多价纳米抗体及其药物偶联物的制备方法和应用
阅读说明：本技术 多价纳米抗体及其药物偶联物的制备方法和应用 (Preparation method and application of multivalent nano antibody and drug conjugate thereof ) 是由 刘曼曼 武田田 刘扬中 于 2020-08-17 设计创作，主要内容包括：本发明涉及多价纳米抗体及其药物偶联物的制备方法和应用。本发明提供多价纳米抗体的制备方法,所述方法包括使多个纳米抗体通过酶促反应与树枝状聚合物连接的步骤。本发明还提供制备多价纳米抗体的药物偶联物的方法,包括将多价纳米抗体通过基因工程改造添加的标签与药物偶联物偶联的步骤。本发明还涉及多价纳米抗体或其药物偶联物、包含它们的药物组合物或试剂盒以及它们用于制备药物的用途。本发明的多价纳米抗体及其药物偶联物具有良好的稳定性和靶向性,对肿瘤组织具有高穿透力,能够高效杀伤肿瘤细胞,同时延长了抗肿瘤药物的循环时间并且降低了它的系统毒性。(The invention relates to a preparation method and application of a multivalent nano antibody and a drug conjugate thereof. The present invention provides a method for preparing a multivalent nanobody, the method comprising the step of linking a plurality of nanobodies to a dendrimer through an enzymatic reaction. The invention also provides a method for preparing the drug conjugate of the multivalent nanobody, which comprises the step of coupling the multivalent nanobody with the drug conjugate through the added label modified by genetic engineering. The invention also relates to multivalent nanobodies or drug conjugates thereof, pharmaceutical compositions or kits comprising them and their use for the preparation of a medicament. The multivalent nano antibody and the drug conjugate thereof have good stability and targeting property, have high penetrating power on tumor tissues, can efficiently kill tumor cells, prolong the circulation time of the antitumor drug and reduce the systemic toxicity of the antitumor drug.)
技术领域
本发明属于生物制剂领域，涉及一种多价纳米抗体及其药物偶联药物的制备方法和应用，尤其涉及一种简单高效的利用树枝状分子为支架构建多价纳米抗体的方法，多价纳米抗体偶联四价铂前药的制备方法及其在抗肿瘤方面的应用。
背景技术
癌症是严重威胁人类健康的一类基因疾病。近年来，世界各个国家的癌症发病率明显上升，已经成为常见病和多发病，癌症的攻克是科学家需要面对的严峻考验。随着科学和医疗技术的不断进步和发展，以手术切除、传统化疗和放疗为主的单一或多元癌症治疗方法得到了很大的发展。其中化疗全称为化学药物治疗，作为肿瘤抑制经典治疗手段在临床治疗中发挥着重要作用，但在应用过程中依然存在诸多问题：许多实体瘤尚无有效的针对性药物、肿瘤的天然或获得性耐药性以及抗肿瘤药物对人体造成严重的毒性反应和剧烈的毒副作用等。靶向递送药物至特定的肿瘤部位的方式方法逐渐被开发。
抗体偶联药物(ADC)作为靶向治疗药在癌症治疗领域获得了令人瞩目的成就，但是由于抗体的分子量较大，组织穿透能力差，对实体瘤的治疗效果差，抗体制备过程繁琐且造价太高进一步限制了它的广泛应用。
纳米抗体作为一种新兴的纳米靶向制剂近年来倍受关注，相较于传统单克隆抗体，纳米抗体具有：与抗原亲和力高，相对分子量较小，稳定性与溶解性高，人体免疫原性低，易于人源化改造，组织穿透能力强，获得成本低和易于在分子水平进行改造等优点。由纳米抗体制备的肿瘤治疗药物具备高选择性，纳米抗体药物通过受体介导的内在化途径增加抗肿瘤药物的特异性摄取，使药物能够在特定的组织部位富集。纳米抗体偶联药物(NDC)应运而生。
但是单价的NDC也存在一些限制，比如说体内清除率快，药物的负载量相对不高，而多价的纳米抗体由于相对增大的分子量，在体内的循环半衰期延长，同时保留着较强的靶向和肿瘤穿透能力，显示了比单个纳米抗体更有效的靶向抗肿瘤作用。
目前涉及到多价的纳米抗体的制备方法有：ⅰ)基因工程设计，如抗死亡受体-5 的多价纳米抗体，研究表明，多价的纳米抗体具有更优异的引起癌细胞凋亡的能力(Sadeghnezhad,Int.J.Mol.Sci,2019,20,4818；Huet H.A.,MAbs,2014,6(6), 1560-1570)。但其中还存在一些缺陷，如纳米抗体片段之间的linker的选择及长度，还有纳米抗体末端连接方式都可能会对其抗原结合功能产生影响。另外重组蛋白表达量，稳定性等方面也需考虑。操作相对繁琐，难度稍高。ⅱ)以抗体为模板，纳米抗体为单元模块来构建双价或双特异性的结构体(Els Conrath K,J.Biol.Chem.,2001, 276(10),7346-7350)，这种方法相较于抗体来讲虽然简单易得，但是操作上也相对繁琐。ⅲ)利用酶或化学交联剂进行连接，目前为止，未检索到利用化学交联剂进行纳米抗体间的偶联，可能是反应效率及其纳米抗体间非特异性的连接对蛋白功能造成了影响，从而限制了其应用。而酶促介导的多价纳米抗体的构建也未出现。
基于目前的技术来看，一种简易高效的多价纳米抗体制备方法亟待设计开发，多价纳米抗体偶联药物在肿瘤治疗的应用也急需研究发展。
发明内容
本发明针对上述提到的问题进行设计。目前存在的多价纳米抗体在构建时以基因融合表达为主，存在技术上或者成本的问题。而且基因融合的多价纳米抗体在表达和制备上也存在一定的难度。
基于上述问题，本发明提供了多价纳米抗体的制备方法，并制备出多价纳米抗体药物偶联物，探究其在抗肿瘤方面的应用。
在一些实施方案中，本发明提供一种多价纳米抗体的制备方法，所述方法包括使多个纳米抗体通过酶促反应与树枝状聚合物连接的步骤。
在一些实施方案中，所述多价纳米抗体中的纳米抗体的个数没有特别限制，可以包括例如2-16个或更多个纳米抗体，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、或更多个，以制备相应价态的多价纳米抗体。
在一些实施方案中，本文所述纳米抗体(Nanobody，Nb)包括只有重链可变区的单域抗体，也称为重链抗体(HcAb)，重链可变区抗体(VHH)，其具有重链抗体完整的抗原结合能力，但是分子量小，结构简单，稳定性高，容易进入组织。纳米抗体容易进行基因操作制备多价抗体，也可以制备成融合蛋白，用于靶向治疗等。在一些实施方案中，所述纳米抗体包括修饰的纳米抗体，例如降低免疫原性修饰(如人源化)和延长半衰期修饰(如连接抗白蛋白结构域等)。
在本文中，所述纳米抗体可以包括作为药物使用的纳米抗体，例如用于治疗肿瘤的靶向药物，例如靶向肿瘤抗原或生长因子受体的药物，例如靶向EGFR、HER2、 VEGFR的药物。在一些实施方案中，所述纳米抗体可以包括已经批准为药物或正在进行研究和临床试验的纳米抗体，例如Cablivi(caplacizumab)，Vobarilizumab， Ozoralizumab，LCAR-B38M，BI836880，BI655088等。
