使用金属螯合色谱法去除重组人生长激素内毒素的方法
阅读说明：本技术 使用金属螯合色谱法去除重组人生长激素内毒素的方法 (Method for removing recombinant human growth hormone endotoxin by using metal chelate chromatography ) 是由 邹青 岑选伉 胡一峰 刘海昌 朱复培 于 2021-11-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了使用金属螯合色谱法去除重组人生长激素内毒素的方法,包括如下步骤：菌体沉淀重悬、细胞破碎、破碎上清孵育、样品过滤、IMAC纯化、碱液预洗、平衡、样品装载、柱洗涤、去污剂洗脱内毒素、洗涤、目标蛋白洗脱。本发明提供一种简单有效的方法来纯化蛋白质样品,并且有效的去除其中的内毒素,从内毒素-蛋白质复合物中分离出内毒素,并在蛋白质浓度或者生物活性没有明显损失的情况下,使其内毒素含量下降到一定限度。(The invention discloses a method for removing recombinant human growth hormone endotoxin by using metal chelate chromatography, which comprises the following steps: resuspending thallus precipitation, breaking cells, breaking supernatant for incubation, filtering a sample, carrying out IMAC purification, prewashing by alkali liquor, balancing, loading the sample, washing a column, eluting endotoxin by a detergent, washing and eluting target protein. The present invention provides a simple and efficient method for purifying a protein sample and efficiently removing endotoxin therefrom, separating endotoxin from an endotoxin-protein complex, and reducing the endotoxin content to a certain limit without significant loss of protein concentration or biological activity.)
技术领域
本发明涉及生物技术制药、生物工程
技术领域
的蛋白质纯化技术，具体涉及一种使用金属螯合色谱法去除重组人生长激素内毒素的方法。背景技术
重组人生长激素(Recombinant Human Growth Hormone)为重组DNA技术生产的基因工程药物，有191个氨基酸组成的单链蛋白，相对分子质量在22KDa左右，等电点为4.9，分子中存在两对二硫键，其结构和氨基酸序列与天然人生长激素一致，目前已经上市的重组人生长激素药品多为大肠杆菌分泌型及胞内可溶型表达方式，在其研发和生产过程中会不可避免地造成细菌内毒素的污染。
内毒素，又称脂多糖(LPS)，革兰氏阴性菌的细胞壁组成成分，负责其组织和稳定性。在制药领域，内毒素可能存在于各个生产阶段或最终产品中，尽管内毒素与细菌细胞壁相连，但是它们会不断释放到环境中，这种释放不仅会发生在细胞死亡中，而且会发生在细胞生长和分裂的过程中，由于细菌可以在营养贫乏的介质中生长，例如水、盐、缓冲液等，且单个大肠杆菌约含有200多万个LPS分子，所以内毒素几乎无处不在。内毒素能够被免疫系统识别，并且能够引发多种病理生理反应。当身体与脂多糖有过度接触时(如当低浓度脂多糖进入血液系统时)，会出现全身炎症反应，进而引起多种病理生理学反应，如内毒素休克、组织损伤甚至致死。