具体实施方式

在一方面中，本发明涉及包含胶原的生物聚合物纤维，其中该生物聚合物纤维具有一种或多种以下特性：

约1MPa～约1,700MPa的极限拉伸强度；

约10MPa～约20,000MPa的弹性模量；

约2％～约45％伸长率的断裂应变；

约10μm～约90μm的平均纤维直径；

在室温下在DPBS中浸泡至少约1小时后维持其强度；以及

其中纤维丝展现有序的、纵向取向的结构。

在另外的方面中，本公开内容涉及包含至少一种包含生物聚合物纤维的生物聚合物片材的用于支持软组织损伤的修复的可植入的生物聚合物支架，其中所述生物聚合物包含胶原且生物聚合物纤维具有一种或多种以下特性：

约1MPa～约1,700MPa的极限拉伸强度；

约10MPa～约20,000MPa的弹性模量；

约2％～约45％伸长率的断裂应变；

约10μm～约90μm的平均纤维直径；

在室温下在DPBS中浸泡至少约1小时后维持其强度；以及

其中纤维丝展现有序的、纵向取向的结构。

纤维展现有序的、纵向取向的结构，并且在将纤维以及由本发明的纤维制成的装置植入到对象中之后允许细胞浸润。

在另外的方面中，本公开内容包括可植入的生物聚合物支架，其用于人体部位的修复或取代。

生物聚合物纤维典型地由胶原形成。特别地，端胶原(telocollagen，具端胶原)典型地从任何来源(人类、牛、重组体、水母等)得到。可以将以下生物可接受的聚合物与胶原共混以形成生物聚合物纤维：例如丝素蛋白；其它类型的胶原例如II型胶原；纤维蛋白/纤维蛋白原；基底膜蛋白；透明质酸、聚环氧乙烷、聚乙二醇、聚己内酯、聚乙烯(polyethylnene)、聚羟基丁酸酯、PDLA；PDLLA和高分子量PDLLA；PLGA；及其共混物。

在仍另外的方面中，本公开内容涉及生产生物聚合物纤维的方法，其包含在酸溶液中将胶原溶解以形成胶原溶液的步骤。在该方法的一种实施方式中，随后使胶原以第一速度通过具有第一直径的第一针头以具有第一速度，与此同时使成形缓冲液以第二体积流速通过第二针头，第二针头同轴地围绕第一针头且具有大于第一直径的第二直径，以在胶原溶液周围形成外层覆盖物以形成同轴流动。成形缓冲液通过第二针头的第二体积流速是胶原溶液通过第一针头的第一体积流速的至少约两倍。

使同轴流动的胶原和成形缓冲液以足以形成纤维的速度和时间通过包含纤丝成形浴的反应区，将纤维以第三速度提取至线轴上，该第三速度高于第一速度，并且典型地是将纤维挤出通过脱水浴的速度的2倍，足以增加分子排列并且降低纤维直径。随后可以将纤维交联并干燥。

在还有另外的方面中，本公开内容涉及生产生物聚合物纤维的替代方法。在此实施方式中，制备胶原溶液并将其以足以形成纤维的速度和时间注射到包含纤维成形浴(例如成形缓冲液的浴)的反应区中。以挤出速度的约2～约10倍快的速度将纤维提取到线轴上，以增加分子排列并并且降低纤维直径。随后可以将纤维交联并干燥。

在本公开内容的不同实施方式中，将胶原或胶原与其它合适的生物聚合物制成生物聚合物或胶原纤维(生物聚合物纤维或胶原纤维)。为方便理解，将描述本公开内容的特征，因为其涉及胶原。然而，可以将胶原与合适的生物聚合物以不同的组合与比例共混或结合以得到本文所公开的类型的纤维。

贯穿说明书，可以将可典型地在典型的制造工艺期间一起进行的步骤，例如洗涤并干燥或浸泡并干燥，酌情(as appropriate)进行或重复以实现所需的结果。例如，在实施方式中，在推进至下一个步骤前可以将组合物洗涤并干燥。在一些实施方式中，在推进至下一个加工步骤前可以将材料洗涤第二次并干燥第二次，或可以将其洗涤第二次随后推进。

在其它实施方式中，第一洗涤或干燥步骤可以设为任选的。因此，典型地经洗涤随后经干燥的材料可以直接去到干燥步骤，并随后继续前进到下一个加工步骤。本领域技术人员(skilled practitioner)可以识别可以重复或消除步骤的情况。

由纤维制成的构造物，例如支架，允许细胞向内生长，即，来自向其中植入了纤维(和由纤维制成的装置)的动物的不同类型的细胞将向支架的孔中生长，优选地与在支架中的纤维对齐。构造物和支架包含单层和多层可以用作已知修复特征的替代物的制品，例如用以将身体部位例如断裂的跟腱(阿喀琉斯跟腱，Achilles tendon)的相对的两端(opposing end)重新附着的缝合线。除了提供用于修复被撕裂的或受损的腱的支持结构以外，本公开内容的实施方式也适用于韧带修复。因此，可使用支架或本发明来提供对其支持的其它示例性的韧带包括ACL、MCL、PCL、UCL以及其它人类的和动物的韧带。可使用本公开内容的产品的其它外科手术包括上囊重建(上关节囊重建，superior capsularreconstruction)，其为对于上肩袖撕裂(superior rotator cufftear)和特别地对于无法修复的或难以修复的部分或完全撕裂的治疗选项。相似地，多层片材可用以叠加修复(overlap a repair)以将其强化。

特别地，本公开内容的实施方式可以适用于修复韧带、腱和所有类型动物的其它软组织。例如本公开内容的胶原纤维可以用以将被撕裂的韧带和腱重新附着，甚至那些仅具有部分撕裂的(韧带和腱)。还可以将多个纤维捻制、捆束、编织、交织或以别的方法排列以改进形状因子，其使用起来比操作单根纤维更容易，例如在外科手术期间。改进形状因子使得可容易地精确设置(定位)纤维或平台(platform)。可以构建其它形状因子以用作对撕裂的天然身体部位的强化物或内部支撑物。支撑物将一根骨头连接至另一根骨头来支持关节。典型地，支撑物形成等距关节，具有复原的生物力学和天然关节的等距性。

按照本公开内容的实施方式的所生产的胶原纤维的功效可以通过研究在例如兔子中进行的修复而说明。特别地，兔子膝盖的强化物和内部支撑物和过度缝合(缝制，over-sewn)的结构适合用于评价本公开内容的胶原纤维和由该纤维制成的结构体的性质和特性。

图1说明了用于制造胶原纤维的系统和方法的实施方式。该系统和方法可以被描述为包含4个部分或制造区域。在第一部分中制备胶原溶液，并在第二部分中形成胶原纤维。随后在第三部分中将胶原纤维收集，并随后可以在第四部分、后处理中或处理结束时将胶原纤维后加工以获得湿态的或干态的胶原纤维。

图1中说明的系统和方法中的步骤可以分为以下4类：

类别 名称 包括的步骤

1 制备胶原溶液 105-120

2 形成胶原纤维 125-130

3 收集胶原纤维 135-150

4 后处理或结束处理 155-180

如在图1的步骤105所见，将胶原与酸性溶液结合并在步骤110充分搅拌。在一些实施方式中，酸是约0.01M～约0.50M的乙酸。在其它实施方式中，酸是约0.01M～约0.50M的盐酸。可以在步骤115将溶液脱气，并随后在步骤120离心以去除残留气泡。在步骤125中，将所得的胶原溶液从针头挤出，并且可以存在与之同轴的供应成形缓冲溶液的第二针头。在步骤130中，所得的正在形成(成形)的纤维可以继续在成形管中通过。所得的产物是成形的胶原纤维。

纤维随后继续至收集系统，其中在步骤135将纤维与成形缓冲溶液分离并在步骤140脱水。在步骤145收取胶原纤维并在步骤150空气干燥。随后可以进行后加工，如在步骤155、步骤160、步骤165和步骤170所说明。在步骤155将在线轴上的经空气干燥的胶原纤维浸没在交联用的溶液中，在步骤160任选地洗涤，在步骤165空气干燥，并在步骤170干贮(desiccate)以形成经干燥的纤维。如在图1中通过点划线所说明的，在步骤160可以将材料任选地洗涤，在步骤165干燥，并回到洗涤步骤160。

或者，将胶原注射到成形溶液的浴中以形成纤维。在该系统中，用于成形缓冲液的同轴注射的第二针头不是必须的。通过在步骤140的脱水将如此注射的胶原引至收集系统。随后按照余下的加工步骤加工纤维。

图1提供了用于进行本公开内容的实施方式的系统和方法的概览(generalizedview)。额外的细节和公开内容包括在说明书的以下具体的实施例和实施方式中。

在实施方式中，本公开内容涉及用于生产生物聚合物纤维的方法，其包含在酸性溶液中将胶原溶解以形成胶原溶液的步骤。随后使胶原以第一体积流速通过具有第一直径的第一针头以具有第一速度，与此同时使成形缓冲液以第二体积流速在同轴地围绕第一针头并且具有大于第一直径的第二直径的第二针头中通过以在胶原溶液周围形成外层覆盖物以形成同轴流动。成形缓冲液通过第二针头的第二体积流速是胶原溶液通过第一针头的第一体积流速的至少2倍。

使同轴流动的胶原和成形缓冲溶液以足以形成纤维的体积流速和时间通过包含纤丝成形浴的反应区，将纤维以高于第一速度的第三速度提取到线轴上。该第三速度足以增加分子排列并且降低纤维直径，典型地是将纤维挤出通过脱水浴的速度的约2倍。随后将纤维交联并干燥。

在另外的实施方式中，本公开内容涉及用于生产生物聚合物纤维的替代方法。制备胶原溶液并将其以足以形成纤维的速度和时间注射到包含纤丝成形浴例如成形缓冲液的浴的反应区中。用以形成成形缓冲液的同轴流动的第二针头不是必须的。相反，将胶原纤维直接注射到纤丝成形浴中，并随后将其运送通过脱水浴。通过将纤维以注射速度的约2～约4倍快的速度提取到线轴上而将纤维运送通过以增加分子排列并且降低纤维直径。随后可以将纤维交联并干燥。

将方法1300的实施方式汇总在图13中。如所说明的那样制备胶原溶液。在步骤1305形成胶原溶液。可以将生物聚合物与胶原混合。在酸性溶液中将胶原溶解以形成黏稠的溶液。在步骤1310搅拌溶液以确保充分混合。经混合的溶液可能具有截留(夹带)的气体，并因此可以在脱气器步骤1315中将其脱气一次或多次。随后可以将胶原溶液离心，如在步骤1320所说明的。任选地，可以重复脱气/离心的步骤以降低在溶液中截留的气体的体积，如通过图1上的点划线以及如图13上的特征1316所示出的。

通过与用作纤维芯的外层覆盖物的成形缓冲溶液同轴共挤出使如此制备的胶原溶液成形为胶原纤维，如在步骤1325所示。成形缓冲溶液的体积流速典型地是正在成形的胶原的体积流速的至少2倍。该设置抑制了单独的纤丝的形成；使纤维伸展和取向；并可以通过给予纤维流动诱导的结晶而使纤维的表面光滑。

随后收集胶原纤维。随着胶原纤维的成形在步骤1330完成，随后在步骤1335将胶原与成形缓冲溶液分离，并在步骤1340将其在脱水用的溶液中脱水。随后在步骤1345中将经脱水的胶原在旋转的线轴上收集，其通过以高于且典型地约二倍于从脱水溶液的步骤1340中供应纤维的速率的速率旋转而使纤维进一步地伸展。随后在步骤1350中在线轴上将如此收集的纤维空气干燥。

在替代的实施方式中，通过直接注射到成形缓冲溶液中使胶原溶液成形为胶原纤维。因此，将步骤1325跳过。将纤维收集，与成形缓冲溶液分离，并在步骤1340在脱水用的溶液中脱水。在步骤1345中在旋转的线轴上收集纤维，线轴以成形速度的约2倍～成形速度的约4倍的速度收集纤维。

随后可以对已经在线轴上空气干燥的纤维进行后加工。可以在步骤1355将纤维在交联用的溶液中交联，并随后可以在步骤1360将其冲洗。随后在步骤1365将纤维空气干燥并在步骤1370干贮以获得干态的经交联的胶原纤维。

用于制造胶原纤维的装备是由适用于抵抗任何用以按照本公开内容的实施方式制造胶原纤维的原材料的侵害的常规构筑材料制成的。金属、塑料和其它材料具有适合抵抗在制造胶原纤维期间的原材料、中间产物、溶剂和产物的侵害的性质和特性。

本公开内容的另外的方面涉及胶原纤维，其具有一种或多种以下特性：

约1MPa～约1,700MPa的极限拉伸强度；

约10MPa～约20,000MPa的弹性模量；

约4％～约12％伸长率的断裂应变；

约16μm～约70μm的平均纤维直径；以及

在生物流体中浸泡约1小时后至少维持其强度。

纤维展现有序的、纵向取向的结构，并且纤维允许细胞生长的浸润。

该实施方式的纤维按照本公开内容的实施方式的方法制造。胶原可以从很多来源和以不同的形式得到。胶原纤维的品质可以与所使用的原材料的品质相关。在一些实施方式中，典型地使用了牛胶原。牛胶原可以以天然形式或作为冻干粉得到。

可以通过在酸性溶液中溶解将牛胶原202制成黏稠的溶液203。无机酸例如盐酸和有机酸例如乙酸均可用以制备胶原溶液。例如，在实施方式中，可以在容器210中在约0.01M～约0.5M的乙酸201中将具有完好无损的端肽末端I型牛胶原溶解以形成包含约16mg胶原/mL溶液的黏稠的溶液203。溶液浓度范围可为约10mg胶原/mL溶液～约19mg胶原/mL溶液。在另外的实施方式中，将冻干的具有附着的端肽末端的I型牛真皮混合到无机酸例如具有约0.01M～约0.5M的浓度的HCl中以形成具有约10mg胶原/mL溶液～约19mg胶原/mL溶液、典型地约16mg胶原/mL溶液的浓度的溶液。

