一种具有抗氧化活性的鸡骨胶原蛋白肽及其应用
阅读说明：本技术 一种具有抗氧化活性的鸡骨胶原蛋白肽及其应用 (Chicken bone collagen peptide with antioxidant activity and application thereof ) 是由 黄春敏 于 2021-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种具有抗氧化活性的鸡骨胶原蛋白肽及其应用,涉及胶原蛋白肽加工技术领域。本发明鸡骨胶原蛋白肽是经过原料的处理、提取胶原蛋白溶液,并对其进行酶解、离心脱渣、脱色脱腥、超滤、纳滤膜脱盐浓缩、离心分离、灭菌以及离心喷雾干燥后制备而成。本发明所制备的鸡骨胶原蛋白肽具有较高的抗氧化活性,对·OH、DPPH·、O2-·三种典型自由基均具有较高的清除作用,其清除效果与其浓度呈正相关。(The invention discloses chicken bone collagen peptide with antioxidant activity and application thereof, and relates to the technical field of collagen peptide processing. The chicken bone collagen peptide is prepared by treating raw materials, extracting a collagen solution, performing enzymolysis, centrifugal deslagging, decoloring and fishy smell removing, ultrafiltration, nanofiltration membrane desalination and concentration, centrifugal separation, sterilization and centrifugal spray drying. The chicken bone collagen peptide prepared by the invention has higher antioxidant activity, has higher scavenging effect on three typical free radicals of OH, DPPH and O2, and the scavenging effect is positively correlated with the concentration thereof.)
技术领域
本发明属于胶原蛋白肽加工技术领域，具体涉及一种具有抗氧化活性的鸡骨胶原蛋白肽及其应用。
背景技术
自由基导致的活性氧族群(ROS)、氧化应激及脂质过氧化已引起广泛关注。大量的活性氧粒子及自由基极易与机体内其他组分在代谢中发生反应，从而加速机体衰老并在一系列病情恶化中起主导作用，如心血管疾病、癌症等。抗氧化活性肽可以减少自由基，提高机体抗氧化功能。而食源性抗氧化肽因为具有分子质量小、结构简单、易于人体吸收、抗氧化活性高、在不同环境条件下稳定性强等特，逐渐成为一种安全有效的抗氧化剂。
动物骨中含有大量的骨胶原蛋白，经研究发现生长期越短的动物，骨胶原含量越丰富，这种胶原蛋白加热后更易溶出，而成年及老化动物的胶原蛋白在加热后溶出率低。鸡的出栏期是60天，猪的出栏期是70天，牛的生长期在一年以上，显然，鸡骨中胶原蛋白的提取具有优越性和可操作性。
