一种溶酶体荧光探针、其制备方法及其应用
阅读说明：本技术 一种溶酶体荧光探针、其制备方法及其应用 (Lysosome fluorescent probe, preparation method and application thereof ) 是由 杨锐 魏蒙蒙 刘玉申 况亚伟 王书昶 于 2021-10-26 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种溶酶体荧光探针、其制备方法及其在观测溶酶体粘度中的应用。所述荧光探针的化学结构式如下所示,该荧光探针具有制备方法简单、毒性低、使用简单和可以精细化观测溶酶体粘度变化的优点。(The invention provides a lysosome fluorescent probe, a preparation method thereof and application thereof in lysosome viscosity observation. The chemical structural formula of the fluorescent probe is shown as follows, and the fluorescent probe has the advantages of simple preparation method, low toxicity, simplicity in use and capability of finely observing the viscosity change of lysosomes.)
技术领域
本发明属于荧光探针领域，具体涉及一种溶酶体荧光探针、其制备方法和应用。
背景技术
溶酶体粘度是溶酶体功能的关键指标之一。在溶酶体功能障碍的情况下，溶酶体中积累的大分子不能被及时降解和清除，这会导致溶酶体粘度增加。此外，溶酶体粘度在内吞、自噬和凋亡等生理过程中也会发生动态变化。因此，溶酶体粘度值是反映溶酶体状态和功能的重要基准。对于均一、稳定的环境，可以用粘度计（如毛细管粘度计等）测量其粘度。对于特定的微环境，特别是细胞器的粘度，粘度计等宏观测试工具无法测量。荧光技术具有操作简单、选择性强、损伤小等独特优势，荧光显微镜可以用于可视化活细胞的细胞器。基于这一手段，可以开发粘度敏感的溶酶体靶向荧光探针，以此观测溶酶体粘度变化。
目前，可以观测溶酶体粘度的探针很少，但是，这些探针往往都对pH值敏感，这就会在观测溶酶体粘度变化时产生假阳性信号，由此可见，开发一种荧光性质不受pH值影响的溶酶体探针仍然是一项迫切的任务，也是一个巨大的挑战。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供不受pH影响的一种溶酶体荧光探针、其制备方法及其应用。
一种荧光探针，所述荧光探针的化学结构式如式（I）所示：
（）
其中，R为羟乙基、乙烷基或丙烷基。
溶酶体因其较强的酸性(pH = 4-5)而被人们熟知，但是人们往往忽视了其高粘度(47-190 cP) 特性。溶酶体的高粘度环境为设计合适的粘度响应型溶酶体探针提供思路，本发明的荧光探针没有pH响应的位点，不受pH影响；荧光探针是由吲哚及吲哚碘盐这两部分组成，这两部分结构之间的单键易发生旋转，这可能是其对粘度敏感的原因，更加精确地观测溶酶体粘度变化。
上述溶酶体荧光探针的制备方法，2,3,3-三甲基-3H-吲哚与RI混合反应得到化合物Ⅱ，然后将化合物Ⅱ与1H-吲哚-2-甲醛通过Knoevenagel反应合成荧光探针；
（Ⅱ）
作为技术方案的进一步改进，其中，所述Knoevenagel反应中催化剂为有机碱，生成的化合物通过柱色谱法纯化，即为本发明的荧光探针。其反应路线如下：
作为技术方案的进一步改进，2,3,3-三甲基-3H-吲哚与RI混合反应得到化合物Ⅱ，其中，二者的物质的量之比为1：（1.1-1.2），温度为85-95℃，回流时间为6-10 h；然后将化合物Ⅱ与化合物1H-吲哚-2-甲醛通过Knoevenagel反应合成产物，其中，所述的催化剂为有机碱（哌啶等），反应物的物质的量之比为1：（1.1-1.2），温度为85-95℃，回流时间为6-10h；最后通过柱色谱法纯化，得到荧光探针。
本发明还提供一种上述荧光探针在成像活细胞中溶酶体的应用, 本发明的荧光探针为粘度响应型探针，使用时荧光探针与细胞接触，荧光探针穿过细胞膜，细胞染色后，所述荧光探针能使溶酶体显示出绿色荧光。
