一种巴氯芬人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种巴氯芬人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用 (Baclofen artificial hapten, artificial antigen, preparation method and application thereof ) 是由 王镇 邵越水 于 2020-06-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种巴氯芬人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。巴氯芬人工半抗原的分子结构式如式(Ⅰ),巴氯芬人工抗原的分子结构式如式(Ⅱ)。本发明的巴氯芬人工半抗原最大程度地保留了巴氯芬的特征结构,且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团,可作为抗原决定簇；进一步制备获得的巴氯芬人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗巴氯芬抗体,经免疫新西兰白兔获得的免疫血清的效价高达1∶80000,可用于对巴氯芬进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。(The invention discloses a baclofen artificial hapten, an artificial antigen, a preparation method and application thereof. The molecular structural formula of the baclofen artificial hapten is shown as a formula (I), and the molecular structural formula of the baclofen artificial antigen is shown as a formula (II). The baclofen artificial hapten of the invention furthest reserves the characteristic structure of baclofen, has an active group which can be coupled with carrier protein and can be used as an antigenic determinant; the baclofen artificial antigen further prepared can be immunized to obtain an anti-baclofen antibody with high affinity, high sensitivity and strong specificity, the titer of immune serum obtained by immunizing a New Zealand white rabbit is as high as 1: 80000, and the baclofen artificial antigen can be used for carrying out rapid and accurate immunoassay and immunoassay on baclofen.)
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种巴氯芬人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。
背景技术
巴氯芬为骨骼肌松弛药，用于改善锥体束损害造成的肌张力增高的痉挛症状、不同原因造成的痉挛性偏瘫和截瘫，如多发性硬化、脑血管病、脊髓损伤和脊髓炎后遗症、儿童脑性瘫痪、破伤风、难治性呃逆等。
本药口服从胃肠道迅速、完全吸收。口服后1～3h，血浆浓度到达高峰，但个体差异较大。70％～80％药物以原形从小便排出，约15％由肝脏代谢。
长期使用突然停药可引起：停药综合征、头昏、头痛、乏力、幻觉、癫痫、腹泻、便秘、皮疹、食欲减退、低血压、恶心、呕吐、欣快、精神忧郁、失眠、耳鸣、麻木、谈话含糊、肝功能损害、震颤等症状。