在实施方式中，允许将胶原溶解至少约14小时，典型地至少约15小时，以及更典型地至少约16小时。在一些实施方式中，在脱气器300中将胶原溶液301脱气以从胶原溶液301中去除气泡。屏筛(screen)304确保胶原不通过脱气器的气流出口303而被抽出脱气器。脱气器303典型地运行(is operated)在约0psia～约3psia的压强。可以使胶原溶液经受(exposed to)最高达约2个脱气循环，典型地约1～约2个循环。脱气去除了可能会干预和扰乱纤维状胶原的挤出的气泡。

随后可以在离心机中将经脱气的胶原进一步脱气。在图4中说明了离心机400，其中顶部408打开，使转筒403可见。将待离心材料的管和用以确保离心机平衡的管放置到在旋转转筒(rotating bowl)409中的槽中。壳体405足够坚固以遏制任何碎片，如果任何内部部件在使用期间破损。

图5说明了具有容器转筒(containment bowl)501和盖子508的离心机500。离心机逆时针快速旋转，如通过运动箭头505所说明。管502说明了含有胶原溶液503的离心前的管。如可以看到的，胶原溶液是均匀的并且已经在其他方面均匀的胶原溶液512中捕集了气泡(has trapped bubbles)。

以约400rcf～约4,000rcf、典型地约600rcf～约1,000rcf、更典型地约700rcf～约800rcf的相对离心力或g值的离心适合于在约3分钟～约15分钟、典型地约4分钟～10分钟、更典型地约5分钟～约7分钟以内将截留气泡的体积降低至基本上0。

在一些实施方式中，可以通过在步骤之间交替而重复一对关联的步骤。例如，可以在脱气器303中将胶原加工一个循环，随后在离心机500中加工5分钟，并随后回到脱气器303进行一个循环，随后再次离心5分钟。以这种交替方式运行可以提供改进的效率。可以通过利用更短的处理时间实现改进的效率以获得指定量的气泡或获得比线性加工(linearprocessing)所可以获得的更好的结果。

随后将胶原和溶液一起共挤出以形成胶原纤维。在一些实施方式中，在同轴流体的芯部将胶原溶液挤出有帮助于胶原纤维的成形。

在本公开内容的一些实施方式中，随后将胶原引至同轴流动针头的中心，而将成形缓冲溶液引至外部针头。因此，成形缓冲溶液在胶原的周围形成了外层覆盖物。如在图6中所说明的，通过泵655将胶原溶液650泵送并且作为胶原流601引至内部针头603中。同时将成形缓冲溶液660作为成形缓冲溶液流606引至外部针头604。外部针头604与内部针头603同轴使得成形缓冲溶液在胶原中心芯部周围形成外层覆盖物。随着材料离开针头流至包含纤丝成形浴的反应区701中(在图7中所示)，成形缓冲溶液607已在开始作为固体纤维成形的胶原纤维602周围形成了外层覆盖物。

通过下游加工使所得的产物胶原纤维产物的直径小于中心针头(centralneedle)的内部直径。中心针头的直径可以大于成品纤维的目标直径。在一些实施方式中，中心针头的内部直径是约0.05mm～约100mm；在一些实施方式中，中心针头的内部直径是约0.1mm～约50mm；在还有其他的实施方式中，中心针头的内部直径是约0.2mm～约20mm；在仍其它的实施方式中，中心针头的内部直径是约0.3mm～约10mm，且更典型地约0.35mm～约5mm。在一些实施方式中，甚至更窄范围的中心针头的内部直径，例如约0.03mm～约10mm，典型地约0.10mm～约3mm，还要更典型地约0.30mm～约1mm，以及甚至更典型地约0.35mm～约0.50mm。

在一些实施方式中，中心针头的内部直径是约0.38mm～约0.44mm，典型地约0.39mm～约0.43mm，以及更典型地约0.40mm～约0.42mm。

在一些实施方式中，供应成形缓冲溶液的周围的外部的同轴针头的内部直径典型地是中心针头的内部直径的约1.95倍～中心针头的内部直径的约2.15倍，典型地中心针头的内部直径的约2.00倍～中心针头的内部直径的约2.10倍，以及更典型地中心针头的内部直径的约2.05倍。

在实施方式中，成形缓冲溶液可以是任何帮助胶原纤维成形的溶液。成形缓冲溶液典型地是包含与盐和缓冲剂一起的TES溶液，TES亦称为2-[(2-羟基-1,1-二(羟甲基)乙基)胺基]乙磺酸或N-[三(羟甲基)甲基]-2-胺基乙磺酸。

在本公开内容的一些实施方式中，成形缓冲液是WSB，即包含30mM的TES、4.14mg/mL的二水合磷酸二氢钠、12.1mg/mL的七水合磷酸氢二钠、135mM的NaCl以及10％w/v的PEG(聚乙二醇)的溶液。相似的溶液也可以适用。

调节胶原溶液的和成形缓冲溶液的流速使得在挤出的针头和包含纤丝成形浴的反应区内的成形缓冲溶液的外层覆盖物保持完好无损。还将成形缓冲溶液的速度建立为高于胶原溶液的速度以对胶原纤维提供伸展以改进纤维的品质。确实，这种方式会促使纤维形成不含结和其它异常物理性状的相对直、连续的纤维。在一些实施方式中，纤维可以是基本上圆形的、卵形的、正方形的、矩形的、带状的、三角形的或不规则形状的。

在本公开内容的实施方式中，成形缓冲溶液在包含纤维成形浴的针头反应区中的速度高于胶原溶液的速度。将成形缓冲溶液用以中和胶原溶液并协助原纤维生成(fibrillogenesis)。进一步地，使用成形缓冲溶液的更高的速度来拉拽或伸展胶原物流，其产生了拉伸场(extensional field)，拉伸场在称为流动诱导的结晶的过程中帮助排列胶原单体。这样的排列帮助胶原聚合并且增加所得产物的强度。

在一些实施方式中，成形缓冲溶液在针头中的体积流速是胶原溶液在针头中的体积流速的约5倍～胶原溶液在针头中的体积流速的约10倍，典型地胶原溶液在针头中的体积流速的约7倍～胶原溶液在针头中的体积流速的约9倍，以及更典型地胶原溶液在针头中的体积流速的约7.5倍～胶原溶液在针头中的体积流速的约8.5倍。特别的，胶原溶液在针头中的体积流速的8倍是有效的。

在实施方式中，胶原物流702和成形缓冲溶液的外层覆盖物707进入反应系统700的包含纤丝成形浴的反应区701，如在图7中所说明的。反应区可以具有形成反应区701的结构，例如成形管。然而，典型地，不必需存在结构。随着物流流动通过包含纤丝成形浴的反应区701，胶原纤维继续聚合以形成胶原纤维的产物。胶原纤维752和成形缓冲溶液702流出包含纤丝成形浴的反应区701。

在实施方式中，调节胶原的速度以为胶原提供约15秒～约60秒、典型地约20秒～约50秒、且更典型地约25秒～约40秒的反应或聚合时间。

如在图8中所示，在实施方式中，在聚合期间结束时，随着物流流出包含纤丝成形浴的反应区701，胶原纤维852已经成形并与成形缓冲溶液808分离。过量的成形缓冲溶液流至盆801中。设计脱水系统800使得在盆801中捕获成形缓冲溶液808并将胶原纤维852引至脱水浴802。

脱水溶液(dehydration solution)给予了将水从胶原纤维去除、降低纤维直径和帮助原纤维生成的机会。在实施方式中，脱水溶液包含如下溶液：在MilliQ水中的约10％乙醇～在MilliQ水中的约35％乙醇、典型地在MilliQ水中的约15％乙醇～在MilliQ水中的约30％乙醇以及更典型地在MilliQ水中的约15％乙醇～在MilliQ水中的约25％乙醇。本领域技术人员认识到MilliQ水，亦写作Milli-Q水，是在可以从Millipore Sigma,Burlington,MA USA得到的装备中生产的高度纯化的水。

使胶原纤维852通过脱水浴802约10秒～约50秒、典型地约15秒～约45秒以及更典型地约20秒～约40秒。贯穿整个期间，胶原纤维保持浸没在脱水浴802中。脱水浴802的体积是每分钟所泵入的成形缓冲溶液的体积的约400倍～每分钟所泵入的成形缓冲溶液的体积的约800倍、典型地每分钟所泵入的成形缓冲溶液的体积的约450倍～每分钟所泵入的成形缓冲溶液的体积的约750倍，以及更典型地每分钟所泵入的成形缓冲溶液的体积的约500倍～每分钟所泵入的成形缓冲溶液的体积601的约700倍。

图9说明了脱水浴的末端部分，从其中使经脱水的胶原纤维从脱水浴中去除。如在图9中的实施方式中所见，在环920上的钩910处使经脱水的胶原纤维930从脱水浴802去除。如可看见的，通过环920使钩910保持在脱水浴802中。钩910倾向于帮助将脱水浴从经脱水的胶原纤维去除。通过线轴1001的转动以箭头940的方向将经脱水的胶原纤维930向上拉拽，如图10上所示。因为线轴1001(图10)的收集速度高于胶原纤维930的挤出流速，钩920或相似装置适合用来(is appropriate to)确保胶原纤维保持浸没在脱水浴802中。随着将经脱水的胶原纤维930提出脱水浴的水平，可以看到流体液滴905从经脱水的胶原纤维930滴落。

图10说明了将经脱水的纤维收集到线轴1001上。在实施方式中，通过电机1011以顺时针方向转动线轴1001，如箭头1016所示。以提供约1.5～约3、典型地约1.75～约2.5、以及更典型地约1.90～2.20的牵伸比的速度转动线轴1001。相似地，以相同的速度转动线轴1002。牵伸比是卷绕速度和挤出速度之间的比。因此，在第一胶原纤维1050上存在在钩910处将纤维向上拉拽的张力。随后将纤维拉拽超过脱水用的浴802的壁(wall)并拉拽至线轴1001上。

或者，在本公开内容的一些实施方式中，将胶原直接引至纤丝成形浴中，无需图6的同轴针头用以形成在图7中说明的同轴流动。相反，随着从针头将胶原溶液852直接注射到纤维成形浴870中而使胶原纤维成形，其后按照用(as with)本公开内容的替代实施方式的同轴成形的方法继续加工。以与选择用于同轴注射方法的针头尺寸相同的方法选择用于胶原注射的针头尺寸，并以与其它实施方式相同的方式将纤维牵伸通过纤丝成形浴和随后至脱水浴中。然而，以产生如下牵伸速度的速度转动图10中的线轴1001：纤维成形速率的约2倍～纤维成形速率的约4倍、典型地纤维成形速率的约2.5倍～纤维成形速率的约3.5倍、以及更典型地纤维成形速率的约2.75倍～3.25倍。随后，以与用于其它实施方式相同的方式进行后加工。

对于一些实施方式箭头1020表明了时间的流逝，在此期间已将线轴1001相对于在脱水浴802的末端的位置移动以为了在线轴上形成单层纤维。因此，线轴的转动以相同的速度继续并且随着线轴移动，纤维1052保持在张力中(kept in tension)直到线轴1002基本上是满的。时间箭头1030说明了直到纤维的供应耗尽的时间的流逝。随后可以将线轴1055收取。可以调节移动速度以调节在线轴上的纤维之间的间隔(separation)。

为了确保随着线轴转动张紧维持在纤维上，纤维典型地在整体上在线轴的表面上接触，用于一些实施方式中的这样的线轴1110如图11所示。然而，线轴不需要如线轴1110那样具有连续的表面。在其它实施方式中，多个棒可以沿着线轴的长度延伸。一种这样由棒形成的线轴是在图11中的线轴1120，其包含第一棒1125，第二棒1126，以及第三棒1127。棒提供了足够的表面以将胶原缠绕于其上。

也可以将本公开内容的纤维以化学方式后加工。图12说明了潜在的后加工步骤。在实施方式中，在1220将含有胶原纤维的线轴1210空气干燥至少约15分钟、典型地至少约20分钟、以及更典型地至少约30分钟。随后将含有经空气干燥的纤维的管1210放置于用于交联的容器中。典型地，在本公开内容的实施方式中的容器将交联用的容器的体积最小化以降低所需交联剂的量。因此，如图12中所说明的，滚筒1230含有为了覆盖圆筒状线轴1210所需的交联用的流体的量，如在1231所示。在实施方式中，每米纤维的交联用的溶液的体积是至少约3μL、典型地至少约4.5μL、以及更典型地至少约6μL。

本公开内容的纤维可以被官能化以提供胺基，或像胶原那样，可含有可与醛交联的胺基。典型地，小链醛，以及更典型地乙二醛(GLY)或，其它常规的交联用的试剂。例如，可以使用的交联剂例如为盐酸1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、京尼平、甘油醛、戊二醛、o-葡聚糖以及低M原花青素和高M原花青素。或者，若纤维是用羧基官能化的，则可使用EDC和其它碳二亚胺交联。异氰酸酯与OH基团和胺基均反应。因此，基于异氰酸酯的交联剂可以用于在例如经官能化的PDLLA内将OH基团彼此交联(将一个OH基团连接至另一个OH基团)以改进介质稳定性和强度。异氰酸酯也可以用于通过来自胶原的NH₂基(即氨基)将胶原连接至官能化的PDLLA中的OH基团。此外，可以使用光交联剂。

以下的反应序列是在本公开内容的实施方式中可用的示例性交联反应。在每个示例性的反应中，P＝聚合物，其为在这些反应中的纤维：

A)

B)

C)

特别地，在本公开内容的实施方式中乙二醛提供了合适的交联。在本公开内容的实施方式中，使用在70％乙醇和30％MilliQ水的溶液中的10 mM乙二醛溶液交联。可以改变这些组分的浓度或比例以提供所需的交联度和官能度。

在本公开内容的一些实施方式中，在外层覆盖物中的0.25 mM的EDC溶液可以用作交联用的溶液。

如在图12中所示，在一些实施方式中，如通过箭头1235所示意性说明的那样使管和线轴1231滚动。例如，辊可以将管和线轴以约1RPM滚动。滚动持续足以获得所需交联度的时间。在一些实施方式中，至少约24小时是足以获得所需交联度的。增加交联时间增加了纤维内的结合(键)的强度并且改进了所得产物的稳定性。因此，在一些实施方式中，允许使材料交联至少约48小时、典型地至少约72小时。已经发现长达约1个月的交联时间甚至更多地增加了交联强度。可以以确保整个卷材被浸没在交联用的流体中的任意方式移动容器。