目前对鸡骨的加工主要是以粗制骨粉、骨糊、骨油等低附加值的产品为主，而且鸡骨腥味重，粉碎后的颗粒感显著，是骨类食品加工难以回避的技术问题。鸡骨资源除部分加工食用外，绝大部分用于动物饲料和废弃。鸡骨中含有丰富的营养物质，特别是蛋白质含量丰富，骨蛋白中90％以上为胶原蛋白。因此将从鸡骨中获得具有抗氧化活性的鸡骨胶原蛋白肽是目前行业需要解决的技术难题。
发明内容
基于此，本发明提供了一种具有抗氧化活性的鸡骨胶原蛋白肽，其是以鸡骨为原料，获得抗氧化性能优良的胶原蛋白肽。
本发明具有抗氧化活性的鸡骨胶原蛋白肽，包括以下步骤制备而成：
(1)原料的处理：将鸡骨渣进行粉碎过筛处理；
(2)提取胶原蛋白溶液：将步骤(1)得到的鸡骨渣投入反应釜中，用清水淋洗后，加入2-4倍质量的水，在温度为115℃-121℃、压力为0.15MPa-0.2MPa下蒸煮3-4h，获得胶原蛋白溶液；
(3)酶解：向步骤(2)中提取得到的胶原蛋白溶液中加入中性蛋白酶、胰酶、复合风味蛋白酶进行分步酶解处理，酶解结束后灭酶处理，获得二次酶解液；
(4)离心脱渣：经灭酶灭菌后的二次酶解液进行离心脱渣处理，过滤获得清液；
(5)脱色脱腥：将步骤(4)得到的清液的温度维持在50-60℃后进行脱色脱腥处理，过滤后获得脱色脱腥液；
(6)超滤：将脱色脱腥液采用超滤膜进行超滤以去除杂质，获得超滤液；
(7)纳滤膜脱盐浓缩：将超滤液经纳滤膜进行浓缩、脱盐处理，获得浓缩液，所述浓缩液的浓度达到15％，灰分≤1％，脱盐率达到95％以上；
(8)离心分离：将浓缩液进行离心分离处理，以达到料液的高度纯化；
(9)灭菌：将离心分离得到的清液进行灭菌处理；
(10)离心喷雾干燥，将灭菌后的清液采用高速离心喷雾干燥粒机进行喷粉干燥；
(11)成品包装。
优选的，步骤(1)将鸡骨渣进行粉碎过10-20目筛处理。
优选的，步骤(3)中所述中性蛋白酶为南宁东恒华道生物科技有限责任公司生产的中性蛋白酶，所述中性蛋白酶的加入量占胶原蛋白溶液质量的0.2％-0.3％。
更优选的，步骤(3)所述胰酶的加入量占胶原蛋白溶液质量的0.2％-0.3％。
进一步优选的，步骤(3)所述复合风味蛋白酶是由米曲霉菌株发酵并精制而成的蛋白酶，其包括多肽外切活性酶与内切活性酶两种成分，由南宁东恒华道生物科技有限责任公司提供，所述复合风味蛋白酶的加入量占胶原蛋白溶液质量的0.05％-0.15％。
特别优选的，步骤(3)所述分步酶解为先利用中性蛋白酶和胰酶对胶原蛋白溶液进行酶解，然后再加入复合风味蛋白酶进行酶解；或先利用中性蛋白酶进行酶解，再加入胰酶进行酶解，最后加入复合风味蛋白酶进行酶解；或先利用中性蛋白酶进行酶解，再加入胰酶和复合风味蛋白酶混合酶解。
优选的，步骤(5)采用活性炭纤维膜设备进行脱色脱腥处理。
优选的，步骤(8)离心处理的转速为16000r/min，分离因数为：15050R.C.F
优选的，步骤(9)采用列管式高温瞬时灭菌设备进行灭菌处理，所述灭菌设备设置有预热装置、灭菌装置、热回收装置和冷却装置。
本发明所获得鸡骨胶原蛋白肽具有较高的抗氧性能，可作为抗氧剂使用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所制备的鸡骨胶原蛋白肽分子量相对集中且<10000Da，经LC-MS/MS多肽序列分析得到的PGAR序列，通过·OH、DPPH·、O2-·三种典型自由基体系实验及铁离子还原能力实验，PGAR(鸡骨胶原蛋白肽)对三种自由基均有清除作用，清除效果与其浓度呈正相关。当PGAR浓度达到20mg/mL时，DPPH·清除率为80.24％；而在浓度为9.0mg/mL时，·OH清除率达到92.50％；而在浓度为20mg/mL时，清除O2-·效果为59.80％。可见，在阻断自由基反应的途径中，PGAR具有显著的抗氧化活性。PGAR在还原铁离子实验中，表现出较强的还原能力，这也说明通过络合金属离子的途径，PGAR具有抗氧化活性。