(Minutoli L，2008)然而，内毒素并不直接作用于细胞或器官，而是通过激活免疫系统，特别是通过白细胞或者巨噬细胞释放一系列的促炎介质，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，白介素6(IL-6)及白介素1β(IL-1β)(Anspach FB,2001)。哺乳动物静脉注射低浓度(1ng/ml)内毒素会引发发热反应甚至休克。所有药典规定，药品或生物制品内毒素静脉注射最大量是5EU/(kg·h)(Daneshian M,2006)。EU是表示内毒素生物活性的单位。例如，100pg的标准内毒素EC-5或者120pg大肠杆菌内毒素O111:B4有1EU的活性。达到这一标准对于生物科研或者制药工业始终是一个挑战。
在生物技术领域，革兰氏阴性菌被广泛用于重组DNA产品的生产，如肽和蛋白质，这些产品总是会受到内毒素的污染，出于这个原因，有革兰氏阴性菌制备的蛋白质必须尽可能不含内毒素，以免在人和动物在使用时引起副作用，然而内毒素是非常稳定的分子，与蛋白质相比，可以抵抗极端温度和PH值。内毒素是带负电的物质，通常具有轻微的疏水性。
基于内毒素分子独特的分子特征，目前已经开发出了多种不同的方法来从蛋白质中除去LPS，这些包括LPS亲和色谱(多粘菌素B，固定化L-组氨酸，聚L-赖氨酸)、两相萃取、超滤、疏水相互作用色谱、离子交换色谱及膜吸附等。对于与蛋白质直接接触的容器常采用180-250℃的高温及浓度为0.1-1mol/L的酸或碱来去除内毒素。
由于内毒素能够与许多蛋白质分子发生相互作用，因此常规方法对从内毒素-蛋白质复合物中去除内毒素仍是一个挑战，许多生物分子如LPS结合蛋白，杀菌-渗透性增强蛋白(BPI)，淀粉样蛋白P组件，阳离子蛋白、生物内毒素测定中使用的酶(鲎试剂中的抗脂多糖因子(LAL))都体现了与内毒素的交互作用，这些蛋白质在不同的物质中直接参与内毒素的反应，尽管目前已经有了一些内毒素与蛋白质相互作用机制的研究(如分子识别，静电相互作用等)，但仍有许多基本蛋白质与内毒素的相互作用机制尚不明确。对于大多数的蛋白质产品来说只通过单一的方法去除内毒素是不可能实现的且没有任何一种方式都是普遍适用的。
所以从重组人生长激素中去除内毒素的关键在于1、如何能防止重组人生长激素与内毒素形成蛋白质-内毒素复合物；2、如何能从蛋白质-内毒素复合物中去除内毒素；3、如何能避免引入新的内毒素。
从目标蛋白样品中去除内毒素最常用的技术之一是阴离子交换色谱法(Webber等，1995)，由于内毒素带负电，它与阴离子交换材料的带正电配体强烈结合，然而这种方法有几个缺点：如果要纯化的蛋白质也带有负电荷，则必须花费大量的精力来调整结合条件以避免内毒素与目标蛋白共流出；常常会伴随目标蛋白的大量损失。
也有通过使用超滤技术来使目标蛋白和细菌内毒素进行分离，依靠的是蛋白质分子与内毒素分子的分子大小差异，一般要求目标物与细菌内毒素分子大小差异达到三倍以上才有效果，脂多糖的基本单元大小为10-20KDa,因此，这个方法适用于小分子物质。
亲和层析(吸附内毒素)(固定化多粘菌素B Karprus et al.，1987)(固定化组氨酸Matsumae等，1990)(US3897309,US4276050,US4381239)，能非常有效的从蛋白质溶液中去除内毒素，并且保持相对较高的蛋白质收率，但是缺点也是显而易见的，如设备昂贵，材料损耗比较大，操作复杂，并且需要专门定制层析介质，还有可能存在亲和配体脱落，为蛋白质溶液引入新的杂质，增加纯化过程的风险，而且这些亲和介质不能用强碱氢氧化钠或者乙醇等标准的层析介质去除热源法的条件来清洗。
也有通过固定化金属亲和层析(IMAC)纯化多肽和去除内毒素，如专利US6942802中介绍了一种通过固定化金属离子亲和层析去除卡他莫拉菌外膜蛋白内毒素的方法，其具体步骤为将含有内毒素的蛋白溶液装载到IMAC填料上，其填料已经预平衡至缓冲区，随即更换缓冲液对内毒素进行洗脱，蛋白质与填料保持结合，最后再用特定的缓冲液对蛋白质进行洗脱收集，经过IMAC纯化后，蛋白质溶液中内毒素浓度有效降低至少200倍，蛋白质回收率大于至少60％。该方法的缺点是没有对蛋白质-内毒素复合物进行去除，且内毒素降低程度不够，还远远达不到静脉注射液的要求。