在一些实施方式中，随后含有经交联的胶原纤维的线轴1211被从管中去除并任选地放置在MilliQ水冲洗中约10分钟，如在冲洗池1240和箭头1221所示。随后在包含100mM甘氨酸的浴1250中将经冲洗的线轴与纤维1212放置足以使过量的乙二醛失活的时间。典型地，10分钟是足够的。去除乙二醛帮助降低纤维的细胞毒性。可以以相似方式去除其它交联剂，若须要或恰当的话。

在跳过冲洗步骤的实施方式中，将线轴和纤维1213放置在甘氨酸浴1250的甘氨酸中。像具有冲洗步骤的实施方式中那样加工至干燥纤维。

在池1260处，在MilliQ水中将来自甘氨酸浴的含有胶原纤维的线轴1214再次冲洗。在实施方式中，10分钟足以去除甘氨酸。随后线轴和纤维1215在1270处进行空气干燥约1小时，之后放置在干贮室(desiccating chamber)1280中约24小时。随后收取图12的干燥、柔韧的纤维1217。

本公开内容的实施方式涉及在图13中的用于生产生物聚合物纤维的方法1300。在实施方式中，在酸溶液中将胶原溶解1305以形成胶原溶液1310。在一些实施方式中，将相容的生物聚合物与胶原包括在一起。随后，胶原溶液可被脱气1315，然后离心1320以获得胶原溶液。

随后将胶原溶液与作为外层覆盖物的成形缓冲溶液共挤出1325。使胶原溶液以第一速度通过具有第一直径的第一针头，与此同时使成形缓冲液以第二速度通过第二针头，第二针头同轴地围绕第一针头且具有大于第一直径的第二直径，以在胶原溶液周围形成外层覆盖物以形成同轴流动。基础缓冲液通过第二针头的第二速度是胶原溶液通过第一针头的第一速度的至少两倍。

在一些实施方式中，中心针头的内部直径是约0.05mm～约100mm；在一些实施方式中，中心针头的内部直径是约0.1mm～约50mm；在还有其他的实施方式中，中心针头的内部直径是约0.2mm～约20mm；在仍其它的实施方式中，中心针头的内部直径是约0.3mm～约10mm，且更典型地约0.35mm～约5mm。在一些实施方式中，中心针头的内部直径的范围甚至更窄，例如约0.03mm～约10mm，典型地约0.10mm～约3mm，还要更典型地约0.30mm～约1mm，以及甚至更典型地约0.35mm～约0.50mm。

在一些实施方式中，中心针头的内部直径是约0.38mm～约0.44mm，典型地约0.39mm～约0.43mm，以及更典型地约0.40mm～约0.42mm。

在一些实施方式中，供应成形缓冲溶液的周围的外部的同轴针头的内部直径典型地是中心针头的内部直径的约1.95倍～中心针头的内部直径的约2.15倍，典型地中心针头的内部直径的约2.00倍～中心针头的内部直径的约2.10倍，以及更典型地中心针头的内部直径的约2.05倍。

在实施方式中，成形缓冲溶液可以是任何有助于使胶原纤维成形的溶液。成形缓冲溶液典型地是包含与盐和缓冲剂一起的TES溶液，TES亦称为2-[(2-羟基-1,1-二(羟甲基)乙基)胺基]乙磺酸或N-[三(羟甲基)甲基]-2-胺基乙磺酸。

在本公开内容的一些实施方式中，成形缓冲溶液是WSB，包含30mM的TES、4.14mg/mL的二水合磷酸二氢钠、12.1mg/mL的七水合磷酸氢二钠、135mM的NaCl以及10％w/v的PEG(聚乙二醇)的溶液。相似的溶液也可以适用。

在一些实施方式中，成形缓冲溶液在针头中的体积流速是胶原溶液在针头中的体积流速的约5倍～胶原溶液在针头中的体积流速的约10倍，典型地胶原溶液在针头中的体积流速的约7倍～胶原溶液在针头中的体积流速的约9倍，以及更典型地胶原溶液在针头中的体积流速的约7.5倍～胶原溶液在针头中的体积流速的约8.5倍。特别的，胶原溶液在针头中的体积流速的8倍是有效的。

在实施方式中，同轴流动的胶原和成形缓冲液以足以形成纤维1330的时间和速度流动通过包含纤丝成形浴的反应区。随后将成形的胶原纤维与成形缓冲溶液分离1335并放至脱水用的溶液中1340。脱水溶液给予了将水从胶原纤维去除、降低纤维直径和帮助原纤维生成的机会。在实施方式中，脱水溶液包含如下溶液：在MilliQ水中的约10％乙醇～在MilliQ水中的约35％乙醇、典型地在MilliQ水中的约15％乙醇～在MilliQ水中的约30％乙醇以及更典型地在MilliQ水中的约15％乙醇～在MilliQ水中的约25％乙醇。

在一些实施方式中，以高于第一速度的足以增加分子排列并且降低纤维直径的第三速度将纤维提取1345至线轴上。该速度典型地是纤维流动通过脱水用的浴的速度的至少约两倍。

在其它实施方式中，跳过步骤1325，并且没有使用同轴外层覆盖物成形。相反，将胶原溶液注射到成形缓冲溶液中，并通过转动收集线轴将胶原溶液推动通过成形缓冲溶液和脱水用的流体以提供这样的速率，所述速率将纤维以注射速度的约2倍～注射速度的约4倍的速度拉拽。随后进行余下的步骤，包括潜在的后加工。

在实施方式中，在步骤1350中的短暂的空气干燥期间之后，在步骤1355中将纤维交联。典型地，在伴随搅拌的乙二醛溶液中以足以实现交联的时间进行交联。在实施方式中，将纤维留在线轴上。典型地，使交联用的容器的体积最小化以降低所需交联剂的量。

交联用的材料可以是任何适合的交联剂。特别地，在本公开内容的实施方式中乙二醛提供了合适的交联。在本公开内容的实施方式中，使用在70％乙醇和30％MilliQ水的溶液中的10mM乙二醛溶液进行交联。可以改变这些组分的浓度或比例以提供所需的交联度和官能度。在实施方式中，每米纤维的交联用的溶液的体积是至少约3μL、典型地至少约4.5μL、以及更典型地至少约6μL。24小时的交联时间通常适合于实现交联的量。然而，典型地，至少约48小时的交联时间提供了增加的交联，并且至少约72小时的时间提供了甚至更多的交联。

随后，含有经交联的胶原纤维的线轴从交联用的容器中被移除，并且在本公开内容的一些实施方式中在MilliQ水冲洗中放置约10分钟。在其它实施方式中，线轴不需要冲洗。随后在包含100mM甘氨酸的浴的浴步骤1360中将线轴和纤维放置一段足以使过量的乙二醛失活的时间。典型地，10分钟是足够的。去除乙二醛可以帮助降低纤维的细胞毒性。

若不使用乙二醛作为交联剂，可以采取其它加工步骤。本领域技术人员将认识到适合于(appropriate for)这些其它交联体系的恰当的加工步骤。

在实施方式中，在步骤1365在MilliQ水中再次冲洗来自甘氨酸浴的含有胶原纤维的线轴。在实施方式中，10分钟足以去除甘氨酸。随后在步骤1270线轴和纤维1214被空气干燥约1小时，之后在干贮室中放置1370约24小时。收取干态的、柔韧的纤维。

在本公开内容的实施方式中，所生产的纤维是包含胶原的生物聚合物纤维。该生物聚合物纤维具有一种或多种以下特性：

约20MPa～约170MPa的极限拉伸强度；

约200MPa～约3,500MPa的弹性模量；

约4％～约12％伸长率的断裂应变；

干燥后约16μm～约70μm的平均纤维直径；以及

在生物流体中浸泡约1小时后至少维持其强度。

纤维展现有序的、纵向取向的结构，并且纤维允许细胞生长的浸润。

在另外的方面，本公开内容涉及用于支持修复软组织损伤、或用于修复或取代人体部位的可植入的生物聚合物支架。支架包含至少一种生物聚合物片材，该生物聚合物片材包含生物聚合物纤维，其中生物聚合物包含胶原并且生物聚合物纤维具有一种或多种以下特性：

约20MPa～约170MPa的极限拉伸强度；

约200MPa～约3,500MPa的弹性模量；

约4％～约12％伸长率的断裂应变；

在磷酸盐缓冲盐溶液中浸泡约1小时后约16μm～约70μm的平均纤维直径；以及

在生物流体中浸泡约24小时后至少维持其强度。

纤维展现有序的、纵向取向的结构，并且允许细胞生长的浸润。所述片材包含为了便于使用期间的操作而以特定方式排列的纤维。例如，由于直径小，单根纤维将极难使用。因此，形成支架或大于单根纤维的结构以提供适用于修复或取代身体部位的含有纤维的产物是必须或恰当的。因此，例如可以将数根纤维编织在一起以形成包含胶原纤维的股料。这样的股料可以用于例如将在韧带或腱中的断裂对缝。这些以及其它用途对使用者而言将是明显的。

贯穿本公开内容，对10根随机采集的纤维进行性质和特性的测试。用10根纤维和约0.3N～约2N的荷载进行强度测试。

如本文所注意的，胶原纤维的稳定性至少得到了维持，甚至在生物溶液中1小时后也是如此。进一步地，通过将交联期间持续至至少约48小时和甚至进一步至72小时实现了额外的交联，其显著降低了纤维的溶胀并且维持或增加了荷载能力(load capacity)。

以下的实施例是本发明的实施方式的实施例并且并不意图以任何方式限定。

实施例1

将具有完好无损的端肽末端的I型牛胶原从包装中取出，并与0.05M的乙酸结合以生成具有16mg/mL胶原浓度的黏稠的溶液。在将溶液进行数轮脱气之前，允许溶液将胶原溶解16小时。通过在脱气前和脱气后以约750rcf离心5分钟将过量的气泡去除。将胶原抽吸至5mL注射器中，并随后将其附着至同轴针头的中心鲁尔接头(center luer fitting)(0.41mm ID对于胶原的进口，0.84mm ID对于进成形缓冲液的进口)。随后将胶原注射器和同轴针头放置在注射器泵上以60μL/min泵出。

将成形缓冲溶液的pH调节至8.0±0.1，并将其置于被盖上的烧杯中。成形缓冲溶液是WSB，亦称为湿法纺丝缓冲液，包含30mM的TES、4.14mg/mL的二水合磷酸二氢钠、12.1mg/mL的七水合磷酸氢二钠，135mM的NaCl和10％w/v的PEG(聚乙二醇)的溶液。

将管置于烧杯底部，并通过蠕动泵并随后经由鲁尔接头附着至同轴针头外部，进而为胶原形成外层覆盖物的流。成形缓冲液用以中和胶原溶液并且协助原纤维生成。成形缓冲溶液以500μL/min流动。还使用了更快速的成形缓冲液以拉拽或伸展胶原物流，并形成拉伸场，拉伸场在称为流动诱导的结晶的过程中帮助排列胶原单体。这样的排列帮助胶原更容易地聚合并且增加最终产物的强度。

胶原和成形缓冲液的物流进入包含纤丝成形浴的反应区，在其中纤维有时间聚合并形成长链。包含纤丝成形浴的反应区在脱水浴的进口处结束，脱水浴将经使用的成形缓冲液捕集在蓄水池中并且允许纤维通过20％乙醇和80％MilliQ水行进约45cm。此浴帮助从胶原纤维去除水，降低其直径，并辅助原纤维生成。浴为2.5cm宽并且容纳约300mL溶液。

在纤维行进通过浴后，随后将纤维绕至直径50mm长300mm并以约5RPM转动的线轴上，进而产生约2的牵伸比(卷绕速度和挤出速度之间的比值)。该牵伸比帮助进一步增加分子排列并且降低纤维直径，其最终增加了强度。调节线轴的平移速度以改变纤维之间的间隔。

允许线轴被空气干燥至少15分钟，之后放置在用于交联的圆筒状的管中。该管的内部直径接近于线轴的外部直径以降低完全浸没所需的交联剂的量。制备了120mL的在70％乙醇和30％MilliQ水中的10mM乙二醛并将其倒入管中。随后将线轴置于管中。随后将管和线轴放置在处于约1RPM的辊上24小时。

24小时后，将线轴从管中取出并将其在MilliQ浴中放置10分钟。随后将线轴在100mM甘氨酸的浴中放置10分钟以使过量的乙二醛失活以降低细胞毒性，随后在MilliQ水的最终浴中放置10分钟以去除任何剩余的甘氨酸。随后线轴和纤维被空气干燥大约1小时，之后在干贮室中放置24小时。

在干贮后，纤维是干燥且柔韧的，这使其容易地被处理成为对于构建支架有用的形状。所得的纤维具有25μm的平均直径和在PBS中浸泡半小时后具有约100MPa的拉伸强度。PBS，亦称为磷酸缓冲盐，是在生物学研究中常用的缓冲溶液。其是基于水的盐溶液，其含有磷酸氢二钠、氯化钠和在一些配方中氯化钾和磷酸二氢钾。缓冲液帮助维持恒定的pH。溶液的等渗浓度和离子浓度与人体的等渗浓度和离子浓度(即为等渗的)匹配。

在37℃下在DMEM中7天的稳定性测试显示了约25％原始强度的损失，DMEM是合成的细胞培养介质，其包含氨基酸、氯化钙、氯化钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸二氢钠、葡萄糖和维生素叶酸、烟酰胺、核黄素和B12。DMEM还含有用于指示pH的铁和酚红。

此实施例说明了在根据在权利要求范围内的方法的权利要求的范围内的纤维的生产。按照权利要求，纤维将生产用于修复或取代人体部位的支架。

实施例2

将具有完好无损的端肽末端的I型牛胶原从包装中取出，并与10mM盐酸结合以生成具有16mg/mL胶原浓度的黏稠的溶液。允许溶液将胶原溶解16小时，之后以733rcf将其离心5分钟。通过脱气2分钟去除过量的气泡，并随后以733rcf再次离心10分钟。将胶原抽吸至20mL注射器中，并随后将其附着至同轴针头的中心鲁尔接头(center luer fitting)(0.41mm ID对于胶原的进口)。随后将胶原针头放置在注射器泵上以50μL/min泵出。