附图说明
图1为本发明鸡骨胶原蛋白肽的工艺流程图；
图2为本发明实施例1鸡骨胶原蛋白肽的总离子流色谱图；
图3为本发明实施例1PGAR肽段二级质谱图；
图4为本发明实施例2鸡骨胶原蛋白肽的总离子流色谱图；
图5为本发明实施例2PGAR肽段二级质谱图；
图6为本发明实施例3鸡骨胶原蛋白肽的总离子流色谱图；
图7为本发明实施例3PGAR肽段二级质谱图；
图8为本发明所述鸡骨胶原蛋白肽(PGAR)和Vc对DPPH自由基的清除作用；
图9为本发明所述鸡骨胶原蛋白肽(PGAR)和Vc对羟基自由基的清除效果；
图10为本发明所述鸡骨胶原蛋白肽(PGAR)和Vc对超氧阴离子自由基的清除效果；
图11为本发明所述鸡骨胶原蛋白肽(PGAR)和Vc的还原性能检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种具有抗氧化活性的鸡骨胶原蛋白肽的制备方法如下：
(1)原料优选：取一定量经检验检疫合格的粉碎后的鸡骨渣，鸡骨渣目数为10-20目；
(2)提取胶原蛋白溶液：将步骤(1)得到的鸡骨渣投入反应釜中，用清水淋洗后，加入2倍质量的水，于120℃、0.2MPa下蒸煮4h；
(3)分步酶解：向步骤(2)中提取得到的胶原蛋白液中先加入占胶原蛋白液质量0.3％的中性蛋白酶和0.2％的胰酶，在温度为52℃，pH为7，酶解3h，再向所得酶解液中加入占胶原蛋白液质量0.1％的复合风味蛋白酶，在温度为55℃，pH为7，酶解0.5h，灭酶；
(4)离心脱渣：经灭酶灭菌后的酶解液通过卧式螺旋沉降离心机进行脱渣，把酶解液中的悬浮碎末和液体进行完全分离；
(5)脱色脱腥：将步骤(4)得到的过滤清液降温至50℃后，经过活性炭纤维膜设备脱色脱腥处理；
(6)膜分离：脱色脱腥液经多功能无机陶瓷膜分离设备超滤，高效去除杂质，将滤液过滤至清液储罐，过滤温度为60℃，过滤压力为0.2MPa；
(7)纳滤膜脱盐浓缩：过滤液经纳滤膜设备浓缩、脱盐，多肽溶液浓缩前浓度控制在5％，经浓缩后物料浓度达到15％，运行压力2MPa，运行温度40℃；
(8)高速管式分离：浓缩液经过高速管式分离机分离，达到料液的高度纯化，无杂质。分离筒转速为16000r/min，分离因数为：15050R.C.F；
(9)列管式高温瞬时灭菌：分离后的清液采用列管式高温瞬时灭菌设备灭菌处理，杀菌温度：120℃，出料温度50℃；
(10)高速离心喷雾干燥：将达到灭菌效果的浓缩液，由高速离心喷雾干燥粒机喷粉干燥，进风口温度200℃，出风口温度98℃；
(11)氨基酸序列测定：基于LC-MS/MS的多肽全序列分析是解析生物药物非常关键的技术，液相色谱和质谱联用不仅可以用来确定氨基酸序列，还可以确定突变和翻译后修饰等全面的生物分子信息。采用此方法得到AGPK、VGPT、PGAR、AGPR四条短肽序列，二级质谱得分分别为：65.3、64.9、151.3、85.4，如表1所示。
表1实施例1鸡骨胶原蛋白肽肽段鉴定结果
实施例2
一种具有抗氧化活性的鸡骨胶原蛋白肽的制备方法如下：
(1)原料优选：取一定量经检验检疫合格的粉碎后的鸡骨渣，鸡骨渣目数为10-20目；
(2)提取胶原蛋白溶液：将步骤(1)得到的鸡骨渣投入反应釜中，用清水淋洗后，加入2.5倍质量的水，于120℃、0.2MPa下蒸煮4h；