在一些实施方案中，所述纳米抗体还包含一个多肽标签，并且可以通过所述多肽标签与所述树枝状聚合物进行位点特异性连接。在一些实施方案中，所述纳米抗体包含Nb、C标签(半胱氨酸标签)和/或Q标签(谷氨酰胺标签)，其中Nb是纳米抗体， C标签包含一个或多个(例如2、3、4、5)半胱氨酸，例如包含3个半胱氨酸，所述一个或多个半胱氨酸可以连续或不连续存在于所述C标签中。在一些实施方案中，C 标签可以是一个或多个，C标签可以是例如CCC，CGG，CSS，CGS，CCGG，CCGS， CGSC，CGCS，C-GS-C-GS-C等。在一些实施方案中，为保证特异性，Q标签可以仅包含一个谷氨酰胺，任选地所述Q标签还可以包含一个或多个其他任意氨基酸，例如一个或多个(例如2、3、4、5)亮氨酸和/或一个丝氨酸和/或一个甘氨酸，例如Q标签可以是LLQX，X表示任意氨基酸。在一些实施方案中，Q标签可以是LLQS，LLQG，LLLQS，LLLQG，LLQSG，LLQGS等。
在一些实施方案中，所述纳米抗体的Nb、C标签和/或Q标签之间可以通过一个或多个接头连接。在一些实施方案中，本发明中使用的多肽接头没有特别限制，其可以是任何适合在融合蛋白中使用的接头。在一些实施方案中，本发明的接头可以是例如本领域已知的柔性、刚性或可剪切接头，例如(G)n，(GGGGS)n，(EAAAK)n， (XP)n，其中n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大的整数，X可以是任意氨基酸，例如丙氨酸，赖氨酸或谷氨酸等。在一些实施方案中，本发明的接头可以包含一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20)氨基酸(例如G和/或S)，例如所述接头可以是GS和/或GGGS和/ 或GGGGS接头。
在一些实施方案中，所述纳米抗体具有一个或多个选自下述任一式所示的结构：Nb-C标签，Nb-Q标签，Nb-接头-C标签，Nb-接头-Q标签，Nb-接头1-C标签-接头 2-Q标签，Nb-接头1-Q标签-接头2-C标签，其中接头、接头1和/或接头2可以包含 2-20个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20)氨基酸，例如接头1可以包含8-15个氨基酸，接头2可以包含6-10个氨基酸，C 标签可以是一个或多个，C标签可以是例如CCC，C-GS-C-GS-C，Q标签可以是例如 LLQS，LLQG。
在一些实施方案中，本发明所述树枝状聚合物可以是具有活性基团如活性氨基的树枝状聚合物，例如树枝状聚赖氨酸。在本文中，树枝状聚合物包括从中心开始有规则分支结构的聚合物，包括称为核的中心分子和称为树突的侧链部分，其制备方法是本领域已知的，例如可以通过发散法或收敛法合成，并具有相应的代数(generations)。树枝状聚合物可以通过将带电或亲水性官能团结合到树枝状聚合物表面上的官能团来使树枝状聚合物水溶性，其还可以具有低粘度、高溶解性、可混合性以及高反应性等特性。在一些实施方案中，本发明所述树枝状聚合物可以包括例如聚酰胺、聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、聚赖氨酸等。在一些实施方案中，所述树枝状聚赖氨酸可以是一代，二代，三代，四代，五代多聚赖氨酸。
在一些实施方案中，所述树枝状聚合物可以进一步与修饰剂连接，例如提高稳定性，降低抗原性，延长体内半衰期的修饰剂，例如聚合物修饰剂，例如聚乙二醇(PEG) 修饰剂，所述修饰剂可以通过所述树枝状聚合物的活性基团例如活性羧基基团进行修饰。
在一些实施方案中，所述酶促反应是谷氨酰胺转移酶催化的反应。
在一些实施方案中，多个纳米抗体通过谷氨酰胺转移酶催化，纳米抗体间的碳端以定点的方式，以所述树枝状聚合物为支架连接。
在一些实施方案中，所述酶促反应可以在室温下(25-35℃)进行15-120min。
在一些实施方案中，所述树枝状聚合物和纳米抗体的比例为1：1至1：20，例如1：1，1：2，1：4。
在一些实施方案中，本发明提供一种制备多价纳米抗体药物偶联物的方法，所述多价纳米抗体可以通过本文描述的方法制备。在一些实施方案中，所述药物可以是抗肿瘤药物，例如金属药物，例如铂类(例如四价铂)药物。在一些实施方案中，所述方法包括将所述多价纳米抗体与带有功能基团的药物的偶联，如带有马来酰亚胺功能基团的四价铂前药。
在一些实施方案中，所述制备多价纳米抗体药物偶联物的方法包括：
将所述多价纳米抗体进行处理以得到活性基团，例如通过还原剂处理以得到活性巯基；
制备双功能偶联剂与药物的配合物，例如含有马来酰亚胺基的金属药物的配合物；
使具备活性基团的多价纳米抗体与所述金属药物的配合物反应。
在一些实施方案中，所述多价纳米抗体与所述金属药物偶联物的配合物浓度的物质量的关系为1:3–1:30(例如1:3，1:4，1:5，1:6，1:7，1:8，1:9，1:10，1:15，1:20， 1:25，1:30等)；任选地所述反应可以在室温(25-35℃)下进行；任选地所述反应时长为6-15h(例如6，7，8，9，10，11，12，13，14，15h)。
在一些实施方案中，所述金属药物的配合物通过双功能偶联剂和所述多价纳米抗体的半胱氨酸标签上的活性巯基通过位点特异性反应进行偶联。
在一些实施方案中，本发明提供一种多价纳米抗体或其药物偶联物，例如通过本文描述的方法制备的多价纳米抗体或其药物偶联物。在一些实施方案中，所述多价纳米抗体的碳端以定点的方式，以树枝状聚合物为支架连接。在一些实施方案中，所述多价纳米抗体、所述树枝状聚合物和/或所述药物偶联物包括本文描述的适当多价纳米抗体、树枝状聚合物和/或药物偶联物。
在一些实施方案中，本发明提供一种药物组合物或试剂盒，例如其可以用于治疗肿瘤。在一些实施方案中，本发明的药物组合物或试剂盒包含本文描述的多价纳米抗体或药物偶联物。
在一些实施方案中，本发明提供本文描述的多价纳米抗体或药物偶联物在制备药物或试剂盒中的用途，例如用于治疗肿瘤的药物或试剂盒中的用途。
在一些实施方案中，本发明的药物、组合物或试剂盒可以通过本领域中已知的任何施用途径施用，例如静脉内、肌肉内、真皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其它胃肠外施用途径，例如通过注射或输注。在一些实施方案中，本发明的药物、组合物或试剂盒可以通过非胃肠外途径施用，诸如局部、表皮或粘膜施用途径施用。
在一些实施方案中，本发明的药物、组合物或试剂盒可以包括药学可接受的无菌水溶液或非水溶液，分散液、混悬液或乳液，以及用于复溶成无菌可注射液的无菌粉末。在一些实施方案中，本发明的药物可以与另外的治疗剂如抗癌剂联合使用。本发明的药物的用量可以通过本领域已知的方法确定，并可以根据具体情况进行适当调整。
在一些实施方案中，本发明的药物、组合物或试剂盒中多价纳米抗体或其药物偶联物可以单独存在或与药用载体、赋形剂或稀释剂形成组合物。本发明所述的药物可以通过本领域已知的方法制备，例如，可以将药物配置成固体或液体形式。在一些实施方案中，本发明的药物、组合物或试剂盒可以包含惰性固体、半固体或液体的填充剂、稀释剂、或任何类型的辅料。在一些实施方案中，药用载体如水性和非水性载体、稀释剂、溶剂可以包括水、醇如乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)及合适的混合物、植物油及有机酯诸如油酸乙酯。在一些实施方案中，本发明的药物、组合物或试剂盒也可以包含防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、等渗剂如糖、氯化钠等，延长注射用药物吸收的试剂如单硬脂酸铝、明胶等。在一些实施方案中，本发明的药物、组合物或试剂盒可以包括活性成分以单位剂型存在于容器如预填充注射器、小体积输注容器或多剂量容器中。在一些实施方案中，药物的活性成分可以是粉剂，在使用前与适当载体组合。在一些实施方案中，注射制剂可根据已知技术，例如使用适当液体载体(例如无菌水)及任选的其它添加剂如防腐剂、pH调节剂、缓冲剂、等张剂、溶解助剂和/或表面活性剂等制备，获得可注射溶液或悬浮液，其中还可以包括延缓药物释放的其它添加剂，例如盐、溶解度调节剂或沉淀剂。本发明的药物、组合物或试剂盒还可包含标签或药品说明书，所述说明书可含有与使用所述药物的使用有关的适应症、用法、剂量、给药、禁忌和/或警告的信息。