目前，对巴氯芬的检测主要依靠高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、薄层色谱法(TLC)、质谱法(MS)等，但是存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作，不能达到现代检测对快速、准确的要求。因此建立快速、灵敏、准确的检测技术是很有必要的。
免疫分析法可以弥补以上所有缺点，免疫分析法是一种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质(药物、激素、蛋白质、微生物等)的分析方法，建立小分子化合物的免疫分析方法的关键是能够制造出对小分子化合物具有高亲和力和高特异性的抗体。但是由于包括巴氯芬在内的大多数小分子化合物(分子量小于1000)不具有免疫原性，即缺乏T细胞表位而无法直接诱导动物机体产生特异性抗体，故小分子物质被称为半抗原。通过适当的化学修饰，在半抗原分子结构的某个位置上连上连接臂，再与大分子载体结合，合成半抗原-载体偶联物(即人工抗原)，人工抗原可以借助T细胞表位来间接诱导B细胞的增殖和分化，继而产生特异性抗体。
现有技术中还未有巴氯芬人工半抗原、人工抗原的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷与不足，提供一种巴氯芬-牛血清蛋白人工抗原的制备方法，所制备的巴氯芬-牛血清蛋白人工抗原可进行动物免疫，取得相应的巴氯芬抗体，可用于各种巴氯芬类免疫分析法的研究，为巴氯芬的检测提供更加方便快速准确的途径。
本发明首先提供了一巴氯芬人工半抗原，该巴氯芬人工半抗原最大程度的保留了巴氯芬的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇。
一种巴氯芬人工半抗原，其分子结构式如(Ⅰ)所示：
本发明公开了一种巴氯芬人工半抗原的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)将巴氯酚和三氟乙酸酐按摩尔比1∶1.1混合，加入3A分子筛干燥过的苯，室温下搅拌反应1小时，接着转入80℃油浴中继续搅拌回流3小时，反应结束，冷却至室温，将溶剂减压蒸干得淡黄色油状物A；
(2)将淡黄色油状物A、N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐按摩尔比1∶1.35～1.5∶2.45～3.0混合，加入二氯甲烷溶解，室温搅拌反应18小时；结束反应将反应液转入分液漏斗中，分别用0.1N的盐酸、纯化水、饱和的碳酸氢钠溶液、饱和的食盐水洗涤有机相，取有机相干燥、过滤、减压蒸干得灰白色固体B；
(3)将对氨甲基苯甲酸溶于体积比为2∶1的四氢呋喃和纯化水的混合溶剂中，室温下搅拌均匀，然后加入灰白色固体B的四氢呋喃溶液，此时反应液浑浊；再加入1N的氢氧化钠水溶液至反应液刚好澄清，室温下搅拌反应3小时；结束反应，减压蒸干溶剂，加入双蒸水，用6N的盐酸调pH＝6，用乙酸乙酯萃取三次，收集有机相，干燥、过滤、减压蒸干、TLC薄层色谱分离得黄色油状物Ⅰ，即权利要求1所述的巴氯芬人工半抗原。
通过上述方法，在巴氯芬的羧基上引入连接臂，在该修饰位点上引入连接臂能较大程度地保留巴氯芬的特征结构，又提供了可以与载体蛋白偶联的活性位点。
与采用一般的饱和链烃作为连接臂相比，本发明所采用的连接臂中含有苯环结构，可使人工半抗原的特异性增强，在溶液中保持构象稳定，提高所形成的人工抗原(II)的免疫特性。
本发明还提供了一种巴氯芬人工抗原，其分子结构如(Ⅱ)所示：
式(Ⅱ)中，BSA为牛血清蛋白。
本发明还提供了一种所述巴氯芬人工抗原的制备方法，所述巴氯芬人工抗原是通过活泼酯法使所述巴氯芬人工半抗原与牛血清蛋白结合，获得所述巴氯芬人工抗原。
具体地，采用活泼酯法制备巴氯芬人工抗原时，包括以下步骤：
(a)将巴氯芬人工半抗原Ⅰ与N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺以摩尔比为1∶1.35～1.5∶1.35～1.5溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应18小时，反应结束后离心取上清液；
(b)将上清液滴加到牛血清蛋白溶液中，混合液置于4℃下静置过夜，经pH＝12.00的0.5％碳酸钠水溶液和磷酸盐缓冲溶液(PBS)透析、离心取上清液，获得巴氯芬人工抗原。