综上，目前需要一种简单有效的方法或者过程来纯化蛋白质样品，并且有效的去除其中的内毒素，从内毒素-蛋白质复合物中分离出内毒素，还希望这样的蛋白质纯化方法在蛋白质浓度或者生物活性没有明显损失的情况下，有效的使其内毒素含量下降到一定限度，达到可以作为药物或者免疫原性组合物施用。这不仅是重组人生长激素生产中亟需解决的关键点，也是重组蛋白生产中亟需解决的关键点。
因此我们开发出了一种利用大肠杆菌表达重组人生长激素的生产过程去除内毒素的方法，并且此方法通过改变参数也可以适用于其他大肠杆菌表达重组蛋白生产中去除内毒素。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种使用金属螯合色谱法去除重组人生长激素内毒素的方法，有效去除大肠杆菌表达重组人生长激素中的内毒素，降低内毒素与蛋白质形成蛋白质-内毒素复合物，以此来达到大量去除甚至完全去除内毒素的目的。
为达成上述目的，本发明提供如下技术方案：
使用金属螯合色谱法去除重组人生长激素内毒素的方法，包括如下步骤：
步骤1、菌体沉淀重悬：用含有0.1-5％醇类或非离子型表面活性剂的缓冲液，按照菌体沉淀质量比缓冲液体积为1∶5-20的比例对菌体沉淀进行重悬，至混合均匀；
步骤2、细胞破碎：将重悬好的菌体进行细胞破碎；
步骤3、破碎上清孵育：将破碎后的细胞离心后弃沉淀取上清，对上清进行搅拌孵育；
步骤4、样品过滤：将孵育完毕的重组人生长激素融合蛋白进行过滤，得到重组人生长激素融合蛋白样品；
步骤5、IMAC纯化：取IMAC金属螯合色谱柱，用纯化水对柱进行清洗；
步骤6、碱液预洗：用一定浓度的碱液对金属螯合色谱柱进行清洗，以去除原柱上残留的内毒素；
步骤7、平衡：用平衡缓冲液对金属螯合色谱柱进行平衡；
步骤8、样品装载：将重组人生长激素融合蛋白样品装载上金属螯合色谱柱，确保重组人生长激素融合蛋白样品与填料结合；
步骤9、柱洗涤：用平衡缓冲液对柱进行洗涤，去除未挂上柱子的杂质；
步骤10、去污剂洗脱内毒素：用一定浓度的非离子型去污剂对内毒素进行洗脱；
步骤11、洗涤：用平衡缓冲液对柱进行洗涤，去除柱子上残留的非离子型去污剂及内毒素；
步骤12、目标蛋白洗脱：使用常规金属螯合色谱柱的洗脱方式对目标蛋白进行洗脱。
作为优选，所述醇类为乙醇、烷二醇或异丙醇。
作为优选，所述非离子型表面活性剂为TritonX-100、TritonX-114、吐温80、吐温40、吐温20中的一种或多种。
作为优选，所述步骤2中，细胞破碎的方法为使用机械应力、空化应力、紊流应力或生物和化学裂解法。
作为优选，所述步骤3中，孵育温度为0-25℃，孵育时间为6-24h。
作为优选，所述步骤4中，过滤孔径为0.2-2μm。
作为优选，所述步骤7、步骤9及步骤11中，所述平衡缓冲液为采用超纯水或注射用水配置的缓冲液。
作为优选，所述非离子型去污剂中非离子型表面活性剂的浓度为0.1-5％。
作为优选，所述步骤7中，平衡体积为5-20CV。
作为优选，所述步骤10中，洗脱体积为5-20CV。
本发明与现有技术相对比，其有益效果在于：
本发明提供一种简单有效的方法来纯化蛋白质样品，并且有效的去除其中的内毒素，从内毒素-蛋白质复合物中分离出内毒素，并在蛋白质浓度或者生物活性没有明显损失的情况下，使其内毒素含量下降到一定限度。
进一步地说，本发明采用醇类或非离子型表面活性剂通过疏水作用竞争性与蛋白质争夺内毒素，来降低蛋白质和脂多糖结合体水平,在纯化开始就避免蛋白质与内毒素形成复合体；再将目标蛋白装载至IMAC金属螯合色谱柱并通过非离子型表面活性剂对内毒素进行洗脱，以此来达到大量去除甚至完全去除内毒素的目的。
附图说明
图1是本发明的工艺流程图。
图2是本发明实施例的IMAC纯化层析图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面通过实施例并结合附图，对本发明作进一步具体的说明。