本发明提供的多价纳米抗体的制备方法，可以实现多个纳米抗体定点的，精准的组装为多价纳米抗体。本发明提出的利用树枝状多聚赖氨酸提供框架，由谷氨酰胺转氨酶催化来构建多价纳米抗体。这种酶介导的连接反应条件温和，兼具简易高效的特点，创新性的克服了上述技术问题。
此外，为改善化疗药物目前存在的缺点：如肿瘤天然或者获得性的耐药性，剧烈的毒副作用等。在本发明的实施例中合成了一种四价铂前药，并在其上修饰上功能基团马来酰亚胺，可以位点特异性地和纳米抗体偶联而不干扰纳米抗体的功能。利用纳米抗体的靶向性将四价铂前药特异地递送至肿瘤细胞，由于纳米抗体良好的穿透能力，这种设计可以在实体瘤的治疗上发挥十分重要的作用。
此外，为了获得延长的半衰期以及增强的相关受体的亲和力和靶向性，我们构建了多价的纳米抗体，从而获得了体内延长的循环半衰期而使得在肿瘤部位的积累量变大，更加有效的靶向治疗肿瘤，同时降低系统的毒副作用。从而有望介导铂类金属药物在靶向治疗肿瘤方面的应用。
本发明提供了一种多价纳米抗体及其制备方法，能够实现多个纳米抗体的定点的，精准组装。依照本发明提供的基因工程的技术手段来改造纳米抗体，改造后的纳米抗体提供可以特异性地偶联抗肿瘤药物的位点C tag和实现多聚的位点Q tag。
优选地，在构建融合标签的纳米抗体时，为了获得性质更稳定，功能保持的纳米抗体，设计了不同长度的接头(linker)。
依照本发明提供的方法，在实施例中利用树枝状多聚赖氨酸提供框架，由谷氨酰胺转氨酶催化来构建多价纳米抗体。这种酶介导的连接反应条件温和，兼具简易高效的特点。
特别地，在构建多价纳米抗体的同时，完成了蛋白的聚乙二醇化。在多价纳米抗体的分子量上进一步增大了产物的分子量从而获得更长的体内循环半衰期；同时提高多价纳米抗体在体内外的稳定性。
在完成多价纳米抗体的构建后，依照本发明提供的纳米抗体药物偶联物的制备方法，四价铂位点特异性的连接在了纳米抗体的C tag上，构建了多价纳米抗体四价铂偶联物。在实施例中系统的研究聚乙二醇化的多价纳米抗体-四价铂偶联物在抗肿瘤方面的应用。制备的多价纳米抗体-四价铂偶联物在纳米抗体的介导下，四价铂前药在肿瘤部位富集，经由受体介导的内在化途径下被细胞特异性摄取，进入肿瘤细胞后被还原成为二价铂，杀伤细胞。依照本发明制备的多价纳米抗体-四价铂偶联物，相比较单价形式的纳米抗体-四价铂偶联物，在动物模型中表现出了更显著的肿瘤抑制作用，且多价的纳米抗体使药物在体内的循环半衰期延长，改善的药代动力学性质，降低药物的系统毒性。从而有望介导铂类金属药物在靶向治疗方面的应用。
在本发明中，公开了多价纳米抗体及其四价铂前药偶联物的制备方法。纳米抗体的碳端融合聚半胱氨酸和谷氨酰胺标签，聚半胱氨酸标签用于偶联四价铂药物；树枝状聚赖氨酸提供活性的氨基基团，在谷氨酰胺转氨酶催化下，和纳米抗体碳端的谷氨酰胺标签连接，构建以树枝状聚赖氨酸为框架的多价纳米抗体。在本发明的一些实施例中，树枝状多聚赖氨酸的代数可以是一至五代，并进行了聚乙二醇化，从而构建聚乙二醇化的多价纳米抗体。在一些实施方案中，聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物制备方法主要包括以下步骤：
第一步：运用分子克隆技术将纳米抗体的cDNA的质粒中的纳米抗体序列的碳端融合上-linker 1-C3 tag-linker 2-Q tag片段。并将修饰后质粒转入原核表达体系中。
第二步：带标签的纳米抗体通过异丙基硫代半乳糖苷诱导的表达菌表达，并经由镍柱亲和层析初步纯化。
第三步：利用固相合成方法制备树枝状多聚赖氨酸，并对该树枝状分子进行聚乙二醇化，得到聚乙二醇化的树支状聚赖氨酸。
第四步：利用谷氨酰胺转氨酶将多个带标签的纳米抗体连接到一个聚乙二醇化的多聚赖氨酸分子上，构建多价纳米抗体。
第五步：制备含有马来酰亚胺基的四价铂配合物。
第六步：将马来酰亚胺基的四价铂配合物，即马来酰胺基铂，与聚乙二醇化的多价纳米抗体混合后，即可获得聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物。
值得注意的是，依照本发明提供的方法，我们在实施例中制备了一代，二代和多代的树枝状聚赖氨酸，并据此构建二价，三价，四价，五价甚至更多价的纳米抗体。并和药物偶联，从而制备基于多价纳米抗体的药物偶联物体系，并应用于抗肿瘤治疗中。在本文中，除非另有明确说明，术语“连接”可以包含共价连接；术语“氨基酸”可以包括D-和L-氨基酸，优选是指L-氨基酸。
特别的，在本发明提供方法的第一步中：所述的Nb-linker 1-C3 tag-linker 2-Qtag，其中的linker 1与2的长度和序列我们进行了一系列的尝试和改造，其中linker 1的长度为8-15个氨基酸，linker 2的长度为6-10个氨基酸。
优选的，第五步中：所述聚乙二醇化的多价纳米抗体的浓度(基于单价纳米抗体)与带有马来酰亚胺基的四价铂配合物浓度的物质量的关系为1:3–1:30；所述反应的条件为常温(25-35℃)，时间是6-15h。
进一步地，本发明提供的构建多价纳米抗体的制备方法，可以适用于所有纳米抗体的改造与制备。而且，本发明实施例中提供的多价纳米抗体偶联物的方法也适用于其他有功能活性的金属药物。
特别地，本发明所提供聚乙二醇化的多价纳米抗体-四价铂前药偶联物对肿瘤组织有很好的穿透力，在小鼠体内较单价纳米抗体有更长的循环时间，对肿瘤的抑制效果尤为明显，并且降低了药物的系统毒性。
在抗肿瘤铂药发挥抗肿瘤作用的同时，多价纳米抗体也通过影响肿瘤细胞表面标志物的信号通路发挥抗肿瘤作用。靶向细胞表面抗原的纳米抗体与抗原的结合能够诱发纳米抗体－受体复合物的细胞内在化，对膜受体相关下游信号通路产生一定的干扰，与铂药协同发挥肿瘤抑制作用。
本发明公开了一种构建多价纳米抗体及其药物偶联物的制备方法并探究了偶联物在抗肿瘤方面的应用，包含多价纳米抗体的制备，抗癌金属药物四价铂前药制备，二者的偶联物及其在抗肿瘤方面的应用。本发明公开的实施例中，公开了一种简便高效的酶催化的多价纳米抗体的制备，利用通过聚乙二醇化的树枝状聚赖氨酸，定点的制备碳端间连接的聚乙二醇化多价纳米抗体，并且位点特异性的修饰上抗癌金属药物四价铂前药，制备聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物。具体制备如下：1.多价纳米抗体-四价铂偶联物的制备。首先利用基因工程技术，构建具有半胱氨酸标签和谷氨酰胺标签的纳米抗体，再次制备聚乙二醇化的树枝状聚赖氨酸，再经谷氨酰胺转移酶的催化，以聚乙二醇化树枝状聚赖氨酸为支架，构建得到聚乙二醇化多价纳米抗体。制备带有马来酰胺功能团的四价铂前药，室温下和经还原处理的聚乙二醇化多价纳米抗体孵育，纯化后得到聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物。2.探究偶联物在抗肿瘤方面的应用。本发明公开的聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物，可以特异地将四价铂前药靶向递送至肿瘤部位，而对正常部位没有损伤，降低了铂类抗肿瘤药物的系统毒性。而且多个纳米抗体的偶联，分子量增大，使得药物在小鼠体内获得了较长的半衰期，同时保有肿瘤组织穿透能力，增加了在肿瘤部位的累积量，在治疗肿瘤方面的有着良好的肿瘤抑制效果。
在一些实施方案中，本发明涉及以下方面：