本发明中牛血清蛋白溶液是将牛血清蛋白溶于磷酸根离子浓度为0.01mol/L的PBS(pH＝7.2-7.4)缓冲液中制成的。
步骤(b)中，所述牛血清蛋白溶液的浓度为5mg/ml，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1∶10。
本发明选用的牛血清蛋白(BSA)作为大分子载体，与其他载体蛋白相比，具有以下优点：①BSA具有583个氨基酸残基，较容易与巴氯芬半抗原发生偶联，可制得不同偶联比的巴氯芬人工抗原，且具有较高的免疫原性；②BSA经济实惠，成本低；③BSA的化学性质比较稳定，在酸性和弱碱性的环境下也有很好的溶解度和稳定性，适合长期储存。
本发明还提供了所述巴氯芬人工抗原在制备抗巴氯芬抗体中的应用。
本发明还提供了一种抗巴氯芬抗体，是由所述巴氯芬人工抗原经动物免疫得到的、可与巴氯芬发生特异性免疫反应的球蛋白。
本发明还提供了所述抗巴氯芬抗体在检测巴氯芬中的应用。
试验发现，将所述巴氯芬人工抗原免疫新西兰白兔，获得的免疫血清的效价为1∶80000。表明本发明的巴氯芬人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗巴氯芬抗体，该抗巴氯芬抗体可用于巴氯芬的免疫检测和分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的巴氯芬人工半抗原最大程度地保留了巴氯芬的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇；进一步制备获得的巴氯芬人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗巴氯芬抗体，经免疫新西兰白兔获得的免疫血清的效价高达1∶80000，可用于对巴氯芬进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。
附图说明
图1为本发明巴氯芬人工抗原的制备流程图；
其中，THF表示四氢呋喃，EDCI表示1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，MeOH表示甲醇，DCM表示二氯甲烷，DCC表示二环己基碳二亚胺，DMF表示N，N-二甲基甲酰胺，Et3N表示三乙胺，BSA表示牛血清蛋白，BGG表示牛丙种球蛋白，下同；
图2为本发明巴氯芬人工半抗原的液相色谱图；
其中，mAU表示毫吸光度单位，min表示分钟；
图3为本发明巴氯芬半抗原的质谱图；
其中，Relative Abundance表示相对丰度；m/z表示荷质比；
图4为牛血清蛋白、巴氯芬人工半抗原、巴氯芬人工抗原的紫外扫描图；
其中，A表示紫外-可见吸光度，λ(nm)表示波长(nm)；
图5为对比例1巴氯芬人工抗原的制备流程图；
图6为对比例2巴氯芬人工抗原的制备流程图；
图7为对比例3巴氯芬人工抗原的制备流程图；
图8为对比例4巴氯芬人工抗原的制备流程图；
图9为对比例5巴氯芬人工抗原的制备流程图；
图10为对比例6巴氯芬人工抗原的制备流程图；
图11为对比例7巴氯芬人工抗原的制备流程图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本实施一种巴氯芬人工抗原的制备方法(反应历程如图1)，包括以下步骤：
(1)人工半抗原的制备：
①称取巴氯酚200mg(0.94mmol)于50ml单口圆底单口烧瓶中，加入10ml3A分子筛干燥过的苯，装上冷凝管和干燥管，并加搅拌子在0℃冰水浴中搅拌5分钟，接着再加入三氟乙酸酐143μL(1.03mmol)，撤去冰水浴，室温下搅拌反应1小时，接着转入80℃油浴中继续搅拌回流3小时；结束反应，冷却至室温，取出转子，减压蒸干溶剂得淡黄色油状物A262mg(0.85mmol)；
对该淡黄色油状物A进行TLC检测，层析液为乙酸乙酯：石油醚＝10∶3(v/v)，产物Rf＝0.9；
②将上步淡黄色油状物A262mg(0.85mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺132mg(1.15mmol)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐399mg(2.08mmol)置于50ml单口圆底烧瓶中，加入20ml二氯甲烷溶解，再加入搅拌子室温下搅拌反应18小时；结束反应，将反应液转入125ml分液漏斗中，分别用20ml0.1N的盐酸、20ml纯化水、20ml饱和的碳酸氢钠溶液和20ml饱和的食盐水洗涤有机相，取有机相用无水硫酸镁干燥、过滤、减压蒸干得灰白色固体B312mg(0.77mmol)；