将成形缓冲溶液的pH调节至8.0±0.1，并将其置于长条形的浴中。成形缓冲溶液是WSB，亦称为湿法纺丝缓冲液，包含30mM的TES、4.14mg/mL的二水合磷酸二氢钠、12.1mg/mL的七水合磷酸氢二钠，135mM的NaCl和10％w/v的PEG(聚乙二醇)的溶液。

成形缓冲液用以中和胶原溶液并且协助原纤维生成。将胶原泵入成形缓冲溶液中并将其引导通过浴。胶原成形缓冲溶液包含反应区，在其中纤维有时间聚合并且形成长链。包含纤丝成形浴的反应区在20％乙醇和80％MilliQ水的脱水浴的进口处结束，将纤维引导通过脱水浴。此浴帮助从胶原纤维去除水，降低其直径，并辅助原纤维生成。浴为2.5cm宽并且容纳约300mL溶液。

在纤维行进通过浴后，随后将纤维绕至直径50mm长300mm并以约10RPM转动的线轴上，进而产生至少约2的牵伸比(卷绕速度和挤出速度之间的比值)。该牵伸比帮助进一步增加分子排列并且降低纤维直径，其最终增加了强度。调节线轴的平移速度以改变纤维之间的间隙。

允许将线轴空气干燥至少15分钟但是不多于1小时，之后将其放置在用于交联的圆筒状的管中。该管的内部直径接近于线轴的外部直径以降低完全浸没所需的交联剂的量。制备了120mL的在70％乙醇和30％MilliQ水中的10mM乙二醛并将其倒入管中。随后将线轴置于管中。随后将管和线轴在处于约1RPM的辊上放置至少24小时并且最高达72小时。

24小时或最高达72小时后，将线轴从管中取出并空气干燥约1小时，之后至干贮室中放置24小时。

在干贮后，纤维是干燥且柔韧的，这使其容易地被处理成为对于构建支架有用的形状。所得的纤维具有30μm的平均湿直径和在PBS中浸泡半小时后具有约120MPa的拉伸强度。PBS，亦称为磷酸缓冲盐，是在生物学研究中常用的缓冲溶液。PBS是基于水的盐溶液，其含有磷酸氢二钠、氯化钠和在一些配方中氯化钾和磷酸二氢钾。缓冲液帮助维持恒定的pH。溶液的等渗浓度和离子浓度与人体的等渗浓度和离子浓度匹配(即为等渗的)。

在37℃下在DMEM中7天的稳定性测试显示了约25％原始强度的损失，DMEM是合成的细胞培养介质，其包含氨基酸、氯化钙、氯化钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸二氢钠、葡萄糖和维生素叶酸、烟酰胺、核黄素和B12。DMEM还含有用于指示pH的铁和酚红。

此实施例说明了在根据在权利要求范围内的方法的权利要求的范围内的纤维的生产。按照权利要求，纤维将生产用于修复或取代人体部位的支架。

额外的公开内容和对比信息

在本公开内容的实施方式中，临床级的去端胶原(atelocollagen，去端肽胶原)和端胶原可以用于形成微流体挤出的胶原微纤维，胶原微纤维随后可以与生物的和良性的交联剂例如乙二醛或DL-甘油醛(DLG)交联。这些经交联的纤维呈现了近300MPa的水化(hydrated)极限拉伸强度和超过3GPa的模量，显著强于50种其它经测试的交联策略并且超过天然的人类跟腱和前交叉韧带的强度。在培养中经过3～6个月，经乙二醛交联的纤维进一步地保持50％的初始承载能力。植入大鼠中的胶原纤维呈现了生物相容性，得到了促进的沿着纤维生长的新生的、宿主生成的排列的胶原的生产，并且在乙二醛交联的情形中呈现了得到了促进的升高的促再生M2巨噬细胞响应。与其它包含常规和合成材料的经交联的纤维相比，本公开内容的实施方式呈现了愈合的显著改进，使得本公开内容的实施方式是用于生成有强度的(strong)胶原缝合线或用作用于韧带、腱或其它软组织修复的装置的优越的纤维。

制造适用于腱和韧带修复的材料的尝试仍未(yet)生产合适的产品。迄今为止，例如作为用于软组织闭合或连接的缝合线、支撑物或移植物的自体移植物、同种异体移植物(allografts)与合成材料已发现具有显著的临床局限性。同种异体移植物例如死亡的、经脱细胞化的(decellularized)和经化学处理的植入物可能融入缓慢、具有炎性并且可能延迟愈合(Seon、Song和Park，2006)。合成的移植物可能崩解成为酸性副产物而破坏周围的组织(Taylor等人，1994；van Sliedreght等人，1994；Matsusue等人，1995)。合成的移植物通常与腱或韧带的机械或材料性质不匹配(Hogan等人，2015)，若将其用于关节间隙中，其可以引起应力升高(stress riser)的产生和衰弱的(debilitating)非等距性的形成。由于需要第二个程序以收取自体组织，自体移植延长了手术时间和相关创伤(例如失血、感染的风险)，引起在过程中的额外创伤(Chen等人，2009；Perrone等人，2017)。用自体移植法或同种异体移植法重建关节进一步导致了过早的骨关节炎的更高发病率和严重性，因此影响生活品质(Leiter等人，2014；Smith等人，2014；Perrone等人，2017)。创伤后骨关节炎的升高的发生率(rising rate)对于军队的老兵已经成为显著的问题(Showery等人，2016)。

在制造用于腱和韧带修复的缝合线和用于可吸收缝合线的理想的生物的、有强度的材料中仍然存在未满足的需求。在改进生物相容性、降低炎症和降低来自有强度的合成材料的磨损性的尝试中，尤其对于矫形指征(orthopedic indication)，具有胶原涂层的合成的不可吸收的缝合线(例如Collagen-Coated )已经是可用的。

从I型胶原挤出的经交联的纤维可以生产有强度的产品。然而，这些产品并不令人满意，并且呈现生物的、强度的和其它缺陷。例如，大多交联剂是细胞毒性的，使用苛刻的外来于(foreign to)身体的化学品，并且也不用在目前记录(currently marked)的美国食品药品监督管理局(FDA)批准或解禁(cleared)的产品中，使得它们的使用对于临床转化(clinical translation)更有挑战性。若经编织的胶原纤维显示出具有高度均匀的拉伸性质、一致的(持续的)均匀的直径、生物相容性和有再生能力的可控吸收，则除了在提高ACL或AT修复中的潜在用途以外，其还具有用作用于普通外科手术、眼科外科手术和整形与美容外科手术的缝合线的潜力。

本公开内容的实施方式涉及用以生产作为纤维丝和作为细的带状结构体的临床I型胶原微纤维的新型微流体挤出系统。本公开内容的实施方式满足了严格的机械、生物化学、细胞相容性和生物相容性的标准，使得本公开内容的纤维实施方式具有特别地用于生物医学用途的性质。鉴于本公开内容的实施方式展现出生产有用的产品所需的从分子尺度至介观尺度并一直到宏观尺度的有序性，本文所公开的这些胶原纤维具有在以下方面中的潜在应用：腱和韧带修复、伤口闭合和其中先进的基于胶原缝合线的生物材料为有益的医学中的遍及外科手术领域的其它指征。

图14示意性地说明了按照本公开内容的实施方式的胶原微纤维制造，和合适的产品的潜在生物医学应用。在步骤1401中在酸中将经冷冻干燥的胶原溶解，其中得到了胶原分子1402。在喷丝嘴1404中将经挤出的微纤维1403捻制以形成经捻制的微纤维1405。微纤维包含经组装的(assembled)分子胶原1406。可以在步骤1407将胶原卷绕。

可以将胶原更合适地用在通过将单根纤维捻制或编织而形成的三维结构中。随后可以将经编织的纤维1411或经捻制的纤维1405用以缝合在患者膝盖1412中的前交叉韧带(ACL)中的撕裂1415。将胶原ACL缝合线1414用以修复撕裂，胶原皮肤缝合线1415可以用以闭合伤口。

可以将任意数量的纤维联合(无论捻制与否)以形成束，并且可以将束组装成更大的束。例如，束可以包含2根纤维～约10,000根纤维，或约4根纤维～约6,000根纤维，典型地约8根纤维～约4,000根纤维，和更典型地约12根纤维～约2,000根纤维。随后可以通过捻制或其他方式将束结合以形成更大的束。经结合的束不必具有相等数量的纤维。

可以通过束中纤维数量描述束。例如，5根纤维的束可以称为五重纤维(penta-fiber)；8根纤维将产生八重纤维(octa-fiber)，以此类推。可以将具有其它数量喷嘴或挤出机(extruder)的系统和装备用以生产这样的束。

图15和图16说明了用于获得胶原纤维的方法和可以在其中进行反应的系统。在本公开内容的实施方式中，在最高达0.05M的酸(最典型地乙酸或盐酸)中通过搅动将最高达2％(w/v)的临床级冻干端胶原(Telo)或去端胶原(Atelo)(Collagen Solutions，CA)或经甲基丙烯酸酯化的胶原(Advanced BioMatrix，CA)溶解过夜。如在系统1500中所示，随后通过喷嘴系统的中心将经酸化的胶原1501泵出。系统可以包括同轴排列的导管或针头1503。在同轴导管1503的外侧部分使中和用的碱性成形磷酸缓冲液泵出通过系统，中和用的碱性成形磷酸缓冲液含有盐(氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和N-三(羟甲基)甲基-2-胺基乙磺酸)和PEG(聚乙二醇)。成形缓冲液以引入胶原速率的约5倍～约20倍、典型地约8倍～约15倍和最典型地约10倍的体积流速流动，其引起蛋白伸展和部分排列，向所得纤维1504赋予了机械强度。随着纤维通过成形管，其变得更为固体状的(solid)，之后纤维进入20％含水乙醇的浴1505。除了将纤维脱水以外，这个浴帮助去除残留的成形缓冲液，因而为所得胶原微纤维贡献改进的强度和稳定性。在脱水1506之后，可以在双棒式装置(two-bardevice)1508上收集微纤维1507。也可以使用其它合适的收集装置。

在一些实施方式中，在进入成形浴之前，可以通过挤出使经酸化的胶原纤维成形。例如，可以通过使用喷丝嘴1404使经酸化的胶原纤维成形。在一些实施方式中，可以使多个注射器的经酸化的胶原同时成形。

图46说明了系统4600，其使用了注射器的阵列以使经酸化的胶原纤维成形。可以认为系统4600是高通量系统。在本公开内容的一些实施方式中，在由对酸和对胶原呈惰性的材料制成的闭合容器中在酸(乙酸或无机酸例如HCl)中将临床级胶原溶解。聚丙烯是一种这样的材料。胶原和酸的体积典型地小于闭合容器体积的约50％以促进(encourage)充分混合。将溶液搅拌过夜，或约16小时～30小时，典型地约15小时～约20小时。随后将溶液离心以使溶液脱气。

随后将经脱气的溶液放置在注射器中。使用的注射器数量等于待同时成形的纤维数量。图46中的系统4600显示了使用来自安装在可转动的盘4601中的8个注射器的出口。通过盘(未显示)将每个注射器的活塞按入注射器的筒(barrel)中，以确保以基本相等的量挤出纤维。将经酸化的胶原按压通过第一喷嘴4602以形成第一纤维4612；通过第二喷嘴4603以形成第二纤维4613；通过第三喷嘴4604以形成第三纤维4614；通过第四喷嘴4605以形成第四纤维4615；通过第五喷嘴4606以形成第五纤维4616；和通过剩余的喷嘴。在一些实施方式中，未使用所有的喷嘴。在本公开内容的实施方式中，可转动的盘4601可以具有更多或更少的穿过其安装的喷嘴。

在引导装置4630处采集纤维并将其进料至成形缓冲液的浴4640中。在挤出后使纤维保持绷紧(taught，taut)。在一些实施方式中，可以以任一方向转动可转动的盘4601以生产经捻制的纤维。在系统4600中，可以通过与玫瑰形槽口4621啮合的驱动盘(drive plate)4620的转动而使可转动的盘4601转动。可以使用任何合适的驱动系统。在一些实施方式中，没有转动可转动的盘4601，因此所得的纤维束是未经捻制的。然而，随着纤维脱水并且直到纤维在收集器上缠绕，通过在纤维束上的张紧器(tensioner)使束保持在张力下。典型地，开槽的滚筒是合适的收集器，特别对于湿态纤维。

图16说明了喷嘴系统1600的细节。泵1502将液体的(液态的)经酸化的胶原1620泵至双轴针头1503的中心针头中。以流动箭头1611的方向将来自1610的缓冲溶液(亦称为外层覆盖溶液)引至双轴针头1503的外部针头中，由此随着聚合过程进行而使胶原微纤维1504成形。通过在拉伸流动中的外层覆盖流体1611使胶原流体集中。针头的详细视图说明了经酸化的液体胶原1620如何以低速度箭头的方向流动，并随后增加速度，如高速度箭头1630和更高速度箭头1640所表明的。相似地，外层覆盖流体以速度箭头1611、箭头1635和箭头1645的方向移动。反应物的流以箭头1650的方向继续，其中阴影表明了缓冲(外层覆盖)流体1670(其含有磷酸盐)如何与胶原溶液相互作用并且从胶原的物流中去除水1680。

一旦将微纤维1507收集至装置1508上，就将微纤维空气干燥半小时并且随后在不同实验条件下将其交联。图17中的表1中包括了在挤出和交联期间使用的化学试剂。

对于经酸化的胶原混合物中的各交联剂，通过将图18中所示的的量以图18中所述的时间溶解来对图18中的表2中所示的组进行原位交联(化学的或酶促的)。从图18中指定的具体参考文献中获得用于一些材料的交联浓度和时间。图18汇总了强度的对比。在优化收集方法后，选择斜体的条件用于表征。随后将来自经原位交联的胶原的微纤维挤出至双棒式装置上并且保持绷紧，如在图15中所示。图18还显示了交联剂可以以如下量存在：约5mM～约500mM，典型地约10mM～约500mM，以及更典型地约25mM～约250mM。

然而更典型地，可以在具有紧密间隔的槽的实心线轴1110(见图11)上收集未经交联的微纤维。将微纤维直接收集至这些槽上同时维持绷紧。收集至线轴上典型地比双棒式装置更有效。如用于双棒式装置那样在70％乙醇水溶液中将未经交联的微纤维的线轴化学交联。如在图12中所示，将含有在交联剂溶液中的微纤维线轴的管放置在辊上并以1rpm转动以确保微纤维均匀交联。