1.一种利用树枝状聚赖氨酸制备多价纳米抗体及其金属药物偶联物的方法，其特征在于：利用树枝状聚赖氨酸为支架定点的构建碳端相连的多价纳米抗体，并且将其聚乙二醇化以获得延长的循环半衰期；并利用制备的带有马来酰亚胺功能基团的四价铂前药偶联多价纳米抗体，形成聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物。
2.根据项目1所示的聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物，其特征在于：所述的纳米抗体是经过基因工程改造的，其上融合了半胱氨酸标签和Q标签，获得了 Nb-linker1-C tag-linker 2-Q tag，并且在标签之间设计了不同长度的linker(linker 1：8-15 个氨基酸；linker 2：6-10个氨基酸)，构建了不同的纳米抗体。此方法适用于很多种类的纳米抗体。
3.根据项目1所示的聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物，其特征在于：所述的树枝状聚赖氨酸是代数一至五代的多聚赖氨酸。
4.根据项目1所示的聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物，其特征在于：所述的多价纳米抗体是通过谷氨酰胺转移酶催化连接形成的，纳米抗体间的碳端以定点的方式，树枝状聚赖氨酸为支架进行连接，得到稳定性显著提高的聚乙二醇化多价纳米抗体，并且对相应抗原或受体高表达的肿瘤细胞与组织具有很好的靶向能力和肿瘤穿透能力。
5.根据项目1所示的聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物，其特征在于：所述的多价纳米抗体不仅是四价的，还可以依照本发明公开的方法相应构建二价，三价，五价等其他价态的多价纳米抗体。
6.根据项目1所示的聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物，其特征在于：所述的多价纳米抗体及其抗肿瘤金属药物偶联的制备方法中，都是位点特异性的。特别的，避免了非特异性偶联对蛋白质稳定性和功能产生影响。
7.根据项目1所示的聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物，在用于治疗癌症中的应用，可以特异的将四价铂药物递送至肿瘤细胞内并被还原为二价铂，进而杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长。
8.根据项目1所示的聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物，在用于治疗癌症中的应用中，多价纳米抗体的偶联可以增加铂类药物在体内的循环半衰期，并且降低了药物的系统毒性。
9.根据项目1所示的聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物，在用于治疗纳米抗体相应抗原或受体高表达的肿瘤时，可以特异性的结合该膜受体导致复合物内在化，干扰或阻断其下游通路，并且下调该受体在肿瘤细胞表面的表达水平，展示出与抗肿瘤金属药物协同的抗肿瘤作用。
10.一种制备聚乙二醇化多价纳米抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)利用基因工程技术手段制备带有半胱氨酸和谷氨酰胺标签的纳米抗体，并且设计了不同的linker长度的纳米抗体；
2)利用固相合成方法制备一代，二代和/或多代的树枝状聚赖氨酸，其含有多个活性氨基基团，并对其碳端修饰上聚乙二醇；
3)聚乙二醇化聚赖氨酸和已纯化的带标签纳米抗体在室温条件下，和具有催化连接功能的谷氨酰胺转移酶孵育15-120min，分子排阻色谱柱纯化二价，四价和多价纳米抗体。
11.根据项目10所述的制备多价纳米抗体的制备方法，其特征在于：纳米抗体的多聚是以聚乙二醇化的树枝状聚赖氨酸为框架，经由谷氨酰胺转移酶实现定点催化连接而实现的。得到的多价纳米抗体是碳端和碳端相连的，避免了碳-氮端连接可能造成的对结构上接近纳米抗体N端的互补决定区的结合能力的影响。
12.根据项目8所述的制备多价纳米抗体的制备方法，其特征在于：反应为酶促反应，反应条件温和，在室温条件下(25-35℃)即可高效反应。
13.根据项目8所述的制备多价纳米抗体的制备方法，其特征在于：反应为酶促反应，所述的聚乙二醇化聚赖氨酸(基于活性氨基)和纳米抗体的比例为1：1，反应效率很高。
14.一种制备聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物的方法，其特征在于，包含以下制备步骤：
1)根据项目10所述的制备方法得到聚乙二醇化多价纳米抗体，并经由还原剂处理一段时间，经纯化得到具有多个活性巯基的纳米抗体；
2)制备含有马来酰亚胺基的四价铂配合物；
3)将马来酰亚胺基的四价铂配合物，即马来酰胺基铂，与聚乙二醇化的多价纳米抗体在室温下混合一段时间后，脱盐柱除去小分子化合物可获得聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物。
15.根据项目14所述的聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物的制备方法，其特征在于：所述的聚乙二醇化多价纳米抗体的浓度(基于单价纳米抗体)与带有马来酰亚胺基的四价铂配合物浓度的物质量的关系为1:3–1:30；所述反应的条件为常温(25-35℃)，反应时长为6-15h。
16.根据项目14所述的聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物的制备方法，其特征在于：马来酰胺基铂是通过马来酰胺基和半胱氨酸标签上的巯基进行点击反应，偶联到纳米抗体上的，该反应是位点特异性的。
17.根据项目14所述的方法制备聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物，其特征在于，该聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物具有非常好的稳定性，同时对相应受体高表达的细胞具有很好的靶向性，并且对肿瘤组织有很好的穿透力，在体外能够很好的杀伤肿瘤细胞，在植瘤小鼠模型中，对肿瘤有良好的抑制效果，同时延长了抗肿瘤金属药物的循环时间并且降低了它的系统毒性。
本发明具备下述优点和积极效果。
1.酶促反应介导多个纳米抗体位点特异性的，精准的连接组装
本发明通过基因工程改造技术，对多种纳米抗体进行改造。设计不同的柔性链来添加功能标签：Q tag，以末端带有氨基的树枝状赖氨酸为框架，利用mTGase催化纳米抗体Qtag和树枝状聚合物末端氨基形成异肽键而完成纳米抗体的多聚化。多价的纳米抗体的构建方法是位点特异性地，对纳米抗体的功能没有影响，而且该方法简单方便，条件温和，效率很高。可以简易高效的制备聚乙二醇化的多价纳米抗体。此外，该方法构建的多价纳米抗体，即保留了纳米抗体的靶向性且提高了其对相应抗原的结合亲和力，而且具有良好的穿透能力，延长了体内半衰期。该方法有效的避免了基因融合表达多价纳米抗体带来的问题：如稳定性，表达量，操作难度等。而且比多价抗体显示了更强的穿透能力。
2.定点连接四价铂前药
本发明通过基因工程改造技术，对纳米抗体进行改造。设计不同得柔性链来添加功能标签：C tag，通过聚乙二醇化的多价纳米抗体上的半胱氨酸标签定点地与四价铂前药偶联，制备了聚乙二醇化的多聚纳米抗体药物偶联物。使之具有纳米抗体的靶向性，聚乙二醇增强的稳定性和四价铂配合物的细胞毒性。
对于单价纳米抗体来讲，本发明的多价纳米抗体可以提供更多的药物结合位点，提高药物负载率，增强肿瘤细胞杀伤能力。
3.改善的药代动力学性质
相比于单价的纳米抗体药物偶联物，多价的纳米抗体药物偶联物分子质量增大，延长了体内循环时间。特别的，多价纳米抗体在提高靶向抗原亲和力的同时保有了较强的穿透能力，增加了其在肿瘤组织的富集，进一步改善药代动力学性质，增强抗肿瘤效果。
4.优良的抗肿瘤效果
依照本发明提供的方法制备的多价纳米抗体四价铂偶联物，比单价的纳米抗体药物偶联物显示出了更优异的抗肿瘤效果。
