.1,24.9,19.5；HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C24H25N3NaO4 calcd:442.1737,found:442.1743。
实施例44线性非自然肽类似物44的合成
同实施例19，不同在于，采用4-氰基苯胺替代3-氟苯胺，得到线性非自然肽类似物44，产率48％。通过核磁检测，确证44结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+forC25H25N3NaO2calcd:422.1839,found:422.1833。
实施例45线性非自然肽类似物45的合成
同实施例19，不同在于，采用3-甲基苯胺替代3-氟苯胺，得到线性非自然肽类似物45，产率46％。通过核磁检测，确证45结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+forC25H28N2NaO2calcd:411.2043,found:411.2044。
实施例46线性非自然肽类似物46的合成
同实施例19，不同在于，采用3-甲氧基苯胺替代3-氟苯胺，得到线性非自然肽类似物46，产率83％。通过核磁检测，确证46结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+forC25H28N2NaO3 calcd:427.1992,found:427.1992。
实施例47线性非自然肽类似物47的合成
同实施例19，不同在于，采用3-三氟甲基苯胺替代3-氟苯胺，得到线性非自然肽类似物47，产率67％。通过核磁检测，确证47结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+forC25H25F3N2NaO2 calcd:465.1760,found:465.1754。
实施例48线性非自然肽类似物48的合成
同实施例19，不同在于，采用3-氨基苯甲酸甲酯替代3-氟苯胺，得到线性非自然肽类似物48，产率68％。通过核磁检测，确证48结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+forC26H28N2NaO4 calcd:455.1941,found:455.1946。
实施例49线性非自然肽类似物49的合成
同实施例19，不同在于，采用3-乙炔基苯胺替代3-氟苯胺，得到线性非自然肽类似物49，产率84％。通过核磁检测，确证49结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+forC26H26N2NaO2 calcd:421.1886,found:421.1902。
实施例50线性非自然肽类似物50的合成
同实施例19，不同在于，采用3,5-二氟苯胺替代3-氟苯胺，得到线性非自然肽类似物50，产率46％。通过核磁检测，确证50结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+forC24H24F2N2NaO2 calcd:433.1698,found:433.1690。
实施例51线性非自然肽类似物51的合成
同实施例19，不同在于，采用苯并[1,3]二氧戊环-5-胺替代3-氟苯胺，得到线性非自然肽类似物51，产率49％。通过核磁检测，确证51结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C25H26N2NaO4 calcd:441.1785,found:441.1786。
实施例52线性非自然肽类似物52的合成
同实施例19，不同在于，采用2-萘胺替代3-氟苯胺，得到线性非自然肽类似物52，产率75％。通过核磁检测，确证52结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+forC28H28N2NaO2calcd:447.2043,found:447.2027。
实施例53线性非自然肽类似物53的合成
同实施例19，不同在于，采用5-氟吡啶-3-胺替代3-氟苯胺，得到线性非自然肽类似物53，产率5％。通过核磁检测，确证53结构正确。HRMS(pos.ESI):m/z[M+H]+forC23H25N3O2calcd:394.1925,found:394.193。
实施例54线性非自然肽类似物54的合成
同实施例19，不同在于，采用环丙胺替代3-氟苯胺，得到线性非自然肽类似物54，产率80％。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C21H26N2NaO2 calcd:361.1886,found:361.1903。
实施例55线性非自然肽类似物55的合成
同实施例19，不同在于，采用叔丁胺替代3-氟苯胺，得到线性非自然肽类似物55，产率37％。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C22H30N2NaO2 calcd:377.2199,found:377.2196。
实施例56线性非自然肽类似物56的合成
同实施例43，不同在于，采用苯甲醛替代2-甲基苯甲醛，得到线性非自然肽类似物56，产率35％。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C23H23N3NaO4 calcd:428.1581,found:428.1573。
实施例57线性非自然肽类似物57的合成
同实施例43，不同在于，采用2-乙基苯甲醛替代2-甲基苯甲醛，得到线性非自然肽类似物57，产率34％。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C25H27N3NaO4 calcd:456.1894,found:456.1898。