对于挤出后的化学交联，将挤出在双棒式装置1508或开槽的辊1110上的未经交联或经原位交联并且绷紧的胶原微纤维空气干燥半小时，并随后浸没至在70％乙醇溶液中的交联剂的溶液中，并放置在处于低速的振荡器上。乙醇水溶液的介质确保了贯穿交联期间微纤维保持脱水。在交联之后，将微纤储存在干贮器(desiccator)中直至进行进一步测试。

在一些实施方式中，在收集时胶原纤维是湿态的(wet)或潮的(damp)。在这些情形中，若允许纤维接触，尤其在收集期间则纤维倾向于彼此黏着。因此，在一些实施方式中，可以有利地使用双棒或多棒式收集器装置，因为其可以允许在被另外的纤维接触前，纤维被干燥。在一些实施方式中，开槽的辊对于湿态纤维的收集特别有用，因为排除了纤维至纤维(纤维之间)的接触，由于只有1根纤维收集在1个槽中。

在一些实施方式中，可以通过在纤维离开脱水浴之后并且在收集纤维之前在纤维上方吹气(典型地空气)将纤维干燥。将纤维悬于脱水浴和收集器之间，收集器可以是扁平的滚筒、绕线筒(bobbin)或任何其他合适的收集器。由于纤维是干的，不需要保持纤维彼此分开。

在一些实施方式中，可以通过以下方法干燥纤维：在室温下的纤维上方使在室温下的空气通过并且速度包(speedbag)为0.25m/秒～约10m/秒、典型地约1m/秒～约4m/秒和更典型地约2m/秒。干燥用的空气的速度不应过快以至于使纤维断裂、撕裂或破损。以约使纤维干燥所耗费的时间、典型地等于纤维行进约1米所耗费的时间使空气在上方(passedover)通过。可以通过在敞开系统中或在循环系统中的风扇使干燥用的空气移动。在一些实施方式中，收集装置例如为绕线筒或扁平的滚筒。滚筒以成形速度的约1倍～约9倍的牵伸速度转动。在这样的情况中，可以制作基本上无限长的纤维。

用于交联微纤维的脱水热(dehydrothermal)处理(DHT)涉及在在110℃下和真空下将松弛的经挤出的微纤维脱水1、3和5天，存在或不存在在乙二醛中的额外交联，如以上所描述的。

对于紫外辐射(UVR)介导的交联，将经甲基丙烯酸酯化的胶原用于挤出。随后将经挤出的微纤维暴露于发射365nm的UV光源20分钟。随后将这些微纤维放置在干贮器中或用在70％乙醇水溶液中的10mM乙二醛进一步交联。

使用“离散纤维”测试方法生成单根微纤维的机械性质，其中将在盒(cartridge)上的已知量的微纤维和单独的微纤维的横截面积平均化以确定极限拉伸强度(UTS)、模量和破坏应变(strain at failure)(％)，因为单根微纤维太过纤细以致于无法进行一致的操作。尽管双棒式收集的设置1508导致微纤维是圆柱状的，在实心、开槽的线轴上收集的微纤维是细的(薄的)且带状的。带状的胶原纤维的宽度为约10μm～约70μm、典型地约15μm～约60μm和更典型地约20μm～约50μm。带状的胶原纤维的厚度为约4μm～20μm、典型地约5μm～约18μm和最典型地约6μm～17μm。

从分析用的图像(analyzing images)中测量宽度，使用倒置光学显微镜(例如Axio Vert.Al Model，Zeiss，德国)和Image J软件(NIH Shareware，Bethesda，MD)在对3根单独的(分开的，separate)1.5英寸长微纤维上的10个不同的点处获得分析用的图像。使用Image J软件，使用扫描电子显微镜(SEM)的微纤维束的横截面图像确定微纤维的厚度。为了满足严格的机械测试的要求，其与本公开内容的胶原微纤维实施方式在体内的性能将是相关的，可以使用将我们的微纤维样品湿态拉伸测试的高通量方法(例如在文献：Gentleman等人，2003中所公开的)。

浴和样品夹持系统(sample holding system)用于提供在盒中的束的湿态拉伸强度的机械测试。该系统使得可提供30分钟的浸泡，同时在浸泡本公开内容的经挤出的微纤维的实施方式期间每5分钟加工1个样品。浸泡用的液体可以是Gibco’s Dulbecco's磷酸缓冲盐(DBPS)，可以从Thermo Fisher Scientific获得。典型地，将最少4个盒以机械方式湿态测试以得到应力—应变曲线(stress vs strain curves)，所述机械方式湿态测试为在室温下，在MTS Criterion Model 42(Eden Prairie，MN)上以1mm/s的拉拽速率的单轴拉伸测试。进行离散纤维测试以快速生成结果，同时优化加工参数。

浴和样品夹持系统包括为了在流体中覆盖被测试的材料而充分填充的浴。流体可以是Gibco’s Dulbecco's磷酸缓冲盐(DPBS)。在测试期间，通过在拉伸测试装置相对的两端处的夹具(jaw)将样品夹持器(sample holder)保持在流体中。通过彼此远离而移动夹具而进行测试。

本公开内容的湿态实施方式(wet embodimens)的UTS典型地是约1MPa～约800MPa，典型地约75MPa～约400MPa，以及更典型地约90MPa～约350MPa，以及甚至更典型地约100MPa～约325MPa。本公开内容的湿态实施方式的模量是约10MPa～约7,500MPa，典型地约100MPa～约6,000MPa，以及更典型地约1,000～4,000MPa。

本公开内容的干态实施方式(dry embodiments)的UTS典型地是约25MPa～约1,900MPa，典型地约100MPa～约1,800MPa，和更典型地约5,000MPa～约1,700MPa，和甚至更典型地约1,200MPa～约1,700MPa。本公开内容的干态实施方式的模量是约14,000MPa～约20,000MPa，典型地约15,000MPa～约19,000MPa，以及更典型地约15,000MPa～18,500MPa。

比较湿态和干态纤维的某些实施方式的测试显示了以下对比范围：极限拉伸强度，对于湿态纤维约1～约755MPa，与之相对，对于干态纤维约25～约1650MPa；弹性模量，对于湿态纤维约10～7,200MPa，与之相对，对于干态纤维约15,950～约18,600MPa；断裂应变，对于干态纤维约2～约41％，与之相对，对于干态纤维约9～约14％；以及平均纤维直径，对于湿态纤维约14～约82μm，与之相对，对于干态纤维约10～约70μm。

使用SEM成像(imaging)获得未经交联和经交联的经挤出的微纤维的横截面以及纵向微观结构特征。使用具有10kV束强度的Zeiss Evo10显微镜(Zeiss)进行SEM成像。对于横截面，将微纤维束浸泡在DPBS中30分钟、在SEM桩(stub)上干燥1小时、喷镀涂布(sputtercoated)并成像。

对于TEM，使用蒸馏水将来自Telo GLY基团(用乙二醛交联的端胶原)的干态的微纤维重新水化。随后在2％戊二醛(Electron Microscopy Sciences，PA)和4％多聚甲醛(Alfa Aesar，MA)中在室温下将其固定30分钟。随后，使用二甲砷酸盐缓冲液(ElectronMicroscopy Sciences)进行两次洗涤(每次洗涤10分钟)。随后在1％的四氧化锇(ElectronMicroscopy Sciences)中培育30分钟，在二甲砷酸盐缓冲液中洗涤一次和在蒸馏水中洗涤两次(每次10分钟)。通过一系列上升的乙醇浓度(在30％、50％、70％和90％中1次，10分钟，和在100％中两次，每次洗涤10分钟)进行脱水；随后在乙醇和环氧丙烷(ElectronMicroscopy Sciences)混合物的1:1混合物中将微纤维沉浸两次10分钟，随后进行100％环氧丙烷处理10分钟。在1:1的EPON 812:环氧丙烷(Electron Microscopy Sciences)中将样品留置过夜(left overnight)。EPON 812是基于甘油的脂肪族环氧树脂。次日，在4:1的EPON 812:环氧丙烷中将样品沉浸4小时，并转移至100％的EPON812过夜培育。次日，将样品转移至新鲜的EPON 812树脂，其被嵌入弹式舱(bullet capsule)(Electron MicroscopySciences)中并且在60℃下聚合12小时。将模具(molds)切成薄片(thinly sectioned)并使用TEM(Model No.Jeol 1230，Jeol USA，MA)成像。可以使用用于确定这些值的替代方法。

茚三酮检测法可以用于评价在经交联的微纤维中游离(free)氨基的量。为此，将未经交联的以及经交联的微纤维剪成各长度范围为14～16cm。同时，根据制造商的方案在0.05％乙酸中制备各种已知浓度的标准氨基酸(甘氨酸(Sigma-Aldrich))。在茚三酮溶液(Sigma-Aldrich)中将微纤维样品和甘氨酸溶液加热20分钟，随后冷却至室温至少1.5小时。随后，将95％的乙醇加至每个样品和甘氨酸标准样。用紫外—可见分光光度计(SpectraMax i3，Molecular Devices，ODU，Norfolk，VA)记录这些样品的吸光度。可以使用其他测试方法。

使用各种已知的甘氨酸浓度的吸光度以获得标准曲线。在未经交联的样品(M_UX)和经交联的(M_X)微纤维中的游离的氨基的量与溶液的吸光度成正比并且从生成的甘氨酸标准曲线中得到。为了计算交联度，使用了如以下的方程1：

差示扫描量热法(DSC)和傅里叶变换红外(FTIR)光谱法用以确定I型胶原的特征酰胺键是否存在。使用差示扫描量热仪(DSC2500，TA Instruments，DE)进行微纤维的测试，并且在Platinum ATR(Brucker，Billercia，MA)上进行FTIR光谱。FTIR光谱用以确认位于1235cm^-1、1560cm^-1和1650cm^-1波长的I型胶原的特征酰胺键的三主峰的存在。通过用Essential FTIR生物信息学软件(Operant，Madison，WI)评估峰位移来比较未经交联的和经交联的微纤维与起始材料。

将作为单根纤维的、150根微纤维的束(通过经涂覆的Vicryl 4-0(Ethicon，NJ)缝合线结合在一起并裁剪至10mm的最终尺寸)的、或在用于如以上所描述的机械测试的盒上的经挤出的微流体纤维与STERRAD化学指示剂(4MD Medical Solutions，Lakewood，NJ)密封在Tyvek袋内，并送交使用20KGy+/-2KGy靶区剂量的E-束灭菌(Steri-Tek，Fremont，CA)。

将经灭菌的经乙二醛和DL-甘油醛交联的微纤维在腱细胞生长介质中水化30分钟并放置在用聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)(pHEMA)(Sigma-Aldrich)预涂布的24孔板中。在经灭菌的微纤维上一式三份(in triplicates)接种(seeded)两万五千个人类腱细胞(ZenBio，NC)(在100μl腱细胞生长介质中)。在接种后，允许细胞附着1小时，之后添加额外的500μl腱细胞生长介质。12天后，遵循制造商的方案用活细胞染色剂CellTracker^TM GreenCMFDA(5-氯甲基荧光素二乙酸酯)(Thermo Fisher Scientific)将附着腱细胞的微纤维染色。随后使用4％的多聚甲醛将样品固定，并且随后用核染剂DAPI(Thermo FisherScientific)染色以使用共聚焦显微镜(Zeiss Axio Observer Zl，Zeiss)可视化在微纤维上附着的腱细胞。

遵循制造商的方案，使用CyQuant乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒(Invitrogen)和MTT检测试剂盒(Sigma-Aldrich)评估经挤出的微纤维的实施方式对人类腱细胞的细胞毒性(或细胞活性)。简要地，在为检测确定最佳的接种密度之后，将7×10³个腱细胞覆盖(plate)在48孔板的每一个孔上，并且允许其在维持在37℃和5％CO₂下的经加湿的培育器中的腱细胞生长介质中生长24小时。在细胞培养介质中将经灭菌的微纤维束冲洗10分钟并且将其放置在每个孔中的腱细胞上。将在塑料上生长的腱细胞(仅细胞)用作阳性(用于细胞存活率或活性)。将二丁基二硫代氨基甲酸锌(ZDBC)膜和10mM乙二醛化学品用作阴性对照物(用于细胞存活率或活性)。在本实验中也评估了Ethicon Vicryl缝合线的效果，因其用于将经挤出的微纤维的束保持在一起。如在制造商的方案中描述的，设置接种了腱细胞但是不含有样品的孔以评价最大和自发的LDH释放。将样品培育7天，之后评价LDH在介质中的释放。遵循制造商的方案计算使用LDH检测法的％细胞毒性。随后按照100-％细胞毒性来计算％细胞存活率。在本公开内容的实施方式中，％细胞幸存率是至少约94％，典型地至少约95％，更典型地至少约96％，以及最典型地至少约97％。还能实现98％或99％的细胞幸存率。遵循制造商的方案计算使用MTT检测法的％细胞活性。在本公开内容的实施方式中，％细胞活性是至少约70％，典型地至少约80％，更典型地至少约85％，以及最典型地至少约90％。其它合适的测试方法是可用的。

还按照制造商的方案使用AlamarBlue^TM检测法(Bio-Rad，Hercules，CA)评估了与本公开内容的经挤出的微纤维的实施方式一起生长的活的腱细胞的健康和活性。

将经交联的微纤维束的实施方式以皮下方式植入到大鼠中。根据InstitutionalAnimal Care and Use Committee(IACUC，Old Dominion University，Norfolk，VA)批准的方案进行所有外科手术程序。根据ISO 10993-6，将n＝3的经交联的胶原微纤维束(如以上所描述地制备并且灭菌)或经胶原涂布的(缝合线对照物)以皮下方式植入雌性Sprague Dawley大鼠中。用异氟醚吸入法将大鼠麻醉。将肋部(flank)剃毛，并施加Nair脱毛膏以从外科手术位置去除毛发。在肋部区域中以背侧方式(dorsally)制造切口，并且使用止血器以产生用于植入物的袋。一旦将支架放置在袋中，就使用缝合线闭合切口。在4星期后，以人道方式使大鼠安乐死用以收集组织。