实施例：参照图1，本实施例提供一种使用金属螯合色谱法去除重组人生长激素内毒素的方法，该方法的实施对象为在分子生物学阶段构建含有多聚组氨酸标签(6×His,8×His或10×His)的融合重组人生长激素，经种子液培养、发酵罐接种、下罐离心得到的菌体，在大肠杆菌细胞破碎前或过程中添加一定量的醇类(如乙醇、烷二醇、异丙醇等)或者非离子型表面活性剂(如TritonX-100、TritonX-114、吐温80、吐温40、吐温20等)，通过疏水作用竞争性与蛋白质争夺内毒素，来降低蛋白质和脂多糖结合体水平,在纯化开始就避免蛋白质与内毒素形成复合体。再将目标蛋白装载至IMAC金属螯合色谱柱(金属螯合剂如Cu2+,Ni2+,Co2+,Zn2+,Fe3+等具有d层空价电子轨道的过渡金属，与填料络合方式包括IDA,TED,NTA等)上，再用非离子型表面活性剂(如TritonX-100、TritonX-114、吐温80、吐温40、吐温20等)，对内毒素进行洗脱，最后再用常规的金属螯合色谱柱的洗脱方式对目标蛋白进行洗脱(如含有Gly、His、咪唑、氨的缓冲液及降低缓冲液PH的方式)。
作为本发明的优选实施例，具体操作步骤如下：
步骤1：菌体沉淀重悬，用含有1％吐温80的Tris-HCl缓冲液(50mMTris-HCl，300mMNaCl，PH8.00)按照1:10(W(g)/V(mL)，菌体沉淀质量比缓冲液体积)对菌体沉淀重悬30min，至混合均匀(无可见微粒)。
步骤2：细胞破碎，将重悬好的菌体，使用高压匀浆机，4℃，600-800bar下均质3次破碎细胞。
步骤3：破碎上清孵育，将破碎后的细胞离心后弃沉淀取上清，对上清进行搅拌孵育，孵育温度20℃，孵育时间12h。
步骤4：样品过滤，将孵育完毕的重组人生长激素融合蛋白进行过滤，过滤孔径为0.45μm。
步骤5：IMAC纯化，取IMAC金属螯合色谱柱，使用Cytiva Ni Sepharose FF金属螯合色谱填料，用纯化水对柱子进行清洗。
步骤6：碱液预洗，用一定浓度的碱液(0.1-1mol/L NaOH溶液，优选为0.5mol/LNaOH溶液)对金属螯合色谱柱进行冲洗，以去除原柱上残留的内毒素，冲洗时间为3h，具体时间视填料耐受碱液而定。
步骤7：平衡，用与菌体沉淀重悬相同但不含有醇或者非离子型表面活性剂的超纯水或注射用水配制的缓冲液对金属螯合色谱柱进行平衡，优选使用超纯水配制的50mMTris-HCl，300mMNaCl,PH8.00。平衡体积5-20CV(CV为一个色谱柱柱体积)。
步骤8：样品装载，将破碎后孵育过滤的重组人生长激素融合蛋白样品装载至金属螯合色谱柱，确保其与填料已经结合。
步骤9：柱洗涤，用平衡缓冲液对柱子进行洗涤，去除未挂上柱子的杂质，平衡缓冲液优选使用超纯水配制的50mMTris-HCl，300mMNaCl,PH8.00。
步骤10：去污剂洗脱内毒素，用一定浓度(0.1-5％)的非离子型去污剂(如TritonX-100,TritonX-114.吐温80,吐温40，吐温20等)对内毒素进行洗脱，洗脱体积为5-20CV，优选使用超纯水配制的50mMTris-HCl，300mMNaCl,PH8.00.含1％TritonX-114的非离子型去污剂。
步骤11：洗涤，用平衡缓冲液柱子进行洗涤，去除柱子上残留的非离子型去污剂及内毒素，平衡缓冲液优选使用超纯水配制的50mMTris-HCl，300mMNaCl,PH8.00。
步骤12：目标蛋白洗脱，使用常规的金属螯合色谱柱的洗脱方式对目标蛋白进行洗脱，优选使用50mMTris-HCl,300mMNaCl,300mM咪唑，PH8.00对目标蛋白进行洗脱。
采用上述实施例的优选方案，对含有多聚组氨酸(6×His标签)标签的重组人生长激素融合蛋白进行金属螯合色谱柱纯化，与未采用该方案和仅在柱纯化阶段用非离子型表面活性剂洗脱内毒素的方法进行对比，用鲎试剂法对洗脱的目标蛋白进行内毒素检测，用SDS-PAGE及Lowry对蛋白质收率进行检测，结果表明(对比结果见表1，IMAC纯化层析图见图2)，采用本发明实施例的优选方案，内毒素含量为小于9.92EU/mg,收率为81.82％；采用柱纯化阶段用非离子型表面活性剂洗脱内毒素内毒素含量为166-333EU/mg，收率为61％，(收率较低可能是因为内毒素-蛋白质复合物被非离子型表面活性剂共洗脱)，不采用该方案内毒素含量为大于25000EU/mg,收率为83％。由此可见，仅一步纯化就将内毒含量降低了约2000倍以上，配合后续纯化步骤，内毒素含量将会更低，达到静脉注射液的药典标准。
表1去除内毒素效果对比图
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
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