实施例58线性非自然肽类似物58的合成
同实施例43，不同在于，采用2-氟苯甲醛替代2-甲基苯甲醛，得到线性非自然肽类似物58，产率65％。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C23H22FN3NaO4 calcd:446.1487,found:446.1486。
实施例59线性非自然肽类似物59的合成
同实施例43，不同在于，采用2-氯苯甲醛替代2-甲基苯甲醛，得到线性非自然肽类似物59，产率66％。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C23H22ClN3NaO4 calcd:462.1191,found:462.1198。
实施例60线性非自然肽类似物60的合成
同实施例43，不同在于，采用2-溴苯甲醛替代2-甲基苯甲醛，得到线性非自然肽类似物60，产率62％。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C23H22BrN3NaO4 calcd:506.0686,found:506.0690。
实施例61线性非自然肽类似物61的合成
同实施例43，不同在于，采用2-甲氧基苯甲醛替代2-甲基苯甲醛，得到线性非自然肽类似物61，产率63％。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C24H25N3NaO5 calcd:458.1686,found:458.1701。
实施例62线性非自然肽类似物62的合成
同实施例43，不同在于，采用2-三氟甲基苯甲醛替代2-甲基苯甲醛，得到线性非自然肽类似物62，产率41％。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C24H22F3N3NaO4 calcd:496.1455,found:496.1454。
实施例63线性非自然肽类似物63的合成
同实施例43，不同在于，采用4-氯苯甲醛替代2-甲基苯甲醛，得到线性非自然肽类似物63，产率60％。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C23H22ClN3NaO4 calcd:462.1191,found:462.1193。
实施例64线性非自然肽类似物64的合成
同实施例43，不同在于，采用4-溴苯甲醛替代2-甲基苯甲醛，得到线性非自然肽类似物64，产率67％。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C23H22BrN3NaO4 calcd:506.0686,found:506.0680。
实施例65线性非自然肽类似物65的合成
同实施例43，不同在于，采用4-甲氧基苯甲醛替代2-甲基苯甲醛，得到线性非自然肽类似物65，产率61％。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C24H25N3NaO5 calcd:458.1686,found:458.1683。
实施例66线性非自然肽类似物66的合成
同实施例43，不同在于，采用4-乙炔基苯甲醛替代2-甲基苯甲醛，得到线性非自然肽类似物66，产率61％。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C25H23N3NaO4 calcd:452.1581,found:452.1582。
实施例67线性非自然肽类似物67的合成
同实施例43，不同在于，采用4-炔丙氧基苯甲醛替代2-甲基苯甲醛，得到线性非自然肽类似物67，产率60％。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C26H25N3NaO5 calcd:482.1686,found:482.1688。
实施例68线性非自然肽类似物68的合成
同实施例43，不同在于，采用2,5-二甲氧基苯甲醛替代2-甲基苯甲醛，得到线性非自然肽类似物68，产率56％。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C25H27N3NaO6 calcd:488.1792,found:488.1812。
实施例69线性非自然肽类似物69的合成
同实施例43，不同在于，采用2-甲基-4-甲氧基苯甲醛替代2-甲基苯甲醛，得到线性非自然肽类似物69，产率43％。通过核磁证明，线性非自然肽类似物69结构正确，HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C25H27N3NaO5 calcd:472.1843,found:472.1847。
实施例70线性非自然肽类似物70的合成
同实施例43，不同在于，采用2,4-甲氧基苯甲醛替代2-甲基苯甲醛，得到线性非自然肽类似物70，产率77％。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C25H27N3NaO6 calcd:488.1792,found:488.1803。
实施例71线性非自然肽类似物71的合成
同实施例43，不同在于，采用1-萘甲醛替代2-甲基苯甲醛，得到线性非自然肽类似物71，产率40％。通过核磁检测，证明线性非自然肽类似物71结构正确，HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C27H25N3NaO4 calcd:478.1737,found:478.1728。
实施例72线性非自然肽类似物72的合成
同实施例43，不同在于，采用4-甲氧基-1-萘甲醛替代2-甲基苯甲醛，得到线性非自然肽类似物72，产率71％。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C28H27N3NaO5 calcd:508.1843,found:508.1836。