在4％多聚甲醛(Alfa Aesar)中将在4星期时收获的微纤维取出物(explants，外植体)固定24小时，随后将其转移至DPBS(Thermo Fisher Scientific)。将样品切片以获得5μm的厚度并用在IDEXX(West Sacramento)的苏木精&伊红(H&E)以及Masson’s Trichrom将系列切片染色。使用偏振光显微镜将在围绕植入物的组织中的胶原组织(organization)成像。

还使用由抗体制造商提供的标准方案在系列的切片上进行免疫标记，以检测在围绕我们的植入物的天然组织中CCR7(M1)和CD163(M2)巨噬细胞表现型的存在。简要地，在脱石蜡化、抗原修复(antigen retrieval)(在10mM柠檬酸盐缓冲液pH 6中煮沸20分钟)、用2.5％马血清渗透(permeabilization)并且封闭(blocking)之后，将片(slides)对CD163(M2巨噬细胞表现型)或CCR7(M1巨噬细胞表现型)染色。将M2巨噬细胞的标记物(小鼠抗大鼠(mouse anti-rat)CD163(#MCA342GA，BioRad，CA))稀释至1:30，用于在经加湿的室(chamber)中培育过夜。培育之后，在PBS中将片洗涤并在室温下于黑暗中用以1:50稀释的羊抗小鼠(goat anti-mouse)二级抗体(secondary antibody)(#A-11005,Thermo FisherScientific)培育1小时。在PBS中以1:50稀释CCR7(M1巨噬细胞标记物)，用于过夜培育(#MA5-31992,Thermo Fisher Scientific)。次日，在PBS洗涤步骤(3次)之后，在室温下于黑暗中以1:200的浓度将羊抗兔(goat anti-rabbit)荧光抗体(#A32740,Thermo FisherScientific)施加至片1小时。对于一级对照物(primary controls)，用小鼠IgG(1:30)(Thermo Fisher Scientific)和羊抗小鼠二级抗体(1:50)、或者兔IgG(1:200)(ThermoFisher Scientific)和羊抗兔二级抗体(1:200)将经血清封闭的片染色。对于二级对照物，仅用二级荧光抗体将经血清封闭的片染色。在封闭用血清中将所有抗体稀释。用DAPI将所有的片对细胞核染色5分钟，在PBS中洗涤并使用VectaMount(Vector Labs，CA)装载(mount)用于可视化和分析。

使用倒置光学显微镜(Axio Vert.Al Model，Zeiss)对经免疫标记的片进行检查和成像。在相同的曝光条件下得到了测试和对照的片(数据未显示)的荧光图像。评价了测试样品的图像。进行定量分析以得到表达仅M1、仅M2、M1和M2和/或无M1/M2表现型的细胞数量。这里使用高功率显微镜场(40x放大倍率)分析了各图像(每个测试样品分析3张图像)的4～5个区域，所述图像在植入物和天然组织界面处的约20～30μm(2～3个细胞层)。通过对经DAPI染色的细胞核计数确定细胞的总数。还为对于每一种标记物阳性标记(labeledpositively)的细胞数量进行了计数。作为在那个区域中的细胞总数的百分比来确定用特异性的标记物标记的细胞的比例。

本公开内容的实施方式还接受了长期稳定性的测试。在张力下将Telo GLY微纤维从线轴上解卷至盒上。将6个经灭菌的盒水化并且如以上描述地进行机械测试，以得到微纤维的机械性质，之后在维持在37℃和5％CO₂的培育器中在培养皿中培育剩余的经灭菌的盒，所述培养皿含有补充有用于抑制细菌和真菌污染的的1％的Antibiotic-Antimycotic(ABAM)(Thermo Fisher Scientific)的Eagle’s Minimum Essential Medium(EMEM)(ATCC，VA)。贯穿实验持续期间，确保盒始终浸没在无菌的无污染的介质中并因此保持水化。在1星期、1个月、3个月和6个月时取出6个经浸泡的盒。同时(如以上所描述)测量微纤维直径以确定微纤维随着时间的溶胀程度。

使用未配对的双尾t检验以评估在任意两组之间性质或特性的任何显著差异。还使用双向ANOVA后接后此(post-hoc)Tukey’s Multiple Comparison Test以评估图17中的表1中的不同交联剂组的UTS的差异。还进行了普通的单向ANOVA后接Dunnett’s多重比较测试以评估健康和活性差异，如在以下的额外细节中描述的。先验地(a priori)，将p值<0.05定义为显著的。使用GraphPad Prism 7进行所有测试，并且所有的参数表达为平均值±平均值的标准误差(S.E.M.)。

额外的实施例

通过实施所公开的产物和方法的实施方式得到实施例。设计并且使用了图15和图16的坚固的微流体挤出设置来一致地生成胶原微纤维用于随后的测试。该方法产生不含交联缺陷的连续微纤维的生产。

为了使胶原微纤维强化和稳定化，筛选了宽范围的常规、新型和组合的交联条件。使用以上描述的测试方法，图18中的表2显示了交联剂和与未经交联的微纤维对比的50种经交联的微纤维的平均UTS的汇总。该数据显示不同的交联剂/交联方案(原位或挤出后交联、交联剂浓度的范围和交联时间)不同程度地影响了微纤维的UTS。在图18中的表2中，将在所有用该交联剂测试的条件中具有显著高的平均UTS的交联条件打上星标(p<0.01)。

如在图18中所示，具有挤出后化学品(chemicals post extrusion)的交联程序(例如乙二醛(10mM以及挤出后72小时，121.2±7MPa)和DL-甘油醛(25mM以及挤出后72小时，128±12MPa))产生了UTS为未经交联的微纤维(6.1±1MPa)近20倍高的微纤维。特别地，对使用本挤出设置的微流体微纤维使用EDC和EDC/NHS交联产生了显著低于以上所描述的乙二醛和DL-甘油醛组的UTS值(分别地16.6±2MPa和30.2±1MPa)。与未经交联的微纤维相比，使用化学交联剂例如胆碱酒石酸氢盐(1mM或100mM)、EGCG(200μM和1mM)和D-山梨醇(200mM)的原位交联导致UTS的显著降低(p<0.01)。物理交联技术例如挤出后DHT(3天，16.2±1MPa)也生产了比未经交联的微纤维更强、但是比使用以上描述的乙二醛和DL-甘油醛的化学交联组更弱的微纤维。挤出后经甲基丙烯酸酯化的胶原微纤维的UVR处理(1.9±0.2MPa)也产生了比未经交联的胶原微纤维显著更弱(p<0.01)的纤维。

由于使用乙二醛交联经挤出的微纤维处于最高的UTS，用10mM乙二醛在不同的时间点(time points)对原位(L-赖氨酸或D-山梨醇)或经交联的纤维(DHT和UVR)的其中一些进行进一步交联。用乙二醛进行额外交联增加了所有这些组的UTS，其中对于L-赖氨酸(10mM,2小时)/乙二醛(10mM,24小时)(96.9±5MPa)和UVR(0.3小时)/乙二醛(10mM,24小时)(86.6±10MPa)的组观察到了最显著的增加(p<0.01)。

现在转向图19、图20和图21，将来自图18中表2中的测试的交联剂组的代表性微纤维的机械性质与报道的人类ACL(Noyes和Grood，1976；Peters等人，2018)、跟腱(Wren等人，2001)和真皮(Gallagher等人，2012)的值对比。图19在图表1900中说明了UTS(MPa)。图20中的图表2000汇总了模量I(MPa)，图21中的图表2100涉及断裂应变(％)。ACL值显示为线1930、线2030和线2130。AT值显示为线1910、线2010和线2110，真皮值显示为线1920、2020和2110。每个结果涉及单根微纤维。在图19中说明的结果揭示了对于一些交联组(特别地，存在或不存在原位10mM L-赖氨酸的10mM乙二醛，和25mM DL-甘油醛)胶原微纤维的平均UTS等于或高于报道的人类ACL、AT和真皮的UTS。

这些图表揭示了可以通过改变交联条件(scenario)调整如以上描述的经挤出的微纤微的机械性质，以匹配和/或超过人类前交叉韧带(ACL)、人类跟腱(AT)和人类真皮的那些机械性质。从至少4组相同(identical)的重复组获得数据，并且误差棒(error bar)表明S.E.M.。

实施例3～6；

对比实施例1、2和3

图19、图20和图21以及来自图18中表2中所示的初始筛选的以斜体显示的四种交联条件包括了突出考虑的因素，例如机械性能、加工时间和/或成本，用于进一步的评价。本文举例说明了以下纤维：

实施例3是用10mM的乙二醛交联72小时的端胶原(Telo GLY)。实施例4是用25mM的DL-甘油醛交联24小时的端胶原(Telo DLG)。实施例5是用10mM的乙二醛交联24小时的去端胶原(Atelo GLY)。实施例6是用25mM的DL-甘油醛交联72小时的去端胶原(Atelo DLG)。对比实施例1是用0.25mM的EDC交联24小时的端胶原(Telo EDC)。这些组与未经交联的微纤维(对比实施例2)和干态的Telo GLY纤维(对比实施例3)进行比较。将Telo EDC组(对比实施例1)用于对比，因其为本领域中常用的良性交联剂(Cornwell等人，2007；Enea等人，2011；Ahmad等人，2015)。此外，与双棒式装置1508相对比，使用开槽实心线轴1110上的高牵伸收集(与原材料进料相比的高收集速度)产生在图22中所示的细的、带状的微纤维以进一步优化材料的性质。

图22显示了实施例3 Telo GLY微纤维的图像，其描绘了超微结构的特征。框图A是单根干态的经挤出的经交联的微纤维的光学显微镜图像。框图B和框图C是在不同放大倍率下干态的单根微纤维的SEM图像。框图D显示了在PBS中浸泡30分钟的成束(bundled)微纤维的横截面。框图D揭示了结构细节和以下的证据：使用在图15和图16中所示的且本文公开的新型微流体设置的实施方式、随后的交联策略、如箭头2206所示的制造出的一致、均匀且薄的带状的微纤维。在框图B中的箭头2201和箭头2202表明了沿着干态微纤维的纵向轴的裂隙和脊状物。框图C中的箭头2204和箭头2205显示了湿态微纤维的纤维状的亚纤维结构。框图E、框图F和框图G代表了经挤出的微纤维的纵向TEM图像。

交联化学(crosslinking chemistry)的优化和收集方法的改变引起机械性质的显著差异，如在图23、图24、图25、图26、图27和图28中所汇总的。在以上描述的浴和样品夹持系统中进行拉伸测试。使用经DPBS浸泡的带状胶原微纤维的宽度和厚度(图23和图24，其从代表性的图像中例如在图22、框图A、框图B、框图C中为实施例3所示的那些测量得出)来计算改进的UTS，在图25中的图表2500，和图26中的图表2600上的模量。相似地测试了实施例3、实施例4、实施例5和实施例6，对比实施例1、对比实施例2和对比实施例3也是如此。

如指示符号(indicator)2402所表明的，当与湿态的未经交联的(34.1±2μm)带状胶原微纤维对比，湿态的Atelo GLY(39.2±1μm)和Telo EDC(46.4±2μm)带状胶原微纤维显示了显著更高的宽度(p<0.05)。如在图23中的指示符号2301和在图23中的指示符号2303所表明的，湿态的Atelo GLY带状胶原微纤维也比未经交联的带状胶原微纤维(9.2±0.5μm)显著更厚(11.9±0.5μm)(p<0.01)。一旦在DPBS中浸泡，带状胶原微纤维Telo GLY(11.1±0.5μm)、Telo DLG(8.6±0.2μm)和Atelo DLG(10.9±0.4μm)的厚度和带状胶原微纤维Telo GLY(36.1±0.7μm)、Telo DLG(35.4±0.8μm)和Atelo DLG(31.1±1μm)的宽度与未经交联的带状胶原微纤维的厚度与宽度相似。对于未经交联的带状胶原纤维，观察到了在图25的图表2500中所示的UTS的最显著的变化；平均UTS(以指示符号2504标识)和模量(在图26的图表2600中以指示符号2604标识)从6.1±1MPa和119.8±23MPa增加至35.8±3MPa和701±53MPa。来自例如Telo GLY(121±7MPa的UTS和1103±63MPa的模量分别至299±15MPa和3431±86MPa)和Atelo DLG(128MPa的UTS和1734±79MPa的模量分别至231±18MPa和3408±185MPa)的组的带状胶原微纤维呈现了平均UTS(如在图27中的图表2700中所示)和模量(如在图28中的图表2800中所示)的至少2倍的增加。对于所有经测试的组，不存在破坏应变(％)的改变。

所有来自开槽的实心线轴的经挤出的带状胶原微纤维的拉伸性质的显著增加。相比其它交联剂的组，未经交联的带状胶原微纤维的组呈现了平均UTS和模量的最高倍数变化。对于实施例3～实施例6和对比实施例1～对比实施例3的每一个，对比在图19、图20和图21中报道的数据，图27中的图表2700呈现了UTS的显著倍数变化，并且对比图19、图20和图21中报道的数据，图28中的图表2800呈现了模量的显著倍数变化。

使用未配对的双尾t检验以评估在图23、图24、图25、图26、图27、图28、图29、图30、图31、图32、图33、图37、图38和图39中的任意两组之间的任何显著差异。使用双向ANOVA后接后此(post-hoc)Tukey’s Multiple Comparison Test和未配对的双尾t检验以评估图17中的表1中的不同交联剂组的UTS差异。进行普通的单向ANOVA后接Dunnett’s多重比较测试以评估在图31、图32和图33中的差异，其在下文更详细描述。先验地，将p值<0.05定义为显著。使用GraphPad Prism 7进行所有测试，并且所有的参数表达为平均值±平均值的标准误差(S.E.M.)。

结果显示为平均值±S.E.M.，并且代表来自两个或更多个独立实验的3组重复。对于指示符号2301，p<0.05。对于指示符号2402和指示符号2502，p<0.01。对于指示符号2303，p<0.005。对于指示符号2504和指示符号2604，p<0.0001。