5.降低系统毒性
依照本发明提供的方法制备的多价纳米抗体药物偶联物，一种能够被特异性肿瘤细胞的摄取的靶向药物体系。该体系具有显著的稳定性与细胞选择性，所以对正常细胞没有损伤，能够降低传统药物的毒副作用，依照本发明提供的方法而制备的多价纳米抗体药物偶联物可以极大的降低小分子药物的系统毒性，保证在治疗癌症的同时，对正常机体无损伤。
总的来讲，依照本发明提供的方法而制备的聚乙二醇化多价纳米抗体及其药物偶联物，在完成位点特异性修饰的同时兼具简易高效的特点，并且在靶向抗肿瘤方面展现出良好的效果。特征是通过分子克隆技术在纳米抗体碳端融合含有两个活性位点的标签，采用廉价易得的谷氨酰胺转氨酶催化纳米抗体上的标签，以树枝状聚赖氨酸为支架，实现定点的纳米抗体多聚，而且多价纳米抗体是碳端之间连接在一起，对靠近 N端的互补决定区的结合能力可能影响较小；采用马来酰亚胺基与巯基的反应特异地在纳米抗体的半胱氨酸标签上偶联四价铂前药。简便并高效地制备聚乙二醇化的多价纳米抗体药物偶联物。
依照本发明提供的制备方法而构建的多价纳米抗体四价铂偶联物，从稳定性，靶向性，肿瘤穿透能力，药物在肿瘤部位的积累量，肿瘤抑制作用，系统毒性等多个方面研究的结果表明，依照本发明而设计制备的聚乙二醇化多价纳米抗体-药物偶联物具备优异的抗肿瘤性能，在肿瘤靶向治疗领域具有巨大潜能。本发明的多价纳米抗体及其药物偶联物具有良好的稳定性和靶向性，对肿瘤组织具有高穿透力，能够高效杀伤肿瘤细胞，同时延长了抗肿瘤药物的循环时间并且降低了它的系统毒性。
附图说明
图1为本发明实施例中构建带标签的纳米抗体所使用的表达质粒pET 22b图谱。
图2为本发明实施例6中纯化的带标签的纳米抗体蛋白的鉴定和纯度检测。
图3为本发明实施例7中构建的树枝状聚赖氨酸的HPLC分析表征。
图4为本发明实施例7中构建的树枝状聚赖氨酸的ESI-MS分析表征。
图5为本发明实施例8中构建的聚乙二醇化树枝状聚赖氨酸的凝胶色谱(GPC) 分析表征。
图6为本发明实施例8中构建的聚乙二醇化树枝状聚赖氨酸的1H NMR分析表征。
图7为聚乙二醇化纳米抗体和多价纳米抗体制备方法的一个实施例示意图，及其产物的鉴定和纯度检测。
泳道1：谷氨酰胺转氨酶催化的带标签的纳米抗体的聚乙二醇化反应。泳道2：尺寸排阻色谱柱纯化后的聚乙二醇化纳米抗体。泳道3：谷氨酰胺转氨酶催化的带标签的纳米抗体与聚乙二醇化的树枝状多聚赖氨酸的连接反应。泳道4：尺寸排阻色谱柱纯化后的聚乙二醇化的多价纳米抗体。
图8为本发明实施例10中制备的马来酰亚胺基四价铂的ESI-MS表征，其中A显示ESI-MS表征；B显示Simulated isotopic pattern和Experimental isotopic pattern。
图9为本发明实施例10中制备的马来酰亚胺基四价铂的1H NMR表征。
图10为本发明公开的实施例纳米抗体-四价铂偶联物体系的靶向性情况。如本领域已知，细胞核和纳米抗体-四价铂偶联物分别用不同染料标记(细胞核：DAPI；偶联物：FITC)，以显示偶联物的靶向性。
图11为本发明公开的实施例纳米抗体-四价铂偶联物体系的细胞摄取情况。
EGFR阳性的A431细胞的摄取情况在图中用■表示，EGFR阴性的A2780细胞用□表示。对于每个时间点来讲，从左到右的柱形图依次代表Cisplatin,[email protected], [email protected],[email protected]4-PEG。
图12为本发明公开的实施例纳米抗体-四价铂偶联物体系的肿瘤细胞毒性测定。图中为了形成对比，对于同一种药物，左边柱代表A431，右边柱代表A2780。
图13为本发明公开的实施例纳米抗体-四价铂偶联物体系的多细胞球渗透性。
图14为本发明公开的实施例纳米抗体-四价铂偶联物体系的药代动力学研究。
图15为本发明公开的实施例纳米抗体-四价铂偶联物体系在小鼠主要器官的积累。
图A中展示不同的器官的积累量。对于每个器官来讲，从左到右的柱形图依次代表Cisplatin,[email protected],[email protected],[email protected]4-PEG。图B中表示不同的时间点药物在器官中的积累量。从左到右依次表示肝脏，脾脏，肾脏和血液。
图16为本发明公开的实施例纳米抗体-四价铂偶联物体系的肿瘤内的积累。
图中展示了不同的时间点药物在肿瘤的积累量变化，在同一时间点，从左到右依次是药物Cisplatin,[email protected],[email protected]4-PEG。
图17为本发明公开的实施例纳米抗体-四价铂偶联物体系的组织渗透性。
如本领域已知，细胞核(DAPI)、纳米抗体-四价铂偶联物(FITC)、血管(Cy5) 分别用不同染料标记，以显示偶联物的组织渗透性。
图18为本发明公开的实施例纳米抗体-四价铂偶联物体系的小鼠体内抗肿瘤效果。A)各组对A431细胞异种移植瘤的抑制率；B)各组小鼠体重变化。
图19为本发明公开的实施例纳米抗体-四价铂偶联物体系的免疫组化分析。
图20为本发明公开的实施例纳米抗体-四价铂偶联物体系治疗小鼠后肿瘤的EGFR表达水平。图中1为PBS组，2为顺铂组，3为聚乙二醇纳米抗体-四价铂组，4 为聚乙二醇多价纳米抗体-四价铂组。A)免疫组化结果；B)Western blot分析结果。
图21：纳米抗体-四价铂偶联物的稳定性。A)[email protected]，[email protected]，[email protected]4-PEG 的图片。此时药物浓度为5mM(基于铂)，[email protected]出现蛋白聚集，而[email protected]， [email protected]4-PEG在此浓度下仍保持稳定。B)不同浓度的[email protected]的稳定性测试。
图22：荧光光谱分析铂类药物，纳米抗体-四价铂偶联物与DNA的相互作用。
具体实施方式
本发明中所述的酶、试剂盒、载体、宿主菌等可由商业途径得到，如大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta-gami和Top10的菌株购自NEB公司，限制性内切酶等酶购自Takara公司，PCR引物、细菌基因组DNA抽提试剂盒和PCR扩增试剂盒购自上海生工生物工程公司等，Fomc-L-Lys(Fomc)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。所述的化学药品和试剂如马来酰亚胺基己酸、四甲基吗啉、草酰氯、二甲基甲酰胺、三氟乙酸、吡啶、甲醇、乙基二异丙胺(DIEA)、HBTU、HOBt等购自sigma化学试剂有限公司。
实施例中未注明具体条件者，按常规或制造商建议的条件进行。
实施例1：接头linker 1与linker 2的设计
依照本发明提供的linker的长度(linker 1:8-15个氨基酸长度；linker 2：6-10个氨基酸长度)，我们设计了不同的linker序列及长度，以便构建纳米抗体表达载体。
在本实施例中，我们选取以下的linker的长度和序列进行说明。
Linker 1:GGGSGGGS,GGGGSGGGGS,GGGGSGGGGSGGGGS
Linker 2:GSGSGS,GGSGGS,GSGSGSGS,GGSGSGSGGS
实施例2：C tag和Q tag的设计
依照本发明提供的C tag和Q tag的序列和长度，我们设计了不同的标签序列及长度。并应用在之后的实施例当中。
考虑到C tag可以是连续或不连续的，我们对C tag进行以下的设计。
C tag：CCC，C-GS-C-GS-C，CC-GS-CC
Q tag：LLQS，LLQG
实施例3：构建靶向EGFR的纳米抗体的表达载体
据相关文献报道，EGFR在30％的肿瘤中都过表达，选择靶向EGFR的纳米抗体具有十分重要的意义。依照本发明提供的方法，在本实施例中，我们在靶向表皮生长因子受体的纳米抗体7D12(全基因合成，生工生物工程有限公司)的cDNA的质粒中的纳米抗体序列的碳端融合上-linker1-C tag-linker 2-Q tag标签片段，形成7D12-linker 1-C tag-linker2-Q tag。