(3)分步酶解：向步骤(2)中提取得到的胶原蛋白液中先加入占胶原蛋白液质量为0.2％的中性蛋白酶，在温度为52℃，pH为7，酶解2h，再向所得酶解液中加入占胶原蛋白液质量0.3％的胰酶和0.1％的复合风味蛋白酶，在温度为55℃，pH为7，酶解1.5h，灭酶；
(4)离心脱渣：经灭酶灭菌后的酶解液通过卧式螺旋沉降离心机进行脱渣，把酶解液中的悬浮碎末和液体进行完全分离；
(5)脱色脱腥：将步骤(4)得到的过滤清液降温至50℃后，经过活性炭纤维膜设备脱色脱腥处理；
(6)膜分离：脱色脱腥液经多功能无机陶瓷膜分离设备超滤，高效去除杂质，将滤液过滤至清液储罐，过滤温度为60℃，过滤压力为0.2MPa；
(7)纳滤膜脱盐浓缩：过滤液经纳滤膜设备浓缩、脱盐，多肽溶液浓缩前浓度控制在5％，经浓缩后物料浓度达到15％，运行压力2.5MPa，运行温度43℃；
(8)高速管式分离：浓缩液经过高速管式分离机分离，达到料液的高度纯化，无杂质。分离筒转速为16000r/min，分离因数为：15050R.C.F；
(9)列管式高温瞬时灭菌：分离后的清液采用列管式高温瞬时灭菌设备灭菌处理，杀菌温度：115℃，出料温度54℃；
(10)高速离心喷雾干燥：将达到灭菌效果的浓缩液，由高速离心喷雾干燥粒机喷粉干燥，进风口温度200℃，出风口温度102℃；
(11)氨基酸序列测定：基于LC-MS/MS的多肽全序列分析是解析生物药物非常关键的技术，液相色谱和质谱联用不仅可以用来确定氨基酸序列，还可以确定突变和翻译后修饰等全面的生物分子信息。采用此方法得到AGPK、VGPT、PGAR、AGPR四条短肽序列，二级质谱得分分别为：22.2、33.8、133.1、45.4，如表2所示。
表2实施例2鸡骨胶原蛋白肽肽段鉴定结果
实施例3
一种具有抗氧化活性的鸡骨胶原蛋白肽的制备方法如下：
(1)原料优选：取一定量经检验检疫合格的粉碎后的鸡骨渣，鸡骨渣目数为10-20目；
(2)提取胶原蛋白溶液：将步骤(1)得到的鸡骨渣投入反应釜中，用清水淋洗后，加入2.2倍质量的水，于120℃、0.2MPa下蒸煮4h；
(3)分步酶解：向步骤(2)中提取得到的胶原蛋白液中先加入占胶原蛋白液质量0.3％的中性蛋白酶，在温度为52℃，pH为7，酶解2h，再向所得酶解液中加入占胶原蛋白液质量为0.25％的胰酶，在温度为52℃，pH为7，酶解1h，最后再加入占胶原蛋白液质量0.05％的复合风味蛋白酶，在温度为55℃，pH为7，酶解0.5h，灭酶；
(4)离心脱渣：经灭酶灭菌后的酶解液通过卧式螺旋沉降离心机进行脱渣，把酶解液中的悬浮碎末和液体进行完全分离；
(5)脱色脱腥：将步骤(4)得到的过滤清液降温至50℃后，经过活性炭纤维膜设备脱色脱腥处理；
(6)膜分离：脱色脱腥液经多功能无机陶瓷膜分离设备超滤，高效去除杂质，将滤液过滤至清液储罐，过滤温度为60℃，过滤压力为0.2MPa；
(7)纳滤膜脱盐浓缩：过滤液经纳滤膜设备浓缩、脱盐，多肽溶液浓缩前浓度控制在5％，经浓缩后物料浓度达到15％，运行压力2.2MPa，运行温度42℃；
(8)高速管式分离：浓缩液经过高速管式分离机分离，达到料液的高度纯化，无杂质。分离筒转速为16000r/min，分离因数为：15050R.C.F；
(9)列管式高温瞬时灭菌：分离后的清液采用列管式高温瞬时灭菌设备灭菌处理，杀菌温度：120℃，出料温度55℃；
(10)高速离心喷雾干燥：将达到灭菌效果的浓缩液，由高速离心喷雾干燥粒机喷粉干燥，进风口温度210℃，出风口温度100℃；
