一种鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法
阅读说明：本技术 一种鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法 (Preparation method of codfish ossein protein active peptide ) 是由 郭红星 于 2021-10-08 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法,包括以下步骤：S1原料预处理、S2辐射处理、S3酸处理、S4酶解、S5超声粉碎,本发明酶解提取的活性肽含量高,85.3～88.6mg/100g,其中分子量小于0.5kDa占比达到78.9％,在此分子量阶段的分子肽,能很好的被人体吸收保证肽功能性和活性。(The invention provides a preparation method of cod bone collagen active peptide, which comprises the following steps: s1 raw material pretreatment, S2 radiation treatment, S3 acid treatment, S4 enzymolysis and S5 ultrasonic crushing, the content of active peptide extracted by enzymolysis is high, 85.3-88.6 mg/100g, the ratio of molecular weight of the active peptide to the active peptide is less than 0.5kDa, the active peptide is 78.9%, and the molecular peptide at the molecular weight stage can be well absorbed by human body to ensure the functionality and activity of the active peptide.)
技术领域
本发明涉及生物制品制备技术领域，特别涉及一种鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法。
背景技术
鳕鱼属脊椎动物门(Vertebrata)、脊椎动物亚门(Subphylum Vertebrata)、真骨鱼纲(Division Teleostei)、鳕形目(Gadiformes)。鳕鱼多是生活在海洋底层和深海中下层的冷水性鱼类，广泛分布于世界的各大洋。其中鳕科和无须鳕科中有许多经济价值极高的世界级重要经济鱼类。
胶原是结缔组织中及其重要的一种结构蛋白，广泛存在于动物的骨、腱、肌鞘、韧带、肌膜、软骨和皮肤中，在提取胶原蛋白肽的加工过程中，酶水解是肽制备过程中的十分关键的环节，通过酶水解将大分子的胶原蛋白分解成分子量较小的胶原蛋白肽。但是目前公开的胶原蛋白肽制备方法中大都是只采用了一次水解，在水解过程中存在水解度不高、蛋白质利用率较低等缺陷，造成很多原料的浪费，而且水解度不高便会出现水解后的蛋白肽分子量较大，从而进行二次酶解，从而获取分子量较小的分子肽，经过多次酶解后使得蛋白肽含量损失，获得的活性肽含量较低。
发明内容
鉴于此，本发明提出一种鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法，解决上述问题。
本发明的技术方案是这样实现的：一种鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法：包括以下步骤：
S1、原料预处理：将鳕鱼骨洗干净后，60～80℃水煮10～30min，过滤，取鱼骨浸泡于促渗剂中，浸泡时间12～24h，取出，粉碎，过120～180目，得到鱼骨粉；经过促渗剂浸泡能起到软化鱼骨的作用，有助于后续对可溶性胶原的提取，同时克服鱼骨胶原多肽的腥味、苦味、不良异味的缺点；
S2、辐射处理：将上述鱼骨粉经60Co-γ射线辐射处理，辐射剂量为30～40Gy，辐射剂量率为0.5～0.9Gy/min，辐射处理40～50min；经辐射处理后的鱼骨粉中的分子结构产生共振被活化，增强其分子间的结合力，活化骨粉中1-3kDa分子量的活性肽分子；
S3、酸处理：将S2辐射得到的骨粉与复合酸按质量体积比g/mL为2～6：0.3～0.9混合，在40～80℃下，摇床振荡60～100min，收集下层沉淀，上层为脱钙骨基质液；经过复合酸将鱼骨中的钙质脱离，
S4、酶解：将S3得到的脱钙骨基质液与复合酶在50～60℃、pH5～8下进行酶解1～3h，灭酶，收集水解液；
S5、超声粉碎：S4得到的水解液进行超声粉碎8～12min，进行超滤，得到胶原蛋白活性肽。