依照本发明提供的方法，以及实施例1，2中的设计，在本实施例中，我们选取以下的linker的长度和序列进行说明。
Linker 1:GGGSGGGS,GGGGSGGGGS,GGGGSGGGGSGGGGS
Linker 2:GSGSGS,GGSGGS,GSGSGSGS,GGSGSGSGGS,
1.7D12-GGGGSGGGGS-CCC-GSGSGS-LLQS
通过聚合酶链式反应技术，按照表1所示的反应体系、表2所示的反应条件，进行两次反应得到带标签序列的目的片段。
第一次聚合酶链式反应：
正向引物：
GGAATTCCATATGCACCATCACCATCACCATAGCGATAAA；
反向引物： CAGCAGGAACCACCGCCACCAGAGCCACCGCCGCCGCTGCTTACGGTCACCTGG GTA；
模板：人工合成纳米抗体序列
第二次聚合酶链式反应：
正向引物：
GGAATTCCATATGCACCATCACCATCACCATAGCGATAAA；
反向引物： CCGCTCGAGTTAAGATTGAAGAAGACTACCGCTACCACTACCACAGCAGGAACCACCG；
模板：第一次聚合酶链式反应产物
表1：扩增纳米抗体序列的PCR反应体系
ddH<sub>2</sub>O
30.5μL
10xPCR缓冲液
5μL
2mM dNTP(mix)
5μL
25mM MgCl<sub>2</sub>
3μL
10mM正向引物
2.5μL
10mM反向引物
2.5μL
Anti-EGFR Nanobody 7D12 plasmid
1μL
Taq DNA聚合酶
0.5μL
表2：扩增纳米抗体的cDNA的PCR热循环参数
PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收目的片段。回收的目的片段通过限制性内切酶NdeI和XhoI进行酶切。反应体系如表3所示。
将表达载体pET 22b(图谱见图1)通过限制性内切酶NdeI和XhoI进行酶切，置于37℃酶切4小时后，进行琼脂糖凝胶电泳纯化，切胶回收。反应体系如表3所示。
表3：双酶切pET 22b质粒
pET 22b
16μL
ddH<sub>2</sub>O
10μL
10x酶切缓冲液
3μL
NdeI酶
1μL
XhoI酶
1μL
用T4 DNA连接酶将酶切后的目的片段与酶切后的pET 22b进行连接。目的片段与载体质粒按照1:5的比例混合，16℃恒温水浴连接过夜。将连接后的质粒转入大肠杆菌Top10感受态菌株中，挑取单克隆菌落扩大培养，抽提质粒，经由测序鉴定(生工生物工程有限公司)后供后续实施例使用。
2.7D12-GGGSGGGS-CCC-GSGSGS-LLQS
3.7D12-GGGSGGGS-CCC-GGSGGS-LLQS
4.7D12-GGGSGGGS-CCC-GSGSGSGS-LLQS
5.7D12-GGGSGGGS-CCC-GGSGSGSGGS-LLQG
6.7D12-GGGGSGGGGS-CCC-GGSGGS-LLQG
7.7D12-GGGGSGGGGS-CCC-GSGSGSGS-LLQG
8.7D12-GGGGSGGGGS-CCC-GGSGSGSGGS-LLQG
9.7D12-GGGGSGGGGSGGGGS-CGSCGSC-GSGSGS-LLQS
10.7D12-GGGGSGGGGSGGGGS-CGSCGSC-GGSGGS-LLQS
11.7D12-GGGGSGGGGSGGGGS-CGSCGSC-GSGSGSGS-LLQS
12.7D12-GGGGSGGGGSGGGGS-CGSCGSC-GGSGSGSGGS-LLQS
13.7D12-GGGSGGGS-CC-GS-CC-GGSGGS-LLQG
2-13所述的纳米抗体蛋白表达载体的构建步骤如1中所述。
实施例4：构建靶向HER2的纳米抗体的表达载体
乳腺癌业已成为女性的一大杀手，寻求有效治疗乳腺癌的药物刻不容缓。HER2 在多种乳腺癌细胞中过表达，被认为是一个很有价值的靶点。依照本发明提供的方法，我们制备了能够靶向HER2的多价2Rs15d纳米抗体。
我们在靶向HER2的纳米抗体2Rs15d(全基因合成，通用生物系统(安徽)有限公司)的cDNA的质粒中的纳米抗体序列的碳端融合上-linker1-C tag-linker 2-Q tag标签片段，形成2Rs15d-linker 1-C tag-linker 2-Q tag。依照本发明提供的方法以及实施例 1与2的设计，我们设计并制备了带有半胱氨酸和Q标签的纳米抗体2Rs15d- GGGSGGGSGS-Ctag-GSSGSGS-Q tag。同时可以依照发明提供的linker 1与2的序列及长度进行不同的序列改造。
通过聚合酶链式反应技术，按照表1所示的反应体系、表2所示的反应条件，进行两次反应得到带标签序列的目的片段。
第一次聚合酶链式反应：
正向引物：
GGAATTCCATATGCACCATCACCATCACCATAGCGATAAA；
反向引物： TACCCAGGTGACCGTAAGCAGCGGCGGCGGTGGCTCTGGTGGCGGTGGTTCCGGTTCCTGCTG；
模板：人工合成纳米抗体序列
第二次聚合酶链式反应：
正向引物：
GGAATTCCATATGCACCATCACCATCACCATAGCGATAAA；
反向引物：CCGCTCGAGTTAAGATTGAAGAAGACTACCACTACCGCTACCACTACCACAGCAGCAGGAACC；
模板：第一次聚合酶链式反应产物
其后所有步骤与实施例3中的一致。
实施例5：构建靶向VEGFR的纳米抗体的表达载体
VEGFR2是一种血管内皮生长因子受体的一种亚型，它能够促进肿瘤细胞增值，导致肿瘤细胞的细胞周期调控紊乱。所以对其的研究也具有十分重要的意义。依照本发明提供的方法，我们也通过基因工程技术对anti-VEGFR的纳米抗体(全基因合成，生工生物工程有限公司)进行改造，增加C tag和Q tag。
其操作步骤与实施例3一致。
实施例6：带标签的纳米抗体的表达纯化
1.带标签的纳米抗体在大肠杆菌中过表达：
将实施例3，4和5中得到的测序正确的质粒转入Rosetta-gami菌株感受态中，热激、复苏后将菌液涂板，挑取单克隆转化子，扩大培养至4-1000ml的LB培养基(含 100μg/mL氨苄青霉素)中培养。菌株培养至OD600＝0.8-1.0时，加入异丙基硫代半乳糖苷(0.1-0.8mM)，25℃诱导10-15h。培养结束后，以4000rpm，20min的条件于4℃离心收集菌体。
2.用Ni-NTA亲和层析树脂粗纯化带标签的纳米抗体：
用重悬buffer重悬菌体(20mL buffer/L菌液所得菌体)。将重悬菌液进行超声破碎(20KHz，15min)。以16000rpm转速于4℃将细胞破碎液离心30min。上清以 0.8和0.22μm微孔滤膜进行抽滤，收集清液。
将上清倒入Ni-NTA亲和层析树脂柱中，置于4℃旋转摇床，孵育30min，使带标签的纳米抗体充分结合到Ni-NTA亲和层析树脂上。
放出流穿液，加入20mL washing buffer(含0-20mM咪唑进行梯度洗脱)，置于4℃旋转摇床，孵育30min，以除去结合在树脂上的杂蛋白。放出流穿液后，以washing buffer(含20mM咪唑)冲洗树脂三次。以20mL Elution buffer(含160-250mM咪唑)将带标签的纳米抗体从树脂上洗脱下来。收集Elution buffer，超滤除去蛋白体系中的咪唑并对带标签的纳米抗体进行浓缩。
用UV-vis法和BCA法确定蛋白浓度。
获得的带标签的纳米抗体蛋白的纯度表征SDS-PAGE电泳图见图2。
注：1.重悬buffer：20-50mM Tris-HCl pH 8.0,150mM NaCl
2.washing buffer:20-50mM Tris-HCl pH 8.0,150mM NaCl,0-20mM咪唑
3.Elution buffer：20-50mM Tris-HCl pH 8.0,150mM NaCl,160-250mM咪唑