本发明还提供一种上述溶酶体荧光探针在观测活细胞内溶酶体粘度变化的应用，本发明的荧光探针为粘度敏感型探针，溶酶体的荧光强度随着粘度的增大而增强，通过观测荧光的强度变化可以推知溶酶体粘度的变化。
本发明相对现有技术具有突出的实质性特点和显著的进步，具体的说，本发明的荧光探针不受pH影响，稳定性好，可以更加精确地观测溶酶体粘度变化。进一步说，该探针的毒性低，安全浓度范围为0–8 μM，生物相容性好，可以更加精确地观测溶酶体粘度变化，这使得其具有重要的实验应用价值。本发明的溶酶体荧光探针具有光稳定性好、毒性低和粘度敏感的优点。
附图说明
图1为实施例1中化合物Ⅱ的氢谱图。
图2为荧光探针的氢谱图。
图3为荧光探针的碳谱图。
图4为荧光探针的质谱图。
图5为用不同浓度IVDI孵育HeLa细胞的存活结果图。
图6为IVDI (10 μM)在不同溶剂中的吸收光谱和荧光光谱图。
图7为IVDI和LTR染色HeLa和HepG2细胞的共聚焦荧光结果图。
图8为IVDI染色HeLa细胞的共聚焦荧光图像及荧光强度变化图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
各实施例中的所用物质均来自于市售产品。其中， 2,3,3-三甲基-3H-吲哚，2-碘乙醇和哌啶来自麦克林；1H-吲哚-2-甲醛购买于百灵威科技公司。吸收光谱的测试仪器为Hitachi U-2910 分光光度计；荧光光谱测试仪器为Hitachi F-2700 分光光度计；pH的调节仪器为METTLER TOLEDO FE20-FiveEasyTM pH-meter；所用共聚焦显微镜型号为：STELLARIS 5。
实施例1
荧光探针的合成
1）苯并吲哚碘乙醇盐的合成
将化合物2,3,3-三甲基-3H-吲哚（1.98 mL, 10 mmol）和2-碘乙醇 (1.72 mL, 10mmol)溶于20 mL纯乙醇溶液中，在烧瓶中搅拌1小时。然后回流8 h，冷却过滤后用无水EtOH洗涤3次。干燥后得到白色固体3.40 g, 产率：92%，即化合物Ⅱ。并对其进行氢谱表征，结果如下：
1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ), δ (ppm): 8.45 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.32 (d,J = 8.4 Hz, 1H), 7.89 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.81 (t, J = 7.65 Hz, 1H), 5.23(s, 1H), 4.87 (t, J = 4.80 Hz, 2H), 3.90 (t, J = 4.50 Hz, 2H), 3.23 (s, 3H)。如图1所示。
2）荧光探针IVDI的合成
将化合物Ⅱ (0.331 g, 1 mmol)和1H-吲哚-2-甲醛 (0.145 g, 1 mmol)溶于20mL甲醇中，在烧瓶中搅拌1 h，加入5滴哌啶。搅拌后在85℃下回流8 h，冷却至室温后用石油醚洗涤。以CH2Cl2和CH3OH混合物(CH2Cl2和CH3OH的体积比为10:1 ～6:1)为洗脱液，进行柱色谱分离提纯，得到0.29 g黄色固体即为荧光探针，化学命名为：(E)-2-(2-1H-吲哚-3-乙烯基)-1-(2-羟乙基)-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-碘盐，简称为IVDI。并对其进行氢谱、碳谱和质谱的表征，通过对化合物的氢谱、碳谱和质谱数据进行分析，确认上述化合物的结构无误。表征结果如下：
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ), δ (ppm): 12.74 (s, 1H), 8.69 (t, J = 15.0Hz, 2H), 8.21-8.25 (m, 1H), 7.82 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 7.6 Hz,1H), 7.61-7.63 (m, 1H), 7.48-7.57 (m, 2H), 7.37-7.41 (m, 3H), 5.28 (t, J =5.4 Hz, 1H), 4.63 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.95 (d, J = 4.4 Hz, 2H), 1.84 (s,6H)；如图2所示。
