一种液相合成乙酰基六肽-8的方法
阅读说明：本技术 一种液相合成乙酰基六肽-8的方法 (Method for liquid-phase synthesis of acetyl hexapeptide-8 ) 是由 殷世清 翟涛 刘焕赠 杜传强 于 2021-11-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及多肽合成领域,特别涉及一种液相合成乙酰基六肽-8的方法,本发明首先采用液相合成三个二肽单体：Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-OH、H-Met-Gln(Trt)–OH和H-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH-(2),然后再顺序合成四肽和六肽的策略合成乙酰基六肽-8。本发明方案扩大了合成规模,减少了有机溶剂的使用,降低了乙酰基六肽-8的生产成本,有利于乙酰基六肽-8在化妆品行业的推广应用。(The invention relates to the field of polypeptide synthesis, in particular to a method for synthesizing acetyl hexapeptide-8 in a liquid phase, which firstly adopts the liquid phase to synthesize three dipeptide monomers: Ac-Glu (O-tBu) -Glu (O-tBu) -OH, H-Met-Gln (Trt) -OH and H-Arg (Pbf) -NH 2 And then acetyl hexapeptide-8 was synthesized following the strategy of sequential synthesis of tetrapeptides and hexapeptides. The scheme of the invention enlarges the synthesis scale, reduces the use of organic solvents, reduces the production cost of the acetyl hexapeptide-8, and is beneficial to the popularization and application of the acetyl hexapeptide-8 in the cosmetic industry.)
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种乙酰基六肽-8的制备方法。
技术背景
乙酰基六肽-8，别称阿基瑞林，英文名Argireline。乙酰基六肽-8参与竞争 SNAP-25在融泡复合体的位点，从而影响复合体的形成；当融泡复合体稍有不稳定，囊泡不能有效释放神经递质，从而致使肌肉收缩减弱，防止皱纹的形成。所以它可以遏制神经传导素乙酰胆碱的释放，减弱肌肉的收缩，从而减少动态纹表情纹，减少皱纹产生，增加弹力蛋白的活性，维持表皮更新能力使肌肤光滑紧致，挑战逆转肌龄，展示肌肤年轻光彩。
乙酰基六肽-8是一种仿生肽，为模仿SNAP-25蛋白的N端并由六个氨基酸组成的寡肽。他的多肽结构来源于人体自身的SNAP-25（突触小体相关蛋白）端的一个片段，并进行了一些化学修饰，其具体的序列为：Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2，CAS号：616204-22-9，分子式：C34H60N14O12S，分子量：888.91。结构中含有六个氨基酸残基，为化学合成获得的一种短肽产品。
专利CN103694316B公开了一种阿基瑞林的固相制备方法，采用氨基树脂为固相载体，利用Fmoc化学策略制备得到阿基瑞林（乙酰基六肽-8），此方法的合成受到固相合成规模的限制，难以规模化放大生产，不利于乙酰基六肽-8在化妆品行业的推广应用。
乙酰基六肽-8，作为当前应用最广的祛皱明星功效活性成分，市场需求量逐年增加，现有的固相合成工艺，需要消耗大量的有机溶剂，从而导致生产成本居高不下，而且给生产企业带来较大的环保压力，所以开发适合规模化生产乙酰基六肽-8的制备工艺尤为重要。本申请的技术方案采用液相法合成乙酰基六肽-8，扩大了合成规模，减少了有机溶剂的使用，降低了乙酰基六肽-8的生产成本，有利于乙酰基六肽-8在化妆品行业的推广应用。
发明内容
为解决合成过程中存在的以上问题，本发明提供了一种液相合成乙酰基六肽-8的方法，本发明提供的技术方案如下：
一种液相合成乙酰基六肽-8的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)采用Ac-Glu(O-tBu)-OSu和H-Glu(O-tBu)-OH为原料,在碱性条件下合成Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-OH，然后制备成Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-OSu;
(b)采用Z-Met-OSu和H-Gln(Trt)-OH为原料,在碱性条件下合成Z-Met-Gln(Trt)–OH,然后脱掉保护基Z,得到H-Met-Gln(Trt) –OH;
(c)采用Z-Arg(Pbf)-OH和H-Arg(Pbf)-NH2为原料，在偶联剂存在下反应得到Z-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2，然后脱掉保护基Z,得到H-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2;
(d)采用Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-OSu和H-Met-Gln(Trt) –OH在碱性条件下合成Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-Met-Gln(Trt) –OH；
(e)Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-Met-Gln(Trt)–OH和H-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2在偶联剂存在下反应得到Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-Met-Gln(Trt)–Arg(Pbf) -Arg(Pbf)-NH2；
(f)Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2脱掉侧链保护基团，经纯化，冻干得到乙酰基六肽-8精肽。