实施例7：树枝状聚赖氨酸的制备
依照本发明提供的制备方法，在本实施例中，我们采用固相肽合成(solid-phasepeptide synthesis，SPPS)的方法，于室温(25℃)中氮气流动下制备树枝状聚赖氨酸(DPK)。
1.DPK-G1的制备
将600毫克2-氯三苯甲基氯树脂分散在DMF中并转移到固相合成反应器中，在氮气鼓吹下使树脂溶胀30min。随后，用DMF(5×5mL)洗涤树脂。在树脂完全溶胀之后，加入相对于树脂活性反应基团2倍当量的Fomc-L-Lys(Fomc)-COOH(957.1毫克)与4倍当量的乙基二异丙胺(DIEA)(129.24毫克)。室温反应3h后，DMF(5×5 mL)洗涤树脂。反应器中加入DMF/吡啶(4:1，V/V，5mL)并鼓泡20min，以去掉 Fomc-L-Lys(Fomc)-resin上的Fomc保护基。反应后，以DMF(5×5mL)洗涤树脂。随后，加入4倍当量的Fomc-L-Lys(Fomc)-COOH(1914.2毫克)，8倍当量的乙基二异丙胺(DIEA)(258.48毫克)以及相对与Fomc-L-Lys(Fomc)-COOH 1倍当量的HBTU 与HOBT。室温反应3h。反应结束后以DMF(5×5mL)洗涤树脂。取少量树脂加入茚三酮显色剂，金属浴加热105℃，1min，指示剂无蓝色反应证明氨基反应完全。分别向反应柱中加入异丙醇(5×5mL)和正己烷(5×5mL)压缩树脂，并以氮气吹干树脂。最后加入10％TFA/甲醇将树枝状聚赖氨酸从树脂上切割下来。旋转蒸发除去溶剂后，加入过量无水乙醚重结晶，并将收集的产物在室温放置干燥。由于带有Fomc保护基的产物难以分析，我们取少量产物，以哌啶脱除保护基后通过HPLC(0-60％B， 30min，0.1％TFA)和ESI-MS进行分析，其结果见图3与图4。
反应流程如下所示：
2.DPK-G2的制备
为了获得更多有活性的氨基，制备多价的纳米抗体。我们按照实施例7-1的固相合成肽的方法继续制备了DPK-G2。其结构式如下：
3.DPK-G3的制备
为了获得更多有活性的氨基，制备多价的纳米抗体。我们按照实施例7-1的固相合成肽的方法继续制备了DPK-G3。其结构式如下：
4.DPK-Gn的制备
利用固相合成的方法，可以制备多代的树枝状多聚赖氨酸化合物，在实际应用中提供所需要的氨基。在本发明中，n＝1,2,3…实施例虽然仅提供了DPK-G1和DPK-G2和DPK-G3的制备，但并不局限于本实施例所提供的例子，可以根据实际的需要，构建多代的树枝状多聚赖氨酸化合物，来进行多价纳米抗体的制备及后续研究。特别地，也可以根据需要对树枝状聚合物进行进一步的改造，修饰上其他的功能基团，完成多样化的负载。
实施例8:聚乙二醇化的树枝状多聚赖氨酸的制备
1.DPK-G1的聚乙二醇化
将实施例7-1中由固相合成获得的树枝状聚赖氨酸(DPK-G1)按照1.25:1:1:2与氨基聚乙二醇(上海芃硕生物科技有限公司，80506-64-5)、HBTU、DIEA混合与DMF 中室温反应3h。反应结束后茚三酮显色剂检测氨基反应完全，高真空旋转蒸发除去大部分溶剂，向反应液中加入DMF/哌啶(4:1，V/V)并室温搅拌20min。反应结束后将产物通过旋转蒸发除去大部分溶剂，随后将浓缩的产物转移到截留分子量为3kDa 的透析袋中，以二次水为透析外液，每2h换液一次，透析5次除去产物中的活化试剂等小分子杂质。将透析后产物转移到EP管中冷冻干燥得到淡黄色固体。我们对样品进行凝胶色谱(GPC)与核磁分析。其结果见图5和6。
反应流程如下所示：
2.DPK-G2的聚乙二醇化
按照实施例中8-1的实施方法，我们同样的将DPK-G2进行聚乙二醇化，得到了PEG-DPK-G2。其结构式如下：
3.DPK-G3的聚乙二醇化
按照实施例中8-1的实施方法，我们同样的将DPK-G3进行聚乙二醇化，得到了PEG-DPK-G3。其结构式如下：
实施例9：多价纳米抗体的制备
1.二价纳米抗体的制备
氨基带保护的聚赖氨酸与氨基聚乙二醇(上海芃硕生物科技有限公司， 80506-64-5)EDC，NHS混合于室温反应24h。反应结束后茚三酮显色剂检测氨基反应完全，随后将产物转移到截留分子量为1kDa的透析袋中，以ddH2O为透析外液，每2h换液一次，透析5次除去产物中的活化试剂等小分子杂质。将透析后产物转移到EP管中冷冻干燥得到淡黄色固体。
将实施例6中得到的多种带标签的纳米抗体与聚乙二醇化树枝状聚赖氨酸PEG-DPK-G0在室温下2:1混合，加入谷氨酰胺转氨酶(mTGase，由一鸣(中国)提供)，室温反应15-120min。反应后的产物聚乙二醇化多价纳米抗体在蛋白纯化仪 (HiLoad 10/60Superdex 200column)中进行进一步纯化，
2.四价纳米抗体的制备
由实施例8-1得到的PEG-DPK-G1含有4个活性氨基基团，可以被谷氨酰胺转氨酶识别，催化氨基和纳米抗体碳端的谷氨酰胺标签连接形成异肽键，可以形成碳端连接的多价纳米抗体。
将实施例6中得到的多种带标签的纳米抗体与聚乙二醇化树枝状聚赖氨酸 PEG-DPK-G1在室温下4:1混合，加入谷氨酰胺转氨酶(mTGase，由一鸣(中国)提供)，室温反应15-120min。反应后的产物聚乙二醇化多价纳米抗体在蛋白纯化仪 (HiLoad 10/60Superdex 200column)中进行进一步纯化，纯化后得到的聚乙二醇化多价纳米抗体的纯度通过聚丙烯酰胺凝胶鉴定，其SDS-PAGE电泳图见图7。
3.多价(>4)纳米抗体的制备
按照实施例9-2中的步骤，利用mTGase的偶联功能，催化实施例8-2种制备的 PEG-DPK-G2，PEG-DPK-G3与实施例6中所得的多种纳米抗体相连接，形成多种不同的多价的纳米抗体。
实施例10：四价铂前药的制备
铂类药物由于铂的特性，在四价和二价的状态下均可形成配合物。且研究表明，四价铂相较于二价铂更稳定。由于其能够含有更多的配位点，可以进行官能团的修饰。并且四价铂可以在还原剂的还原作用下，还原为二价铂，从而发挥其原有的功能。
依照本发明，我们在实施例中提供了两种四价铂药物的制备。
1.四价顺铂前药的制备
将300mg顺铂(山东铂源药业有限公司)分散在40ml乙酸中，然后加入2mL 30％过氧化氢，在35℃反应4小时。反应结束后，通过旋转蒸发除去大部分溶剂，然后用乙醚沉淀得到固体。重复用乙醚洗涤三次，获得的沉淀固体通过冷冻干燥获得到粉末，产物即为cis-[PtCl2(NH3)2(OH)(OAc)](Ac-Pt(IV))。
同时，将250mg马来酰亚胺基己酸与1mL草酰氯在冰浴条件下溶解在5mL无水二氯甲烷中，充分混合后避光过夜反应。反应结束后，旋转蒸发除去混合物中的草酰氯与二氯甲烷，获得马来酰亚胺基己酰氯。然后将Ac-Pt(IV)分散在无水DMF中，加入400mg 4-甲基吗啉(NMM)，然后在冰水浴的条件下缓慢滴加马来酰亚胺基己酰氯，混合物在室温下避光搅拌过夜。反应结束后将大部分溶剂旋干，加入乙醚沉淀产物，得到白色固体马来酰亚胺基四价铂前药(Mal-Pt(IV))。产物用乙醚洗涤三次后，通过冷冻干燥获得粉末状产物。产物经由ESI-MS和1H NMR鉴定。结果见图8和图9。反应流程如下所示：
2.四价奥沙利铂的制备
将300mg奥沙利铂(山东铂源药业有限公司)分散在2mL 30％过氧化氢，在50℃反应4小时。反应结束后，通过旋转蒸发除去大部分溶剂，然后用丙酮沉淀得到固体。重复用乙醚洗涤三次，获得的沉淀固体通过冷冻干燥获得到粉末，产物即为双羟基的四价奥沙利铂。
同时，将马来酰亚胺琥珀酰亚胺脂与双羟基的四价奥沙利铂溶解在5mL无水二氯甲烷中，充分混合后避光过夜反应。反应结束后，旋转蒸发除去溶剂。反应结束后将大部分溶剂旋干，用丙酮重悬，并加入乙醚洗涤产物，得到白色固体马来酰亚胺基铂 (Mal-Pt(IV))。产物用乙醚洗涤三次后，通过冷冻干燥获得粉末状产物。
实施例11：多价纳米抗体-四价铂偶联物的制备