13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ), δ (ppm): 182.01, 149.38, 143.04, 141.92,138.82, 129.12, 127.90, 125.06, 124.86, 123.61, 123.18, 121.77, 116.43,114.36, 113.94, 106.47, 59.11, 51.53, 48.93, 27.17；如图3所示。
HRMS: m/z calculated for [C22H23N2O]+ 331.1805 ([M-I]+); found:331.2246；如图4所示。
实施例2
探针IVDI的毒性测试-标准MTT法
将对数期生长的HeLa细胞接种于96孔板(约1×104个细胞/孔)，用无细胞的培养基填充小孔作为空白组。将接种的细胞置于37℃，5% CO2培养箱内孵育24 h，然后将1、2、4、8 μM浓度的IVDI加入到孔中作为实验组。此外，加入终浓度为含0.2 % DMSO的DMEM培养液作为对照组。细胞在37℃，5% CO2下孵育18小时。然后每孔加入MTT (5 mg/mL)。37℃孵育4h后，加入100 μL 的DMSO。再孵育20分钟后，使用酶标仪测试每个孔在490 nm处的吸光度，细胞毒实验重复4次。
细胞存活率可通过下述公式计算得到：
其中，Asample为实验组吸光度，Ac为对照组吸光度，Ab为空白组的吸光度。用不同浓度的探针IVDI孵育HeLa细胞18小时的细胞存活率结果见图5，图中显示用8 μM的IVDI孵育HeLa细胞18小时后，细胞存活率仍高达85 %，说明该探针的毒性很低。
实施例3
IVDI 的光物理性质测试实验
用不同粘度的溶剂配制含10 μM IVDI 的测试溶液，再配制不同pH值（pH= 4.0–9.0）的含2%DMSO的BR缓冲液，分别测试其吸收光谱和荧光发射光谱，结果见图6。
在图（A）中，探针IVDI在470 nm处有一个吸收峰，在图（B）中，探针在甘油中的荧光强度最强，在其它低粘度溶剂中的荧光强度较弱，表明该探针对粘度的变化响应明显。从图（C）和图（D）中可以看出，探针IVDI对pH值的变化几乎没有响应。实验说明IVDI是一个粘度敏感的探针，该探针不受pH值变化影响，探针IVDI可以潜在地高保真成像溶酶体，并用于观测溶酶体粘度变化。
实施例4
探针IVDI在活性细胞中的共定位实验
用DMSO配制浓度为1 mM的探针母液，待HeLa细胞爬片长满盖玻片后，将活性HeLa和HepG2细胞在含2 μM IVDI的培养液中孵育15 min，用PBS冲洗两次后，将2 nM LTR加入培养液中孵育10 min，用荧光共聚焦显微镜对细胞进行成像，结果见图7。
其中图(A)是用探针IVDI（2μM，15 min）和LTR（2nM，15 min）共同染色活性HeLa细胞和HepG2细胞的共聚焦显微镜图像。图（B）是与图（A）对应的共定位系数。其中IVDI在绿光通道的激发波长为473 nm，荧光收集波长为480-580 nm；LTR在红光通道的激发波长为543nm，荧光收集波长为580-680 nm；标尺为10 μm。从图中可以看出探针IVDI与LTR有着较大的重叠，共定位系数分别为0.88和0.89（Merged图），充分证明本发明的探针IVDI能够成像活性HeLa和HepG2细胞的溶酶体。
实施例5
用探针IVDI观测溶酶体粘度变化
先用2 μM 的IVDI染色活性HeLa细胞15 min，然后，用地塞米松处理染色后的活细胞，接着用激光共聚焦显微镜观察。记录细胞中着色部位，荧光分布及亮度变化等，结果见图8。
其中图(A)为用2 μM 的探针IVDI染色HeLa细胞，然后用地塞米松处理染色后HeLa细胞的共聚焦荧光图像；图(B)显示的是图(A)中对应的荧光强度变化。其中IVDI在绿光通道的激发波长为473 nm，荧光收集波长为480-580 nm；结果显示用地塞米松处理的细胞荧光强度逐渐增强。由此，可以证实探针IVDI可以用于观测溶酶体粘度变化。
最后应当说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，所属领域的普通技术人员应当理解，依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。
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