对于本公开内容的实施方式，使用光学显微镜、SEM和TEM成像法确定了微纤维的超微结构(ultra-structure)。可以使用其它类型的成像法。在实施例3中，表征了经乙二醛交联的端胶原微纤维。在图22的框图A中所示的光学显微镜图像和在图22的框图B中所示的SEM图像确认了干态微纤维沿着纵向轴的均一的宽度。图22(框图B)和纵向截面的高放大倍率SEM图像(图22的框图C)揭示了在干态微纤维内的脊状物和裂隙的平行排列，如图22框图D所示。图22的框图D使用SEM突出了经DPBS浸泡的经挤出的经交联的微纤维束的横截面特征。这些图像揭示了具有明显的纤维状的亚纤维结构的外部光滑表面的超微结构的特征，如在箭头2206处所示。这证明了经挤出的经交联的微纤维是一致的、薄的和带状的。从TEM图像(图22的框图E、框图F和框图G)揭示了以下的进一步证据：在我们的经交联的微纤维中汇集了在天然结缔组织中的从分子尺度至纳米尺度的胶原排列。

为了以生物化学方式评估经交联的微纤维的实施方式的交联度、生物化学和生物物理学特性，使用茚三酮检测法。在图29中的图表2901中阐述了结果。与实施例5Atelo GLY(68±4％)和实施例4Telo DLG(59±6％)相比，实施例3Telo GLY(86±1％)和实施例6Atelo DLG(82±3％)微纤维呈现了显著更高的交联度，突出了更长的交联时间改进了交联效率。

还评估了经挤出的胶原微纤维的蛋白质一级和二级结构。经酸化的起始材料的SDS-PAGE分析确认了胶原的一级α、β和γ链的存在。然而，由于微纤维不能溶解在酸中，在微纤维的酸提取物中不能检测到任何胶原。

使用差示扫描量热法(DSC)测量的对经挤出的微纤维的生物物理学表征揭示了在未经交联的和经交联的微纤维的组之间不显著的熔化温度提高，如对于与图表2901所测试的相同的样品在图29中的图表2902中所描绘的。然而，所有经挤出的微纤维的平均熔化温度(74±3℃)(图表2902上的线2930)显著高于人类AT的熔化温度(图表2902上的线2920)(60℃)(Wiegnad、Patczai和Lorinczy，2017)，这表明了更高的总体结构稳定性(Sanchez-Ruiz，1995)。在图29的图表2903中的FTIR图谱显示了在酰胺I(～1650cm^-1)、酰胺II(～1560cm^-1)、酰胺III(～1235cm^-1)、酰胺A(～3285cm^-1)和酰胺B(～2917cm^-1)区域中没有显著的峰位移，这表明在本公开内容中使用的挤出以及交联过程之后微纤维的二级结构没有改变。在图表2901中的数据显示为平均值±S.E.M.并且代表来自两个独立实验的3组重复。在图表2901中，指示符号2910描绘p<0.05。

为本公开内容的实施方式确定经挤出的微纤维的细胞附着、代谢活性和细胞毒性，如在图30中的图画3000的说明3001和3002中以及在图31、图32和图33中所示。这些图包括了实施例3～实施例6、对比实施例2和其它样品。如以上所描述的，使用人类腱细胞评估胶原纤维的细胞相容性。在图30中的说明3001中显示了在具有伸长形貌的Telo GLY微纤维(实施例5)上的腱细胞的附着。在12天后，约70％的接种在Telo GLY微纤维上的腱细胞保持附着。当与阳性对照物(仅细胞的组)对比时，如为实施例3～实施例6、对比实施例1和其它样品在图31中所汇总的，通过AlamarBlue荧光法注意到在7天期间(over 7 days)腱细胞代谢活性没有显著变化。然而，与来自所选纤维组的微纤维在一起生长的细胞的代谢活性显著高于(p<0.05)阴性对照组(10mM乙二醛化学品和ZDBC膜)的细胞的代谢活性。如在图32中所说明的，当使用MTT试剂检测时，与在塑料上生长的腱细胞(100％)相比，与微纤维一起培育的腱细胞的活性是75％～85％。阴性对照物(10mM GLY化学品和ZDBC膜)呈现了显著低于(p<0.005)“仅细胞”、Telo DLG(实施例4)、Atelo GLY(实施例5)和Telo GLY(实施例3)组的腱细胞存活率。使用LDH检测观察到了相似的结果(图33)，其中除Atelo DLG和Telo DLG之外所有经挤出的微纤维组得到了(引出，elicited)与“仅细胞”组相似的腱细胞活性。如在图33的指示符号3303处表明的，在7天结束时，10mM GLY化学品组没有足够的腱细胞(ND)用来通过LDH释放至介质中进行检测。商业上可得的来自Ethicon的经涂布的Vicryl缝合线(典型地推荐用于伤口闭合中)提供了对比。使用LDH和MTT检测法两者(图32和图32)的结果表明本公开内容的微纤维实施方式展现了显著低于(p<0.005)缝合线的细胞毒性。总体上，多重检测用以建立经挤出的微纤维的细胞相容性。

特别地，图像3001和图像3002显示了附着至Telo GLY微纤维(实施例3)的人类腱细胞的代表性的共聚焦图像，其中DAPI(箭头3005)和活细胞染色分别地(CMFDA，如在箭头3003处所示)显示了细胞质的延长和伸长的细胞核。图31显示，与仅细胞的组对比，培育7天后使用AlamarBlue检测，与经交联的微纤维在一起培育的人类腱细胞代谢活性没有显著的变化。与微纤维组相比，在与阴性对照物(ZDBC膜和10mM GLY化学品)和Vicryl缝合线在一起培育的腱细胞中的代谢活性显著更低。在图32中汇总的MTT检测结果揭示了对于与微纤维组在一起培育的腱细胞，与仅细胞组相比，其活性减小，但是与阴性对照物相比其活性显著增加。另一方面，对于Atelo DLG(实施例6)和Telo DLG(实施例4)微纤维组以及阴性对照物，在图33中所示的LDH检测结果显示了细胞存活率的显著减小。在与腱细胞一起培育后7天进行MTT和LDG检测这两者。在图32和图33中的所有数据都对仅细胞组归一化。在指示符号3303处(ND)表明10mM乙二醛化学品处理组具有显著的增生阻止(arrest inproliferation)，导致了在检测结束的时间点细胞数量不足用于检测LDH。在这些图中，指示符号3101和指示符号3301显示了p<0.05，指示符号3202显示了p<0.01，指示符号3103和指示符号3203标识了p<0.005，以及指示符号3204和指示符号3304标识了p<0.0001。

为了评估本公开内容的经挤出的微纤维实施方式的生物相容性，按照ISO 10993-6将实施例3～实施例6的所选的4个交联剂组(Atelo DLG、Telo DLG、Telo GLY和AteloGLY)的经灭菌的微纤维束以皮下方式植入大鼠中。来自在图23、图24、图25、图26、图27和图28中的4个交联剂组的每一种的经植入的微纤维束和缝合线对照组(经胶原涂布的)引出了明显的宿主组织响应，其特征在于图34、图35和图36中所示的不同程度的细胞浸润、血管化(vascularization)、胶原沉积和组织重构(remodeling)。在这些之中，与经DL-甘油醛交联的组(Telo DLG(实施例4)或Atelo DLG(实施例6))相比，经乙二醛交联的微纤维组(Telo(GLY)(实施例3)或Atelo(GLY)(实施例5))显示了更低的促炎性(pro-inflammatory)响应。与在图36中所示的缝合线对照物相比，其包括横向的图像3601和纵向的图像3602，在图34的横向图像3401和纵向图像3402中所示的Telo GLY(实施例3)的代表性的H&E染色图像呈现显著高的细胞浸润。与微纤维植入物相比，在4周时在图36中的缝合线对照物引发了强烈的炎症响应。

在图35的图像3501中，通过在围绕Telo(GLY)(实施例3)微纤维植入物的天然组织中的Masson’s Trichrome染色使新形成的胶原的沉积可视化。用Masson’s Trichrome染色的纵向截面，以及图36的图像3602的偏振光图像显示了新形成的胶原以有序方式围绕微纤维沉积，用Masson’s Trichrome染色的纵向截面如在图35中的图像3502中所显示。

如在经H&E染色的切片(图34的图像3401中的黄色箭头)的更高放大倍率的横截面图像中观察到的，在微纤维植入物内和在周围组织中标识出了血管和毛细血管。

图34、图35和图36是对于Telo GLY(实施例3)组在4周时的大鼠皮下植入物的代表性图像。图像3401和图像3501显示了在经染色的片上的微纤维m(通过箭头3410标识)，说明了在图34中的H&E的横向截面和图35中的Masson’s Trichrome。插入图(inset)3490显示了H&E植入物的完整的截面，插入图3495显示了在图像3401中描绘的部分。相似地，插入图3590显示了Masson’s Trichrome植入物的完整的截面，并且插入图3595显示了在图像3501中描绘的部分。图像3401和图像3501两者均说明了显著的细胞浸润。图34中的箭头3420指向植入物内的血管。图像3601显示了在对照样品(使用H&E染色的经胶原涂布的)中可忽略不计的细胞浸润。对于微纤维的植入物的纵向截面，图像35032显示了Masson’s Trichrome染色并且图像3402显示了H&E。图36中的偏振光图像3602显示了围绕植入物的排列的微纤维以及新形成的胶原。图像3402、图像3502和图像3602呈现了在围绕植入物的天然组织中形成了新排列的胶原。在图像3601上的图注“缝合线对照物”标识了经胶原涂布的

使用免疫染色来确定在来自4个交联剂组的微纤维植入物周围的天然组织中的巨噬细胞极化程度，图37和图38是代表性的免疫荧光图像，其显示了在4周时在围绕Telo GLY(实施例3)微纤维植入物的大鼠天然组织中的CCR7(M1)(图37上的图像3700)和CD163(M2)(图38上的图像3800)巨噬细胞表现型的表达模式(expression pattern)。图38显示了表达M1和M2两者、仅M1、仅M2或无M1/M2表现型的巨噬细胞百分比的定量。如在图39的图表3900中所示，与经DL-甘油醛交联的组(Telo DLG(实施例4)和Atelo DLG(实施例6))相比，经乙二醛交联的组(Telo(GLY)(实施例3)和Atelo(GLY)(实施例5))呈现了显著更高比例的表达M1和M2表现型(约40％)的巨噬细胞。进一步地，在Telo(GLY)(实施例3)和Atelo(GLY)(实施例5)的组之间，Telo GLY植入物引出了表达仅M2表现型的细胞的少量亚型(small subset)(6％)，而其余组具有可忽略不计的仅M2的表现型；Atelo GLY(0.2％)、Telo DLG(0％)和Atelo DLG(0％)(图39)。与经乙二醛交联的组(Telo GLY(24％)和Atelo GLY(19％))相比，在经DL-甘油醛交联的组中存在显著更高比例的有M1表现型的细胞(Telo DLG(64％)和Atelo DLG(58％))。如以上描述的，用恰当的对照染色揭示了可忽略不计的非特异性背景染色(未显示)。缝合线对照样品的切片人工痕迹(artifacts)，和显著的背景染色，使得难以对这些样品上进行该分析。

代表性的免疫荧光图像3700和图像3800显示了在4星期时宿主巨噬细胞对Telo(GLY)(实施例3)、微纤维(在箭头3840处标识为m)的响应的实例。黄色箭头3710和黄色箭头3810表明了表达M1和M2两者的细胞的实例。橘色箭头3720和橘色箭头3820表明了表达仅M1的细胞的实例。白色箭头3730和白色箭头3830表明了表达仅M2表现型的细胞。箭头3840指向微纤维束，通过m标识。图39的图表3900显示了对于4组经交联的微纤维，表达M1和M2、仅M1、仅M2或无M1/M2表现型的细胞的％。此分析的结果显示在所有测试的微纤维组中促再生(pro-regenerative)的M2巨噬细胞表现型的引发。与经DL-甘油醛交联的纤维组相比，经乙二醛交联的纤维组显示了更高比例的具有M1和M2表现型的细胞。进一步地，Telo GLY组具有少但显著的仅M2巨噬细胞的亚型。在图表3900中，指示符号3901标识了p<0.05，指示符号3902表明了p<0.01，指示符号3903表明了p<0.005。

在培养介质中测定了微纤维的本公开内容的实施方式的长期水化对机械性质和溶胀程度的影响。因为Telo(GLY)(实施例3)微纤维显示了最优的机械性质、细胞相容性和生物相容性，进一步测试了该组在模拟体外生理条件下的长期稳定性。如通过图40中的图表4000所示，在EMEM(Eagle's Minimum Essential Medium)中的培育导致微纤维宽度在6个月中增加了53％(36.4±1.1μm(第0天)至56.0±1.6μm(6个月))。该图表显示了湿态微纤维随时间的溶胀程度。溶胀伴随着机械性质的显著损失。图41中的图表4100显示了在6个月中平均失效时的力(mean force at failure)从其初始值减小了54％。平均UTS(图42中的图表4200)和模量(图43中的图表4300)也在6个月中从起始时间点降低了82％。在培育的第0天～6个月，没有断裂应变(％)的显著变化(图44中的图表4400)。

因此，图40、图41、图42、图43和图44显示了当在模拟体外生物学环境(在维持在37℃和5％CO₂下的加湿的培育器中的无菌细胞培养介质)的条件下培育最高达6个月时，TeloGLY微纤维是稳定的并且不溶解。

如以从附图中可见的，Telo GLY微纤维的机械稳定性显示了，与第0天相比，在6个月结束时Telo GLY微纤维溶胀了50％(图40)、损失了60％的失效时的力(force atfailure)(图41)、损失了80％的UTS(图42)并且损失了80％的模量，其中Telo GLY微纤维在无菌的EMEM中培育，并在处于37℃和5％CO₂的加湿的培育器中在1星期、1个月、3个月和6个月后在张力状态下评估。然而，在6个月结束时没有％破坏应变的显著变化(图44)。所有在这些附图中描绘的值已经归一化为对于第0天值为1。这些附图中的连续的线已通过检验(by inspection)而画出，仅用做对读者的指引。数据显示为平均值±S.E.M.并且代表至少5次重复。