对该灰白色固体B进行TLC检测，层析液为乙酸乙酯：石油醚＝10：3(v/v)，产物Rf＝0.3；
③称取174mg(1.15mmol)对氨甲基苯甲酸悬浮于16ml四氢呋喃和8ml纯化水中，加搅拌子室温下搅拌均匀，记为A液。将上步灰白色固体B312mg(0.77mmol)溶入16ml四氢呋喃中，记为B液。将B液缓慢加入到A液中，此时反应液浑浊，再加入1N的氢氧化钠水溶液1.92ml，反应液变澄清，室温下搅拌反应3小时；结束反应，减压蒸干溶剂，加入16ml双蒸水，用6N的盐酸调pH＝6，此时有大量的白色沉淀产生，将反应液转入125ml分液漏斗中，分别用20ml乙酸乙酯萃取三次，收集有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、减压蒸干得粗产物，将此粗产物用TLC薄层色谱分离得黄色油状物Ⅰ168mg(0.38mmol)，(溶剂和洗脱机为无水乙醇，展开剂为二氯甲烷：95％乙醇：1，4-二氧六环：浓氨水＝10：8：1：1，收集Rf＝0.4的点)即权利要求1所述的巴氯芬人工半抗原。
对该黄色油状物Ⅰ进行TLC检测，层析液为二氯甲烷：95％乙醇：1，4-二氧六环：氨水＝10：8：1：1(v/v)，产物Rf＝0.4；
巴氯芬人工半抗原的液相色谱图见图2(紫外检测器，波长215nm)。
从图2可以看出经过纯化得到的巴氯芬人工半抗原的纯度达到99.9％以上。
巴氯芬半抗原的质谱图见图3。从图3可以看出本实施例得到的巴氯芬人工半抗原的分子离子峰的质荷比(m/z)为442，与其理论分子量吻合，它的主要碎片离子峰的质荷比(m/z)与其主要碎片的理论值吻合，可以确定步骤③得到的最终化合物就是本发明所设计的巴氯芬人工半抗原。
(2)巴氯芬人工抗原的制备：
④将巴氯芬人工半抗原Ⅰ168mg(0.38mmol)置于50ml圆底烧瓶中，加搅拌子，加入8.4ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，再加入59mg(0.51mmol)N-羟基琥珀酰亚胺和105mg(0.51mmol)二环己基碳二亚胺，25℃搅拌反应18小时，反应结束后离心，取上清液，备用。
⑤称取14.500g(0.0405mol)十二水磷酸氢二钠，43.875g(0.75mol)氯化钠，1.495g(0.00958mol)二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到磷酸根离子浓度为0.01mol/L，钠离子浓度为0.17mol/L的PBS缓冲液，pH为7.4。
⑥称取25gNa2CO3固体粉末溶于纯化水中并定容至5L，用2N的NaOH水溶液调节pH＝12.00±0.01，制得碱性透析液。
⑦称取0.42g牛血清蛋白溶于84ml步骤⑤的PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的牛血清蛋白溶液。
⑧在快速搅拌下，将步骤④的上清液缓慢滴加到⑦的牛血清蛋白溶液中，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1∶10，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。
⑨将上步人工抗原混合液转入透析袋中，用步骤⑥的碱性透析液透析两天，每天各一次，再将透析袋转入⑤中得PBS缓冲液中透析7次，每两次时间间隔不少于两小时，透析结束后，离心取上清液即得到人工抗原：巴氯芬-牛血清蛋白偶联物(如式Ⅱ)。
巴氯芬人工抗原制备前后的紫外扫描图见图4。其中，曲线a为巴氯芬人工半抗原的紫外扫描图，曲线b为牛血清蛋白的紫外扫描图，曲线c为巴氯芬人工抗原的紫外扫描图。巴氯芬人工半抗原的最大吸收波长为245nm，巴氯芬人工抗原的最大吸收波长为253nm，与巴氯芬半抗原、牛血清蛋白相比，巴氯芬人工抗原的最大吸收波长和吸光度都出现明显变化，说明巴氯芬半抗原与牛血清蛋白偶联成功。
对比例1
本实施一种巴氯芬人工抗原的制备方法(反应历程如图5)，包括以下步骤：
(1)人工半抗原的制备：