优选的，步骤(a)中，制备Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-OH的具体操作步骤为：取碱A溶解在溶剂B中，配成碱性溶液；在低温浴下将H-Glu(O-tBu)-OH溶解于配置好的碱溶液中，且溶解后溶液仍显碱性；低温下向反应液中加入Ac-Glu (O-tBu)-OSu/溶剂C溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应,经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到二肽Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-OH。
优选的，步骤(a)中，制备Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-OSu的具体操作步骤为：
将Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-OH和HOSu溶解于溶剂C中，低温搅拌下加入DCC/溶剂C的溶液，TLC监测终点，经过滤、浓缩、析晶、重结晶得到Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-OSu。
优选的，步骤(b)中，制备Z-Met-Gln(Trt) –OH的具体操作步骤为：取碱A溶解在溶剂B中，配成碱性溶液；在低温浴下将H-Gln(Trt)-OH溶解于配置好的碱溶液中，且溶解后溶液仍显碱性；低温下向反应液中加入Z-Met-OSu/溶剂C溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应,经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到二肽Z-Met-Gln(Trt) –OH。
优选的，步骤(c)中，制备Z-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2的具体操作步骤为：将H-Arg(Pbf)-NH2溶解在溶剂C中，低温浴下加入Z-Arg(Pbf)-OH/偶联剂/溶剂C的混合溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应,TLC监测反应终点；经浓缩、析晶、重结晶，得到二肽Z-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2。
优选的，步骤(d)中，制备Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-Met-Gln(Trt) –OH的具体操作步骤为：取碱A溶解在溶剂B中，配成碱性溶液；在低温浴下将H-Met-Gln(Trt) –OH溶解于配置好的碱溶液中，且溶解后溶液仍显碱性；低温下向反应液中加入Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-OSu/溶剂C溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应,经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到四肽Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)–Met-Gln(Trt) –OH。
优选的，步骤(e)中，制备Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf) -Arg(Pbf)-NH2的具体操作步骤为：将H-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2溶解在溶剂C中，低温浴下加入Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-Met-Gln(Trt)-OH/偶联剂/溶剂C的混合溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应,TLC监测反应终点；经浓缩、析晶、重结晶，得到Ac-Glu(O-tBu)-Glu(O-tBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf) -Arg(Pbf)-NH2。
优选的，步骤（f）中,脱掉侧链保护基团试剂为加入体积比1-5%清除剂的TFA溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、苯酚、水和TIS中的一种或几种；更为优选的裂解试剂配比为：TFA/苯甲硫醚/水/TIS=87/5/3/5。
优选的，步骤(b)和步骤(c)中，保护基Z的脱保护试剂为H2/10%钯-碳催化剂或甲酸/10%钯-碳催化剂。
优选的，本发明上述步骤中，所述的碱A溶解在溶剂B中配成的碱性溶液，可以是氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾等水溶液或与水互溶的有机溶剂的混合溶液；同时也可以是三乙胺、二乙胺、N,N-二异丙基乙胺等有机碱的有机溶液。
所述的溶剂C可以是四氢呋喃、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮中的一种或一种以上的混合液；所述的偶联剂为以下组合DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/HOBT/ DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA的一种。
相对于现有技术，本发明的有益效果是：本申请的技术方案采用液相2+2+2策略合成乙酰基六肽-8，扩大了合成规模，减少了有机溶剂的使用，降低了乙酰基六肽-8的生产成本，有利于乙酰基六肽-8在化妆品行业的推广应用。
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明进行详细说明，但不限定本专利；根据本发明改变原料的投料比、或是反应溶剂或及缩合剂等，均在本发明的保护范围内。
说明书和权利要求书中所使用的缩写含义如下：
tBu：叔丁基；
Pbf：2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基；
Trt：三苯甲基；
DCM：二氯甲烷；
DMF：N,N-二甲基甲酰胺；
DIPEA ：N,N-二异丙基乙胺；
DIC：N,N-二异丙基碳二亚胺；
HBTU：苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐；
HATU：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；