进一步的，所述S1的促渗剂为质量体积比g/mL为(0.3～0.8):(1.2～2.0):10的黑蒜多酚、薄荷醇、稀盐酸。
进一步的，所述S3复合酸为质量比为(0.1～0.3):(0.03～0.1):1的芳香酸、水杨酸和酒石酸。
进一步的，所述S4复合酶为质量比为(0.3～0.5):(1～4):(0.8～1.6)的碱性蛋白酶葡糖化酶和β-葡萄糖苷酶。
进一步的，所述S4脱钙骨基质液与复合酶的体积比为10～35:2～8。
进一步的，所述S5超声粉碎的频率为14～100KHz、功率为10～30w。
进一步的，所述S4的超滤为将超声后的水解液调至pH 6-7，在0.03～0.05MPa和23～30℃下超滤处理。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法，仅经一次酶解提取的活性肽含量高，达到85.3～88.6mg/100g，其中分子量小于0.5kDa占比达到88.9％；本发明制备方法中经促渗剂浸泡能起到软化鱼骨的作用，有助于后续对可溶性胶原的提取，同时克服鱼骨胶原多肽的腥味、苦味、不良异味的缺点，经60Co-γ辐射处理后的鱼骨粉中的分子结构产生共振被活化，增强其分子间的结合力，活化骨粉中1-3kDa分子量的活性肽分子，有助于后续酶解过程能够分解生产目标分子肽；通过复合酸处理将鱼骨中的钙质脱离，减少钙离子，提高目标分子量活性肽含量和透皮量，具有较好的生物相容性，为制备化妆品、药品领域奠定基础。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法：包括以下步骤：
S1、原料预处理：将鳕鱼骨洗干净后，60℃水煮10min，过滤，取鱼骨浸泡于促渗剂中，促渗剂为质量体积比g/mL为0.3:1.2:10的黑蒜多酚、薄荷醇、稀盐酸，浸泡时间12h，取出，粉碎，过120目，得到鱼骨粉；
S2、辐射处理：将上述鱼骨粉经60Co-γ射线辐射处理，辐射剂量为30Gy，辐射剂量率为0.5Gy/min，辐射处理40min；
S3、酸处理：将S2得到的骨粉与复合酸按质量体积比g/mL为2：0.3混合，复合酸为质量比为0.1:0.03:1的芳香酸、水杨酸和酒石酸，在40℃下，摇床振荡60～100min，收集下层沉淀，上层为脱钙骨基质液；
S4、酶解：按照体积比为10:2将S3得到的脱钙骨基质液与复合酶在50℃、pH5下进行酶解1h，灭酶，收集水解液，复合酶为质量比为0.3:1:0.8的碱性蛋白酶葡糖化酶和β-葡萄糖苷酶；
S5、超声粉碎：S4得到的水解液进行超声粉碎8min，频率为14KHz、功率为10w，将水解液调至pH 6，在0.03MPa和23℃下超滤处理，得到胶原蛋白活性肽。
实施例2
一种鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法：包括以下步骤：
S1、原料预处理：将鳕鱼骨洗干净后，80℃水煮30min，过滤，取鱼骨浸泡于促渗剂中，促渗剂为质量体积比g/mL为0.8:2.0:10的黑蒜多酚、薄荷醇、稀盐酸，浸泡时间24h，取出，粉碎，过180目，得到鱼骨粉；
S2、辐射处理：将上述鱼骨粉经60Co-γ射线辐射处理，辐射剂量为40Gy，辐射剂量率为0.9Gy/min，辐射处理50min；
S3、酸处理：将S2得到的骨粉与复合酸按质量体积比g/mL为6：0.9混合，复合酸为质量比为0.3:0.1:1的芳香酸、水杨酸和酒石酸，在80℃下，摇床振荡100min，收集下层沉淀，上层为脱钙骨基质液；
S4、酶解：按照体积比为35:8将S3得到的脱钙骨基质液与复合酶在60℃、pH8下进行酶解3h，灭酶，收集水解液，复合酶为质量比为0.5:4:1.6的碱性蛋白酶葡糖化酶和β-葡萄糖苷酶；
S5、超声粉碎：S4得到的水解液进行超声粉碎12min，频率为100KHz、功率为30w，将水解液调至pH 7，在0.05MPa和30℃下超滤处理，得到胶原蛋白活性肽。
实施例3
一种鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法：包括以下步骤：
S1、原料预处理：将鳕鱼骨洗干净后，70℃水煮20min，过滤，取鱼骨浸泡于促渗剂中，促渗剂为质量体积比g/mL为0.5:1.6:10的黑蒜多酚、薄荷醇、稀盐酸，浸泡时间20h，取出，粉碎，过150目，得到鱼骨粉；
S2、辐射处理：将上述鱼骨粉经60Co-γ射线辐射处理，辐射剂量为35Gy，辐射剂量率为0.7Gy/min，辐射处理45min；
S3、酸处理：将S2得到的骨粉与复合酸按质量体积比g/mL为4：0.6混合，复合酸为质量比为0.2:0.07:1的芳香酸、水杨酸和酒石酸，在60℃下，摇床振荡80min，收集下层沉淀，上层为脱钙骨基质液；
S4、酶解：按照体积比为22:6将S3得到的脱钙骨基质液与复合酶在55℃、pH6下进行酶解2h，灭酶，收集水解液，复合酶为质量比为0.4:2:1.2的碱性蛋白酶葡糖化酶和β-葡萄糖苷酶；
S5、超声粉碎：S4得到的水解液进行超声粉碎10min，频率为100KHz、功率为20w，将水解液调至pH 6，在0.04MPa和27℃下超滤处理，得到胶原蛋白活性肽。