①称取巴氯酚200mg(0.94mmol)于50ml单口圆底烧瓶中，加入6.4ml无水甲醇溶解，再加入98％的浓硫酸300μL，放入搅拌子，装上冷凝管和干燥管，置于68℃油浴中搅拌回流反应18小时；结束反应，冷却至室温，向反应瓶中加入928mg碳酸氢钠固体至不再有气泡冒出为止，过滤转干得到的残渣再用15ml四氢呋喃提取得淡黄色油状物C207mg(0.91mmol)；
对该淡黄色油状物C进行TLC检测，层析液为乙酸乙酯：石油醚＝10：3(v/v)，产物Rf＝0.8；
②将上步淡黄色油状物C207mg(0.91mmol)加入15ml无水吡啶溶解于50ml单口圆底烧瓶中，再加入136mg丁二酸酐，在100℃油浴中搅拌回流反应20小时；结束反应，冷却至室温，减压蒸干溶剂，加入20ml纯化水和20ml二氯甲烷萃取，水相再用20ml二氯甲烷萃取两次，收集有机相，分别用30ml纯化水和30ml饱和的食盐水洗涤，取有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、转干得粗产物，将此粗产物用TLC薄层色谱分离得黄色油状物Ⅲ212mg(0.65mmol)，(溶剂和洗脱机为无水乙醇，展开剂为二氯甲烷：95％乙醇：1，4-二氧六环：浓氨水＝10：8：1：1，收集Rf＝0.3的点)即巴氯芬人工半抗原(如式Ⅲ)；
对该黄色油状物Ⅲ进行TLC检测，层析液为二氯甲烷：95％乙醇：1，4-二氧六环：氨水＝10：8：1：1(v/v)，产物Rf＝0.3；
巴氯芬人工抗原的制备：
③将巴氯芬人工半抗原Ⅲ置于50ml单口圆底烧瓶中，加搅拌子，加入10.6ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，再加入101mg(0.88mmol)N-羟基琥珀酰亚胺和181mg(0.88mmol)二环己基碳二亚胺，25℃搅拌反应18小时，反应结束后离心，取上清液，备用。
④称取14.500g(0.0405mol)十二水磷酸氢二钠，43.875g(0.75mol)氯化钠，1.495g(0.00958mol)二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到磷酸根离子浓度为0.01mol/L，钠离子浓度为0.17mol/L的PBS缓冲液，pH为7.4。
⑤称取25gNa2CO3固体粉末溶于纯化水中并定容至5L，用2N的NaOH水溶液调节pH＝12.00±0.01，制得碱性透析液。
⑥称取0.53g牛血清蛋白溶于106ml步骤④的PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的牛血清蛋白溶液。
⑦在快速搅拌下，将步骤③的上清液缓慢滴加到⑥的牛血清蛋白溶液中，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1∶10，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。
⑧将上步人工抗原混合液转入透析袋中，用步骤⑤的碱性透析液透析两天，每天各一次，再将透析袋转入④中得PBS缓冲液中透析7次，每两次时间间隔不少于两小时，透析结束后，离心取上清液即得到人工抗原Ⅳ：巴氯芬-牛血清蛋白偶联物。
对比例2
本实施一种巴氯芬人工抗原的制备方法(反应历程如图6)，包括以下步骤：
(1)巴氯芬人工半抗原的制备：
①～②分别与对比例1相同。
(2)巴氯芬人工抗原的制备：
采用牛丙种蛋白作载体，与巴氯芬人工半抗原Ⅲ进行偶联，偶联步骤与对比例1相同，得到巴氯芬人工抗原Ⅴ：巴氯芬-牛丙种球蛋白偶联物。
对比例3
本实施一种巴氯芬人工抗原的制备方法(反应历程如图7)，包括以下步骤：
(1)巴氯芬人工半抗原的制备：
①～②分别与对比例1相同。
(2)巴氯芬人工抗原的制备：
③称取212mg(0.65mmol)巴氯芬人工半抗原Ⅲ置于50ml圆底烧瓶中，加入10.6mlN，N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加入89μL(0.65mmol)三乙胺和85μL(0.65mmol)氯甲酸异丁酯，室温搅拌反应18小时，反应结束后离心，取上清液，备用。
④-⑧分别与对比例1相同；得到巴氯芬人工抗原Ⅵ:巴氯芬-牛血清蛋白偶联物。
对比例4
本实施一种巴氯芬人工抗原的制备方法(反应历程如图8)，包括以下步骤：