(11)氨基酸序列测定：基于LC-MS/MS的多肽全序列分析是解析生物药物非常关键的技术，液相色谱和质谱联用不仅可以用来确定氨基酸序列，还可以确定突变和翻译后修饰等全面的生物分子信息。采用此方法得到AGPK、VGPT、PGAR、AGPR四条短肽序列，二级质谱得分分别为：160.7、21.9、144.4、151.9，如表3所示。
表3实施例3鸡骨胶原蛋白肽肽段鉴定结果
结合实施例1、2、3,得到的短肽序列，将成功鉴定且得分均较高的短肽序列PGAR，并采用Fmoc固相合成技术进行PGAR多肽序列合成。将合成的PGAR多肽进行体外抗氧化性研究，测定DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力及还原能力。
DPPH自由基清除能力测定：在5mL具塞试管中分别加入1.5mL样品溶液及1.5mL0.1mmol/L DPPH溶液，摇匀，避光反应30min后，在517nm下测定其吸光度Ai，同时测定1.5mL0.1mmol/L DPPH溶液与1.5mL95％乙醇混合液的吸光度A0，以及1.5mL样品溶液与1.5mL95％乙醇混合液的吸光度Aj。如图8所示，在所选浓度范围内，PGAR对DPPH自由基清除率呈上升趋势，其IC50值约为6.4mg/mL，可见，PGAR具有较强的DPPH自由基清除能力。VC作为一种高效抗氧化剂，具有极强的DPPH自由基清除能力，其IC50值约为4.0mg/mL。
羟自由基清除能力测定：采用Sminoff的水杨酸钠法，在10mL具塞试管中分别加入2.3mmol/L FeSO4溶液1mL，2.3mmol/L水杨酸钠-乙醇溶液1mL，样品溶液0.5mL，最后加入1mL 2.2mmol/L H2O2溶液启动反应，37℃下反应1h，于510nm下测定吸光值。如图9所示，PGAR对·OH的清除作用不断增强，高浓度时上升趋势减缓，9mg/mL时，清除率达到92.50％。PGAR和Vc的IC50值分别约为4.5mg/mL和0.68mg/mL。
超氧阴离子自由基清除能力测定：采用邻苯三酚自氧化法。在10mL具塞试管中分别加入50mmol/LTris-HCl缓冲溶液(pH 8.2)4.5mL，去离子水4.1mL，25℃水浴中保温20min后，立即加入样品溶液0.1mL，25℃预热过的3mmol/L邻苯三酚0.3mL，于325nm下每隔30s测定吸光度。如图10所示，PGAR能明显降低邻苯三酚自氧化的速率，且呈剂量关系，随着浓度的增加，清除率逐渐增高，但与VC比较，PGAR的清除O2-·的能力相对要弱。
还原能力测定：采用Oyaizu法，在10mL具塞试管中分别加入样品溶液2mL，0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 6.6)2mL，质量分数1％铁氰化钾2mL，50℃水浴中保温20min后，加入质量分数10％三氯乙酸2mL。取2mL反应液，分别加入2mL去离子水和0.4mL质量分数0.1％FeCl3溶液，反应10min后，于700nm下测定吸光值。如图11，在一定浓度范围内，PGAR和VC都随浓度的增加还原能力逐渐增强，PGAR的还原能力具有一定的量效关系。
需要说明的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例，显然本发明不仅仅限于以上实施例，还可以有其他变形。本领域的技术人员从本发明公开内容直接导出或间接引申的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
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