TBTU：O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸；
HOBT：1-羟基苯并三唑；
HOAT：1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑；
TFA：三氟乙酸；
TIS：三异丙基硅烷；
Su：琥珀酰亚胺基。
实施例1：Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH的合成
准确称取H-Glu(O-tBu)-OH4.06Kg(20mol)于100L反应釜中，加入10%碳酸钠水溶液25L，搅拌下溶解；待溶清后，低温下滴加入Ac-Glu(OtBu)-OSu 6.84kg(20mol)/25L四氢呋喃溶液，搅拌反应，TLC监测终点；经减压浓缩、调酸、乙酸乙酯萃取、析晶、重结晶、干燥，得纯度99.1%的二肽单体Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH7.02kg,收率81.6%。
实施例2：Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OSu的合成
准确称取Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH 7.00kg(16.28mol)和HOSu2.30kg(20mol)于100L反应釜中，加入四氢呋喃25L，搅拌下溶解；待溶清后，低温下滴加入DCC4.66kg (20mol)/25L四氢呋喃溶液，搅拌反应，TLC监测终点；经过滤、减压浓缩、析晶、重结晶，25L四氢呋喃复溶待用。
实施例3：Z-Met-Gln(Trt) –OH的合成
准确称取H-Gln(Trt)-OH7.77Kg(20mol)于100L反应釜中，加入10%碳酸钠水溶液25L，搅拌下溶解；待溶清后，低温下滴加入Z-Met-OSu 7.61kg(20mol)/25L四氢呋喃溶液，搅拌反应，TLC监测终点；经减压浓缩、调酸、乙酸乙酯萃取、析晶、重结晶、干燥，得纯度99.2%的二肽单体Z-Met-Gln(Trt) –OH11.05kg,收率82.2%。
实施例4：H-Met-Gln(Trt)–OH的合成
准确称取Z-Met-Gln(Trt)–OH11.00Kg(16.4mol)于100L反应釜中，加入30升甲醇溶解，加入1.10kg 10%钯-碳催化剂/10L甲醇，然后加入6.56kg甲酸/10L甲醇,搅拌反应，TLC监测终点；经过滤、浓缩、析晶、重结晶、干燥，得纯度99.2%的二肽单体H-Met-Gln(Trt)–OH8.21kg,收率96.1%。
实施例5：Z-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2的合成
准确称取H-Arg(Pbf)-NH29.50Kg(20mol)于100L反应釜中，加入四氢呋喃25L，搅拌下溶解；待溶清后，低温下滴加入Z-Arg(Pbf)-OH·CHA13.20kg(20mol)、DIC 2.28kg(20mol)、HOBT2.70kg(20mol)、25L四氢呋喃溶液，搅拌反应，TLC监测终点；经减压浓缩、调酸、乙酸乙酯萃取、析晶、重结晶、干燥，得纯度99.2%的二肽单体Z-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH215.71kg,收率81.2%。
实施例6：H-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2的合成
准确称取Z-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH215.70kg(16.23mol)于100L反应釜中，加入30升甲醇溶解，加入1.60kg 10%钯-碳催化剂/10L甲醇，然后加入6.56kg甲酸/10L甲醇,搅拌反应，TLC监测终点；经过滤、浓缩、析晶、重结晶、干燥，得纯度99.2%的二肽单体H-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH213.06kg,收率96.4%。
实施例7：Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)–OH的合成
准确称取H-Met-Gln(Trt)–OH8.20Kg(15.76mol)于100L反应釜中，加入10%碳酸钠水溶液25L，搅拌下溶解；待溶清后，低温下滴加入实施例2所得Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OSu四氢呋喃溶液，搅拌反应，TLC监测终点；经减压浓缩、调酸、乙酸乙酯萃取、析晶、重结晶、干燥，得纯度98.1%的四肽Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-OH11.78kg,收率80.2%。
实施例8：Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2的合成
准确称取H-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH213.05Kg(15.64mol)于100L反应釜中，加入四氢呋喃30L，搅拌下溶解；待溶清后，低温下滴加入：
（1）Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-OH 11.77kg (12.64mol)，
（2）DIC1.71kg(15mol)，
（3）HOBT2.03kg(15mol)，
（4）25L四氢呋喃溶液，搅拌反应，TLC监测终点；经减压浓缩、调酸、析晶、重结晶、干燥，得纯度95.1%的六肽Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH217.80kg,收率80.6%。
实施例9：Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2的制备
将实施例8得到的17.80kg六肽：
Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2，加入到冷冻的50L裂解液(体积配比为TFA/苯甲硫醚/TIS/H20=87 /5/3/5)中，室温下搅拌反应4h；反应结束，料液中加入500L冷冻甲叔醚，析出白色沉淀；静置30min后，过滤，甲叔醚洗涤6次，真空干燥得粗肽11.05kg,粗肽收率98.6%，纯度93.6%。
实施例10：乙酰基六肽-8精肽的制备
将实施例9所得粗肽溶解，用0.45μm微孔滤膜过滤后，用内径为200mm C18制备柱，经纯化、转盐，冻干后得乙酰基六肽-8精肽9.15kg，纯度99.91%，收率82.8%。
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