(1)巴氯芬人工半抗原的制备：
①～②分别与对比例1相同。
(2)巴氯芬人工抗原的制备：
③与对比例3相同。
④-⑧与对比例1相似，将牛血清蛋白全部替换成牛丙种球蛋白，得到巴氯芬人工抗原Ⅶ：巴氯芬-牛丙种球蛋白偶联物。
对比例5
本实施一种巴氯芬人工抗原的制备方法(反应历程如图9)，包括以下步骤：
(1)巴氯芬人工半抗原的制备：
①～③分别与实施例1相同。
(2)巴氯芬人工抗原的制备：
④采用牛丙种蛋白作载体，与巴氯芬人工半抗原Ⅰ进行偶联，偶联步骤与实例1④～⑨相同，得到巴氯芬人工抗原Ⅷ：巴氯芬-牛丙种球蛋白偶联物。
对比例6
本实施一种巴氯芬人工抗原的制备方法(反应历程如图10)，包括以下步骤：
(1)巴氯芬人工半抗原的制备：
①～③分别与实施例1相同。
(2)巴氯芬人工抗原的制备：
④称取168mg(0.38mmol)巴氯芬人工半抗原Ⅰ置于50ml圆底烧瓶中，加入10mlN，N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加入52μL(0.38mmol)三乙胺和50μL(0.38mmol)氯甲酸异丁酯，室温搅拌反应18小时，反应结束后离心，取上清液，备用。
⑤-⑨分别与实施例1相同，得到巴氯芬人工抗原Ⅸ：巴氯芬-牛血清蛋白偶联物。
对比例7
本实施一种巴氯芬人工抗原的制备方法(反应历程如图11)，包括以下步骤：
(1)巴氯芬人工半抗原的制备：
①～③分别与实施例1相同。
(2)巴氯芬人工抗原的制备：
④与对比例6中的④相同；
⑤-⑨采用牛丙种蛋白作载体，与巴氯芬人工半抗原Ⅰ进行偶联，偶联步骤与实施例1相同，得到巴氯芬人工抗原Ⅹ：巴氯芬-牛丙种球蛋白偶联物。
实施例2巴氯芬人工抗原的性能测定
(1)巴氯芬人工抗原的鉴定：
摩尔吸收系数ε：用PBS缓冲液配制浓度为0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml的巴氯芬人工半抗原溶液，通过紫外扫描图可知巴氯芬半抗原的最大吸收波长为245nm，用PBS作为对照样在245nm处测吸光值，每个浓度做平行样。摩尔吸光系数(即摩尔吸收系数)的计算公式为：ε＝吸光值/摩尔浓度。
偶联物蛋白浓度的测定：用PBS缓冲液配制浓度为0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml的牛血清蛋白溶液各1ml，加入3ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样，在655nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将人工抗原溶液(用PBS缓冲液配制)按一定比例稀释，在655nm处测得人工抗原的吸光值，从曲线上读取人工抗原溶液的相应蛋白浓度值。
偶联比测定：配制100μg/ml的牛血清蛋白PBS溶液，将偶联物(即巴氯芬人工抗原)用PBS稀释到100μg/ml，以PBS为空白对照，在253nm处分别测得吸光值A2、A1，则偶联比率γ为：γ＝[(A1－A2)/ε]/(100×10-3/65000)。
其中ε为摩尔吸光系数(L/mol)，65000为牛血清蛋白的分子量，100×10-3为牛血清蛋白浓度(g/L)。
用牛丙种球蛋白作为载体，偶联比的计算式为:γ＝[(A1－A2)/ε]/(100×10-3/150000)，其中，150000为牛丙种球蛋白的分子量，100×10-3为牛丙种球蛋白浓度(g/L)。
表1各巴氯芬人工抗原的偶联比和摩尔吸收系数
由表1可见，人工半抗原的结构，人工半抗原的活化方法以及载体蛋白的结构对人工半抗原与载体蛋白交联时的偶联比都是有影响的。
(2)动物免疫
将制备的各巴氯芬人工抗原免疫新西兰白兔，得到的免疫血清经ELISA方法检测其效价，检测结果见表2。
表2各免疫血清的效价检测结果
编号
巴氯芬人工抗原
免疫血清效价
实施例1
Ⅱ
1∶80000
对比例1
Ⅳ
1∶50000
对比例2
Ⅴ
1∶20000
对比例3
Ⅵ
1∶30000
对比例4
Ⅶ
1∶7000
对比例5
Ⅷ
1∶40000
对比例6
Ⅸ
1∶8000
对比例7
Ⅹ
1∶7000
由表2可见，与实施例1相比，利用各对比例巴氯芬人工抗原进行动物免疫获得的免疫血清，其效价均偏低，不能用于免疫分析中。而利用巴氯芬人工抗原Ⅱ进行动物免疫获得的免疫血清，其效价达1∶80000，完全可用于免疫分析中，能为巴氯芬的检测提供更加方便快速准确的途径。