对比例1
本对比例与实施例3区别在于，在S1步骤中未加入促渗剂进行浸泡；
具体为鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、原料预处理：将鳕鱼骨洗干净后，70℃水煮20min，过滤，粉碎，过150目，得到鱼骨粉；
S2、辐射处理：将上述鱼骨粉经60Co-γ射线辐射处理，辐射剂量为35Gy，辐射剂量率为0.7Gy/min，辐射处理45min；
S3、酸处理：将S2得到的骨粉与复合酸按质量体积比g/mL为4：0.6混合，复合酸为质量比为0.2:0.07:1的芳香酸、水杨酸和酒石酸，在60℃下，摇床振荡80min，收集下层沉淀，上层为脱钙骨基质液；
S4、酶解：按照体积比为22:6将S3得到的脱钙骨基质液与复合酶在55℃、pH6下进行酶解2h，灭酶，收集水解液，复合酶为质量比为0.4:2:1.2的碱性蛋白酶葡糖化酶和β-葡萄糖苷酶；
S5、超声粉碎：S4得到的水解液进行超声粉碎10min，频率为100KHz、功率为20w，将水解液调至pH 6，在0.04MPa和27℃下超滤处理，得到胶原蛋白活性肽。
对比例2
本对比例与实施例3的区别在于，鱼骨粉未经60Co-γ射线辐射处理；
具体为鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、原料预处理：将鳕鱼骨洗干净后，70℃水煮20min，过滤，取鱼骨浸泡于促渗剂中，促渗剂为质量体积比g/mL为0.5:1.6:10的黑蒜多酚、薄荷醇、稀盐酸，浸泡时间20h，取出，粉碎，过150目，得到鱼骨粉；
S2、酸处理：将S1得到的鱼骨粉与复合酸按质量体积比g/mL为4：0.6混合，复合酸为质量比为0.2:0.07:1的芳香酸、水杨酸和酒石酸，在60℃下，摇床振荡80min，收集下层沉淀，上层为脱钙骨基质液；
S3、酶解：按照体积比为22:6将S2得到的脱钙骨基质液与复合酶在55℃、pH6下进行酶解2h，灭酶，收集水解液，复合酶为质量比为0.4:2:1.2的碱性蛋白酶葡糖化酶和β-葡萄糖苷酶；
S4、超声粉碎：S3得到的水解液进行超声粉碎10min，频率为100KHz、功率为20w，将水解液调至pH 6，在0.04MPa和27℃下超滤处理，得到胶原蛋白活性肽。
对比例3
本对比例与实施例3的区别在于，辐射得到的鱼骨粉未经酸处理；
具体为鳕鱼骨胶原蛋白活性肽的制备方法：包括以下步骤：
S1、原料预处理：将鳕鱼骨洗干净后，70℃水煮20min，过滤，取鱼骨浸泡于促渗剂中，促渗剂为质量体积比g/mL为0.5:1.6:10的黑蒜多酚、薄荷醇、稀盐酸，浸泡时间20h，取出，粉碎，过150目，得到鱼骨粉；
S2、辐射处理：将上述鱼骨粉经60Co-γ射线辐射处理，辐射剂量为35Gy，辐射剂量率为0.7Gy/min，辐射处理45min；
S3、酶解：按照体积比为22:6将S2得到的骨粉与复合酶在55℃、pH6下进行酶解2h，灭酶，收集水解液，复合酶为质量比为0.4:2:1.2的碱性蛋白酶葡糖化酶和β-葡萄糖苷酶；
S4、超声粉碎：S3得到的水解液进行超声粉碎10min，频率为100KHz、功率为20w，将水解液调至pH 6，在0.04MPa和27℃下超滤处理，得到胶原蛋白活性肽。
对比例4
本对比例与实施例3的区别在于，复合酶为质量比为0.1:5:0.5的碱性蛋白酶葡糖化酶和β-葡萄糖苷酶。
一、胶原蛋白含量测定
将实施例1～3和对比例1～4制得的鳕鱼骨胶原蛋白活性肽采用凯氏定氮法测定其胶原蛋白含量，将骨胶原蛋白活性肽通过体积排阻色谱测定其分子量分布，结果如下：
以上述结果可知，活性肽含量最高的为实施例3，达到88.6mg/100g，分子量小于0.5kDa的实施例组占比85.9％以上，对比例组在72.7～78.5％，分子量0.5-1.0kDa之间的实施例组占比10.6～12.3％，对比例组10.6～12.3％，分子量1.0kDa以上的实施例组占比1.6～2.6％，对比例组1.7～2.9％，说明本发明所得胶原蛋白活性肽主要在0.5kDa以下，在此分子量阶段的分子肽，能很好的被人体吸收保证肽功能性和活性。
二、骨胶原蛋白活性肽透皮性能
(1)离体小鼠皮肤制备：将小鼠脱颈椎致死后脱去背部的毛，将皮肤用生理盐水反复冲洗，去除皮下脂肪等组织，制备成直径3cm的成品保藏，
(2)用含有0.5％叠氮化钠的生理盐水将实施例1～3和对比例1～4制得的骨胶原蛋白活性肽配置成10mg/mL的溶液，在12h和24h分别取样品1mL测定其中的骨胶原蛋白活性肽累计含量，测定结果如下表：
由上表可知，本发明的骨胶原蛋白肽具有良好的透皮吸收性能，在12h和24h的累计透皮量7324.9μg和8293.8μg，具有较好的生物相容性，为制备化妆品、药品领域奠定基础。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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