使用SDS-PAGE来比较胶原起始材料(冻干的端胶原或去端胶原)、未经交联的和经交联的微纤维。在过夜搅动后胶原起始材料容易地溶解在50mM的HCl中。然而，在0.5mg/ml的浓度下，经挤出的微纤维没有进入溶液，并且因此未产生条带。为了确认在微纤维的酸提取物中存在或不存在胶原，在梯度凝胶(3％～8％)(Invitrogen)上用起始材料的溶液和预先染色的分子量标记物(Himark，Invitrogen，CA)运行这些提取物。使用SimplyBlue^TM(Invitrogen，CA)将凝胶染色，之后用去离子水冲洗以使其脱染色。随后在白光下将凝胶成像以观察所有可见的蛋白条带。因此，SDS-PAGE显示了，在与经酸化的起始材料相比时，经挤出的来自具有最大UTS的组的纤维和未经交联的纤维耐酸性水解，经酸化的起始材料显示I型胶原的指纹图谱，其中单体区域特征的条带位于约115kDa，二聚体区域位于约230kDa处，并且三聚体区域位于约460kDa区域。

图45汇总了在文献中发表的性能最佳的(水化的)经交联的胶原纤维中的一些的机械拉伸性质,与本发明的实施方式相比。

总而言之，本公开内容涉及新型的微流体挤出方法，以精确、一致并且可规模化的方式制造I型胶原的微纤维，其作为生物相容的纤维用于范围从天然缝合线至经设计的(engineered)结缔组织的指征(indication)中。本公开内容揭示了本本公开内容的实施方式的生物制造的经乙二醛交联的端胶原微纤维呈现了优于现有的经交联的胶原挤出的微纤维的干态和湿态拉伸性质(Paul和Bailey，2003；Caruso和Dunn，2004；Zeugolis、Paul和Attenburrow，2009；Enea等人，2011)。

尽管很多现有研究没有报道拉伸测试是否是对经水化的纤维进行，或提供了干态纤维的有争议的误导性的结果，或没有公开如何使纤维润湿若纤维是完全水化的，但本文中本公开内容的实施方式的结果提供了经优化的经交联的纤维的干态和经水化的性质以及用于测试的详细方法，其对于领域内的对比和发展是关键的。

在开槽的转鼓上收集纤维引起了所有经交联的微纤维的结构和水化机械性质的显著改变(见图22、图23、图24、图25、图26、图27和图28)。从机械的角度，这样的经改进的强度可能与调制(回火，tempering)、细化(稀化，thinning)和改进的向曾经是纤维的带状物的分子排列有关，导致纤维的拉伸性质强于ACL、跟腱、真皮或任何其它软结缔组织。

在本公开内容的实施方式中，强调了确定交联机制的效率程度。不充分的交联可以引起较低的拉伸强度，而过度使用化学交联剂可以引起在微纤维表面残留交联剂，导致细胞毒性。茚三酮检测法(图36)揭示了有最大交联度的组是那些交联了72小时的组(TeloGLY和Atelo DLG)，其也与拉伸强度的显著增加相关联。使用醛交联的化学反应涉及与胶原中的官能的氨基形成Schiff碱类化合物，导致强的分子键(分子结合，molecular bond)(Fathima等人，2004)。

经挤出的微纤维的实施方式的化学分析揭示了这些经挤出的微纤维进一步地耐酸性水解。本文公开的微流体设备或设置生成了具有比冻干的起始材料更高的化学稳定性的微纤维，并且说明了内部含水量低，所述更高的化学稳定性说明了在微纤维中胶原分子的紧密堆叠(tight packing)导致了稳定的更高级的结构。已经在天然结缔组织中报道了这种更高级的结构(Benjamin、Kaiser和Milz，2008；Wang、Guo和Li，2012)。在经挤出的微纤维中的二级结构的完整性在图29中所示的FTIR分析中得到了确认，其也暗示了挤出加工和交联工艺均未使胶原变性。

尽管在生物仿生(biomimetic)中交联胶原可以帮助改进拉伸性质，用于交联的化学品(例如戊二醛)的降解可能是有毒性的(Gough、Scotchford和Downes，2002；Umashankar、Kumari和Mohanan，2012)。在其它展现低一点细胞毒性的化学品之中，作为交联剂的EDC或EDC/NHS已是用于胶原微纤维的普遍的基础研究选择(Enea等人，2011；Ahmad等人，2015；Shepherd等人，2015)。然而，用经典的交联剂存在仅可忽略不计的拉伸强度的改进和引起注意(noted)的毒性，使得它们不适合用于结缔组织修复。如USFDA批准通常要求的标准化的ISO 10993测试，在本研究中我们展示了机械性能优越的用乙二醛或甘油醛化学交联的经挤出的胶原微纤维的开发，其是高度细胞相容的(见图30、图31、图32和图33)且在体内是生物相容的(如在图34、图35和图36中所示)。进一步地，用乙二醛交联的胶原微纤维耐酸性水解，呈现了向下直到近分子水平的超微结构的特征，并且在细胞培养介质中保持稳定至少6个月，其中单根微纤维具有保持其初始承载能力(load carryingcapacity)的30％～约50％、典型地约40％的能力并且微纤维的UTS值高于天然ACL的UTS值(见图40、图41、图42、图43和图44)。

如本文所描述的用基于胶原的微纤维扩充(增加/增强)ACL或跟腱的缝合线修复或在伤口愈合中使用基于胶原的经编织的缝合线要求基于胶原的材料不仅要以机械方式支持组织，还要以合理的速率促进组织的重构(Dunn、Avasarala和Zawadsky，1993)。因此，为了生物医学的应用，对于建立这些经化学交联的微纤维对细胞毒性、炎性响应和再生响应的影响，在体外和/或在体内的生物相容性测试是关键性的。本公开内容的经挤出的微纤维束的实施方式是细胞相容的，并且对人类腱细胞呈现了极小的(minimal)毒性。本公开内容的微流体挤出的微纤维进一步地支持了人类腱细胞的附着，并且如在结缔组织上观察到的那样取得了伸长的形状(Benjamin，2010)。生物相容性已定义为植入物“局部触发并且引导非纤维化(non-fibrotic)的伤口愈合、重建和组织融合(integration)”的能力(Ratner，2011)。在大鼠中皮下植入4星期之后，经交联的微纤维束植入物表现低(乙二醛组)至中等(甘油醛组)的炎性响应，其中乙二醛-端胶原组呈现了引发促再生的响应。此外，长期稳定性数据和大鼠组织学图像表明微纤维稳定性在体外最高达至少6个月、在体内最高达4星期。因此，本公开内容的实施方式能够在体内维持强度至少约1个月和在体外至少约3个月，并且最高达约6个月。

巨噬细胞是单核细胞的异质(heterogeneous)混合物，所述单核细胞作为对例如在植入材料期间的组织损伤的响应(Mosser，2003；Gordon和Taylor，2005)而在宿主体内被激活。在植入物和宿主组织的界面处的巨噬细胞表现型极化(Kasner等人，2009；Brown等人，2012)对于确定宿主克服作为对手术植入物的响应的促炎性信号和向组织修复及重构的过渡的潜质是重要的。巨噬细胞表现型已广泛地表征为拥有促炎性信号的M1(或被“经典地”激活)和拥有免疫调节或组织重构特性的M2(或被“替代地”激活)(Mills等人，2000)。然而，重要的是注意到激活的巨噬细胞拥有这样的可塑性，其能够容易地从M1切换至M2和从M2切换至M1表现型。这种可塑性通过局部微环境的改变而触发(Porcheray等人，2005；Stout等人，2005)。因此，巨噬细胞也可以采取M1和M2表现型两者的过渡性特征(Brown和Badylak，2013)。在本公开内容的实施方式中，确定了表现出M1、M1和M2、或M2表现型的细胞的比例。这些确定结果说明了以下几点：(1)在植入4星期时，乙二醛交联组具有有更多M1和M2或仅M2表现型的细胞，其表明了在4星期时组织重构响应已经被宿主引发。这说明了来自乙二醛组的微纤维是生物相容性最好的。据我们所知，此前并未对经交联的胶原微纤维进行过这样的免疫响应的深入分析。

将胶原结合到缝合线中用于伤口愈合一直是个挑战。然而，本公开内容提供了制造有效的产品的方法和设备。经胶原涂布的不可吸收缝合线(仅有的市场上可得的基于胶原的合成缝合线)用作参照用于本文的研究。此显示了有限的细胞浸润性，引起在植入物周围的天然组织非常少的向内生长或再生。相反，以缝合线状的(suture-like)束的形式的本公开内容的经乙二醛交联的胶原微纤维实施方式显示了显著的细胞浸润，其中在周围的组织新形成了胶原，这说明了再生性愈合。

本公开内容的实施方式说明了用乙二醛交联的I型临床品质的胶原纤维的微流体挤出展现了示例性的拉伸强度、结构稳定性、细胞相容性和生物相容性，其超过了现有报道的通过其它生物制造方法制作的纯胶原。使用乙二醛来使胶原纤维稳定化呈现了用于胶原微纤维的增材生物制造(additive biomanufacturing)的临床相关(clinicallyrelevant)、安全并且有效的方法。这些经优化的胶原微纤维可以容易地制造成为为了显著改进人类健康而设计的多种生物医学应用，范围包括手术缝合线、韧带内部支撑物、经组织工程的(tissue engineered)韧带、腱和其它有强度的、纤维状的组织。

实施例7

制备了胶原溶液和成形缓冲液。在闭合的聚丙烯容器中，在0.05M的乙酸中将足以形成具有1.6％(w/v)浓度的溶液的量的临床级经冻干的去端胶原(Symatese，法国)溶解。在室温下以180rpm将溶液搅拌过夜。溶液的总体积少于容器体积的一半以确保均匀混合。次日，在离心机中以730g将经酸化的胶原混合物向下旋转(spun down)5分钟。将溶液脱气2分钟，并且以730g向下旋转10分钟以去除气泡。将所得的经酸化的去端胶原拉起至8个20mL注射器(Sterile Luer-Lock Syringes，VWR)中，其将与图46中说明的高输出(high out-put)胶原微纤维挤出装备直接一起使用。

将10gm PEG(聚乙二醇)(35kDa，ChemCruz)、0.686gm TES(N-三(羟甲基)甲基-2-胺基乙磺酸)(Sigma-Aldrich)、0.790gm氯化钠(Sigma-Aldrich)、0.414gm磷酸二氢钠(Baker Analyzed)和1.21gm磷酸氢二钠(Sigma-Aldrich)添加至100ml Milli-Q水，以制备成形缓冲液。在室温下在玻璃烧杯中在搅拌平板(stir-plate)上以400rpm将此混合物搅拌过夜。次日，通过加入10M氢氧化钠(Sigma-Aldrich)将此溶液的pH调节至8，并且随后使用0.45μm过滤器过滤溶液。

在挤出当日，将200mL乙醇(Fisher Scientific)混合至800ml的Milli-Q水，以得到20％乙醇溶液用于脱水浴。

图46显示了系统4600的部分，其中加工了经酸化的去端胶原。安装了注射器阵列泵(syringe array pump)以与可转动的盘4601和全部8个注射器协作。实施例的纤维束用和不用捻制制作(made with and without twisting)。随着缓冲溶液中和了酸并且使纤丝成形，纤维束传送通过成形浴并变强。经捻制和非捻制的束随后进入20％乙醇水溶液的脱水浴，其将水去除并且进一步强化纤维。张紧装置(tensioning rig)在纤维束上保持恒定的张紧状态，直到束沉积到位于浴的末尾处的开槽的线轴上(未显示)。在纤维中的张紧状态辅助了为了强度和稳定性的胶原牵伸和组织(organizing)。随后将绕至线轴的胶原干燥、在乙二醛中交联和用于形成3D移植物。

为了挤出后的化学交联，在大型开槽的线轴上收集未经交联的绷紧的胶原纤维束，其被干燥半小时，并随后浸没至在大型亚克力管中的70％乙醇溶液中的交联剂溶液中，并随后放置在处于1rpm的振荡器上。乙醇水溶液的介质确保了贯穿交联期间微纤维保持脱水。在交联之后，在干贮器中储存微纤直到进行进一步测试。

使用的化学交联剂是浓度10mM的乙二醛(一种二醛)。使用醛进行交联的化学反应涉及与胶原中的官能的氨基形成Schiff碱类化合物，导致强的分子键。

使用“离散纤维”测试方法生成如此生产的单个纤维束的机械性质，其中将在盒(cartridge)上的单独的纤维束和已知量的纤维束的横截面积平均化以测定极限拉伸强度(UTS)、模量和破坏应变(％)。从分析用的图像中测量纤维直径，所述分析用的图像使用倒置光学显微镜(Axio Vert.Al Model，Zeiss，德国)和Image J软件(NIH Shareware，Bethesda，MD)在位于3根单独的1.5英寸长纤维束上的10个不同的点处获得。

图47～图51显示了来自在不同测试条件下(即对于非捻制的纤维和对于捻制的纤维)的纤维束机械测试的结果。纤维类型之间不存在显著差异。图52～图56显示了来自在乙二醛中交联不同时间后的非捻制的纤维束的机械测试的结果。在p<0.01(**)水平存在以下差异：峰值荷载(图53)和UTS(图55)中，以及在p<0.001(****)水平存在以下差异：模量(图54)和UTS(图55)中。

图57是使用扫描电子显微镜(SEM)获得的微纤维束的横截面图像。图57说明了2个多重纤维束的结构。第一束5701和第二束5702包含8根纤维。第一束5701清晰地说明了第一纤维5710、第二纤维5720和第三纤维5730。图57还明晰地(distinctly)显示了第二纤维5720的第二末端5721、第三纤维5730的第三末端5721，和以其他方式(otherwise)不能明晰识别的纤维的第四末端5739。表面5705是在第一纤维束中的所有纤维的末端。

第二纤维束5702显示了第五纤维5740和第五末端5741；第六纤维5750和第六末端5751；第七纤维5760和第七末端5761；和以其他方式不能明晰识别的纤维的第八末端5749。表面5706是在第二纤维束中的所有纤维的末端。

图58是八重纤维束的SEM图像。

尽管已描述了本发明的各种实施方式，本说明书旨在作为示例性的而非限制性的，并且本领域中的一般技术人员将明晰，很多更多的在本发明的范围之内的实施方式与实施是可能的。因此，除了按照所附权利要求及其等同物以外本发明不受限制。此外，可以在所附权利要求的保护范围之内进行各种修正和改变。

参考文献：

将所有在本书面说明中标识的文件(包括以下文章和专利文件)通过引用方式以其全部内容并入。

PCT申请号1PCT/US2018/000119，作为附录A附至本文；以及

PCT申请号PCT/US2018/57412，作为附录B附至本文；

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