实施例73线性非自然肽类似物73的合成
同实施例43，不同在于，采用2-噻吩甲醛替代2-甲基苯甲醛，得到线性非自然肽类似物73，产率58％。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C21H21N3NaO4S calcd:434.1145,found:434.1145。
实施例74线性非自然肽类似物74的合成
同实施例43，不同在于，采用3-噻吩甲醛替代2-甲基苯甲醛，得到线性非自然肽类似物74，产率52％。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C21H21N3NaO4S calcd:434.1145,found:434.1151。
实施例75线性非自然肽类似物75的合成
同实施例43，不同在于，采用3-吡咯甲醛替代2-甲基苯甲醛，得到线性非自然肽类似物75，产率60％。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C21H22N4NaO4 calcd:417.1533,found:417.1526。
实施例76线性非自然肽类似物76的合成
同实施例43，不同在于，采用N-苯甲酰基-3-吲哚甲醛替代2-甲基苯甲醛，得到线性非自然肽类似物76，产率22％。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C32H28N4NaO5 calcd:571.1952,found:571.1950。
实施例77线性非自然肽类似物77的合成
同实施例43，不同在于，采用环己基甲醛替代2-甲基苯甲醛，得到线性非自然肽类似物77，产率68％。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C23H29N3NaO4 calcd:434.2050,found:434.2050。
实施例78线性非自然肽类似物78的合成
同实施例43，不同在于，采用苯丙醛替代2-甲基苯甲醛，得到线性非自然肽类似物78，产率21％。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C25H27N3NaO4 calcd:456.1894,found:456.1908。
实施例79线性非自然肽类似物79的合成
同实施例71，不同在于，采用苄基异氰替代环己基异氰，得到线性非自然肽类似物79，产率52％。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C28H21N3NaO4 calcd:486.1424,found:486.1430。
实施例80线性非自然肽类似物80的合成
同实施例71，不同在于，采用叔丁基异氰替代环己基异氰，得到线性非自然肽类似物80，产率38％。HRMS(pos.ESI):m/z[M+Na]+for C25H23N3NaO4 calcd:452.1581,found:452.1569。
实施例81IDH1R132H蛋白的表达和纯化
将表达载体pET28a-IDH1R132H转化到大肠杆菌菌株BL21(DE)(Invitrogen)，并在卡那霉素平板上进行筛选。将转化的细胞在37℃、卡那霉素存在的Luria-Bertani(LB)培养基中培养，直到OD值达到0.8。然后用0.4mM IPTG(异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷)在20℃下诱导细胞16小时。在含有20mM Tris,pH 8.5,200mM NaCl,5mM mercaptoethanol,0.1％TritonX-100和5％甘油的缓冲液中，冰上裂解离心收获的细胞。可溶性的C端六个组氨酸标签的IDH1R132H与Ni-agarose亲和树脂(Qiagen)结合，用缓冲液A(20mM Tris，pH 8.5，200mMNaCl，10mM咪唑)洗涤，并用缓冲液B(20mM Tris，pH 8.8，250mM NaCl，150mM咪唑)洗脱。该蛋白用阴离子交换色谱和尺寸排除色谱进一步纯化。
实施例82IDHR132H酶活性测定
通过测定NADPH的消耗来检测IDHR132H酶活性及相关线性非自然肽类似物抑制作用，将纯化的2μM IDHR132H与0-20μΜ倍比稀释的1-80号线性非自然肽类似物及含有4mMMgCl2、0.05％BSA、150mM NaCl的20mM Tris-HCl缓冲液(pH＝7.5)共同孵育30分钟，在96孔微孔板中加入2mMα-KG、200μM NADPH启动反应。使用BioTek Synergy HT酶标仪，每隔1分钟在340nM(NADPH的最大吸收波长)监测每个孔的吸光度，从而测量NADPH的消耗。实验结果见表1-3，图1。
通过测定NADPH的产生来检测野生型IDH1酶活性及相关线性非自然肽类似物抑制作用，在96孔微孔板中使用纯化的2μM IDH1与0-20μΜ倍比稀释的线性非自然肽类似物及含有2mM MnSO4的30mM Tris-HCl buffer(pH＝7.5).共同孵育30分钟，在96孔微孔板加入4mM DL-ICT、0.25mM NADP+启动反应进行测定。用GraphPad Prism 8.0.1版使用标准剂量反应曲线拟合来计算IC50值。实验结果见表4，线性非自然肽类似物69的酶动力学研究的最佳拟合模型见图2。
实施例83CCK8法检测细胞存活率
取对数期生长的IDH1突变的U87、HT1080、LO2细胞，用胰酶消化，铺96孔板，密度5000个/孔，24h后，用不同浓度梯度的线性非自然肽类似物(0-1μM或0-20μM)处理。在给药48h后用CCK-8在450nm波长下，检测活细胞数目。用GraphPad Prism8.0.1计算IC50值。实验结果见表1-3，线性非自然肽类似物43,线性非自然肽类似物71,线性非自然肽类似物69对于HT1080的细胞毒IC50见图3，对IDH mutant U87的细胞毒IC50见图4。
实施84药物对HT1080细胞中2-HG的影响
取对数期生长的HT1080细胞，胰酶消化后铺96孔板，密度5000个/孔，24h后，用不同浓度梯度的线性非自然肽类似物(0-1μM或0-20μM)处理。在给药48h后收集细胞上清，按1:4加入甲醇，混匀后离心取上清，通过HPLC-MS进行2-HG的测量。
LC-MS/MS系统由Shimadzu Prominence UFLC系统(Shimadzu Corporation,Kyoto,Japan)和API4000三重四极杆质谱仪(AB Sciex,Foster City,CA,USA)组成，配备了电喷雾离子化(ESI)源。色谱分离在WelchXB-C18柱上进行，温度为40℃(50mm×2.1mm,5.0μm；Welch Materials,Shanghai,China)。流动相由5mM乙酸铵水溶液(A相)和甲醇(B相)组成。质谱检测采用负离子电喷雾模式和多重反应监测(MRM)，监测2-HG的m/z 146.8→128.6的前体到产物离子转变。源参数优化如下：幕气：20psi，碰撞气(CAD)：高，离子喷雾电压：-4500V，温度。500℃，雾化器气体。40psi，辅助气体：50psi，接口加热器：开。2-HG的最佳线性非自然肽类似物相关参数包括去杂电位(DP)，碰撞能量(CE)，入口电位(EP)和细胞出口电位(CXP)被设定为-55，-14，-10，-9V。数据采集和处理由Analyst 1.6.1软件(AB Sciex,Foster City,CA,USA)控制。在测量2-HG的浓度之前，LC-MS/MS检测法用从Sigma Aldrich(St Louis,MO,USA)购买的2-HG验证和校准。用GraphPad Prism8.0.1计算IC50值。实验结果见表4，图5。
实施例85流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期
1.细胞凋亡
(1)用不含EDTA的0.25％胰酶消化细胞，终止消化后收集细胞，1500rpm，5min离心，去上清，加PBS重悬；(2)用PBS将细胞润洗2次，1500rpm，5min；(3)使用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒进行检测：A.加入500ul Binding Buffer，重悬细胞；B.5ulAnnexinV-FITC混匀后加入5ul PI，混匀；C.室温避光反应5～15min(同时设阴性对照，即正常细胞不加Annexin和PI)；(4)流式细胞仪上机检测。
实验结果显示，100nM的69号线性非自然肽类似物诱导了38.34％的凋亡死亡，而对照组的凋亡死亡率为2.33％。在凋亡细胞中，大多数细胞(37.19％)处于早期凋亡状态(Annexin VFITC+/PI-)。这些结果表明，69诱导IDH1突变体U-87细胞凋亡(图6A,B)。
2.细胞周期
(1)用不含EDTA的0.25％胰酶消化细胞，终止消化后收集细胞，1500rpm，5min，去上清，PBS重悬润洗2次；(2)1500rpm，5min，去上清，100ul PBS重悬细胞，缓慢加入700ul预冷的80％乙醇，使乙醇终浓度为70％；(3)4℃固定4h以上；(4)1500rpm，5min，预冷PBS润洗2次；(5)加入10μl RNase(1mg/ml)，37℃孵育30min；(6)加入10μl PI(250μg/ml)，4℃避光染色30min；(7)流式细胞仪检测。
实验结果显示，69处理IDH1突变体U-87细胞24h后，观察到IDH1突变体U-87细胞G1期显著下降(34.68％69vs 44.58％DMSO)。IDH1突变体U-87细胞S期细胞数量显著增加(54.66％69vs 40.92％DMSO)。这些结果表明，69诱导的细胞周期阻滞在S期(图6C,D)。
实施例87微量热涌动实验
用Monolith NTTMProtein Labeling Kit RED(Cat#L001)对重组IDHR132H蛋白(50nM)进行标记，样品在20mM Tris-HCl(pH 7.5)和0.5(v/v)％Tween-20中稀释。AG120/43/69/71粉末溶解在5％的DMSO中，浓度为200μM，倍比稀释。在室温下孵育10分钟后，将样品装入MonolithTM标准处理过的毛细管中，在Monolith NT.115仪器(NanoTemperTechnologies,München,Germany)上孵育30分钟后，在25℃测量热泳。激光功率被设置为40％，使用30秒的开启时间。LED的功率被设置为100％。通过使用NTAnalysis软件(NanoTemper Technologies,München,Germany)对解离常数Kd值进行拟合。
实验结果表明，AG-120、43、71和69的平衡解离常数Kd分别为265.00±41.30nM、14.80±1.56μM、496.00±54.40nM和625.00±42.60nM(图7)。
Table 1AG-120,1-33号线性非自然肽类似物对IDH1R132H酶和HT1080细胞的抑制活性表
Table 2 34-55号线性非自然肽类似物对IDH1R132H酶和HT1080细胞的抑制活性表
Table 3 56-80号线性非自然肽类似物对IDH1R132H酶和HT1080细胞的抑制活性表
Table 4部分线性非自然肽类似物对IDH1R132H酶与IDH1酶的抑制活性及其对HT1080细胞毒性和2-HG的抑制活性表
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