在37℃的恒定温度下向实施例9所得的多种聚乙二醇化二价，四价和多种多价 (>4)纳米抗体中加入相当于纳米抗体5倍摩尔当量的β-氨基乙硫醇盐酸盐，β-巯基乙醇或三(2-羧乙基)膦处理3h，使多价纳米抗体碳端上半胱氨酸的巯基被充分还原。随后使用蛋白纯化仪(HiTrapTM Desalting)对蛋白分别脱盐，以除去混合在体系中的还原剂。采用DTNB法，即通过加入5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，通过其与巯基反应的特异性显色分析纳米抗体上的巯基含量。
根据所测定的巯基含量，将纯化后的纳米抗体与马来酰亚胺基铂以物质的量比1：3～1：30的比例混合。室温下孵育6-15h后，通过蛋白纯化仪(HiTrapTM Desalting)除去体系中未参与反应的马来酰亚胺基铂。
采用BCA法测定蛋白的浓度，通过电感耦合等离子体质谱测量偶联物中铂的含量。不同的纳米抗体与马来酰亚胺基铂的投料比决定了纳米抗体上可以结合的马来酰亚胺四价铂的数量。根据实验结果，一分子量的纳米抗体能够结合约1.8个四价铂前药分子。
其中一种多价纳米抗体-四价铂偶联物制备流程如下：
实施例12：纳米抗体-四价铂偶联物([email protected])的制备及其聚乙二醇化修饰 ([email protected])
纳米抗体-四价铂偶联物([email protected])作为实施例11的对比样品，其中的蛋白样品制备方法参照实施例1-6，构建带有半胱氨酸标签的纳米抗体，纳米抗体-四价铂偶联物的制备参照实施例11。
聚乙二醇化纳米抗体-四价铂偶联物([email protected])同样作为实施例11的对比样品，其中的蛋白样品为实施例1-6中带有谷氨酰胺和半胱氨酸标签的纳米抗体。此外聚乙二醇化的纳米抗体的制备步骤如下：
将带标签的纳米抗体(3mg/mL)与分子量为5kDa的氨基聚乙二醇(1mg/mL) 在室温下混合，加入1U/mL的谷氨酰胺转氨酶，室温反应1h。反应后的产物聚乙二醇化的纳米抗体在蛋白纯化仪(HiLoad 10/60Superdex 200column)中进行进一步纯化，纯化后得到的聚乙二醇化的纳米抗体纯度通过聚丙烯酰胺凝胶鉴定，其 SDS-PAGE电泳图见图7。
聚乙二醇化纳米抗体-四价铂偶联物的制备参照实施例11。
实施例13：多价纳米抗体-四价铂偶联物的稳定性
将实施例5，11，13中制备的[email protected]，[email protected]，[email protected]4-PEG经超滤浓缩，在浓缩过程中时刻观察样品是否保持稳定。结果发现，如图21A所示，修饰有PEG的 [email protected]，[email protected]4-PEG在浓缩至最高5mM(基于铂的浓度)时依然没有产生沉淀由此可见，PEG的引入对于纳米抗体-四价铂偶联物的体外稳定性产生了积极的效果。
此外，将不同浓度的[email protected]在25℃的恒温培养箱中孵育，在不同的时间点取出部分样品进行离心，测定蛋白浓度，发现其在6天内依然保持很好的稳定性。结果如图21B所示。
实施例14：多价纳米抗体-四价铂偶联物与DNA的反应
四价铂前药是一类能够在血液循环中保持相对稳定的金属药物前体。并且能够在还原剂的作用下被还原为二价铂。肿瘤细胞内存在一定量的还原剂如GSH，可以将四价铂还原为二价铂，随后和DNA相互作用，发挥细胞毒性。
溴化乙锭(EtBr)是一种高度灵敏的荧光指示剂，可以作为荧光探针用于检测铂类药物与DNA的结合。EtBr与DNA混合后能嵌入到DNA的双链之中，产生荧光信号。铂化合物与DNA发生相互作用，使DNA双螺旋发生扭曲和解旋，相应的EtBr 的荧光信号会发生变化。故此我们通过对荧光信号的检测来判断铂类化合物是否与 DNA发生了相互作用。并采用荧光光谱分析二者的结合。
将鱼精DNA与顺铂，四价铂，[email protected]，[email protected]，[email protected]4-PEG在添加/不添加还原剂的情况下在37℃水浴中进行孵育，全程保持避光。在。然后在不同的时间点加入EtBr，用荧光光谱仪进行分析：在530nm处激发，615nm处发射，记录荧光光谱的吸收。如图22所示，纳米抗体-四价铂偶联物在ASA/GSH的还原作用下，与DNA 结合。而没有还原剂的组，没有明显的信号变化，表明纳米抗体-四价铂偶联物在进入细胞前能够保持惰性，在肿瘤细胞内被还原发挥与DNA结合的功能。
实施例15：多价纳米抗体-四价铂偶联物在抗肿瘤方面的应用
依照本发明公开的制备方法，构建了一系列的纳米抗体-四价铂药物偶联体系，在本实施例中，我们将实施例11所得的聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物 ([email protected]4-PEG)和实施例12中的纳米抗体-四价铂偶联物([email protected])，聚乙二醇化纳米抗体-四价铂偶联物([email protected])做对比，探究依照本发明提供的制备方法构建的聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物在抗肿瘤方面的应用。
1.本发明制备的纳米抗体-四价铂体系的靶向性验证
本发明的实施例11中聚乙二醇化多价纳米抗体四价铂偶联物的靶向性采用免疫荧光的方法验证并和实施例12作比较。用荧光探针异硫氰酸荧光素(FITC，激发光 488nm)预先标记纳米抗体，并用荧光素标记后的纳米抗体制备纳米抗体-四价铂偶联物、聚乙二醇化纳米抗体-四价铂偶联物和聚乙二醇化的多价纳米抗体-四价铂偶联物。
将表皮生长因子过表达的癌细胞A431和作为阴性对照的表皮生长因子低表达癌细胞A2780接种于24孔板中，接种密度为1×105个细胞/孔，置于培养箱中进行过夜培养。将含有50μM的荧光素标记的纳米抗体-四价铂偶联物、聚乙二醇化纳米抗体- 四价铂偶联物或聚乙二醇化的多价纳米抗体-四价铂偶联物的1mL新鲜培养基替换培养孔中原有的培养基。将细胞在培养箱中进一步培养3小时。随后，细胞用冷PBS洗涤3次，加入4％多聚甲醛固定10min。细胞核用DAPI染色(参照产品说明书)。制片后使用共焦激光扫描显微镜(LSM 710CLSM，Carl Zeiss，Jena，Germany)检测荧光，分析药物与细胞的结合情况。靶向性验证结果如图10所示。绿色荧光信号在EGFR 过表达的A431细胞中富集，而对照组EGFR低表达的A2780组没有表现出可观察到的绿色荧光信号。该实验结果表明，对纳米抗体的聚乙二醇化，四聚化，以及Pt(IV) 金属药物的偶联没有对纳米抗体的靶向性表现出显著的影响。本发明实施例中制备的纳米抗体-四价铂体系对EGFR高表达的癌细胞具有显著的细胞选择性。
2.本发明制备的纳米抗体-四价铂体系的细胞摄取
细胞摄取实验选用增殖旺盛的对数生长期细胞，按照1×105个细胞/孔的密度接种在24孔板中，于培养箱中培养过夜后进行试验。细胞贴壁后，加入含有50μM浓度的顺铂，纳米抗体-四价铂偶联物，聚乙二醇化纳米抗体-四价铂偶联物或聚乙二醇多价纳米抗体-四价铂偶联物的培养基溶液，继续培养4小时。随后吸去带有药物的培养基，细胞用冷的PBS洗涤3次。通过使用胰蛋白酶消化收获细胞，细胞计数后，收获的细胞用硝酸消化以进行ICP-MS测量。通过ICP-MS测量细胞中铂的积累量。细胞摄取结果如图11所示，表皮生长因子受体(EGFR)过表达的A431细胞的铂积累量明显高于表皮生长因子受体低表达的A2780细胞，表明纳米抗体-四价铂体系可以特异性地被表皮生长因子受体过表达的肿瘤细胞摄取。
3.本发明制备的纳米抗体-四价铂体系的结合力的测定
为了探究本发明构建的纳米抗体-四价铂体系对表皮生长因子受体(EGFR)过表达的A431细胞的结合力，本实施例利用流式细胞仪展开实验。为了防止纳米抗体-四价铂体系在测量过程中内化，细胞结合测定实验在4℃进行。A431细胞与一系列纳米抗体-四价铂体系按所需浓度孵育。一系列纳米抗体-四价铂体系在不同时间培养后，弃去培养基，胰酶消化后离心其上清，用冷的PBS洗涤三次后，立即用流式细胞仪检测。KD、Kon和Koff的计算按照下述公式进行。
kobs＝[sdAb]kon+koff
计算结果如下表所示：
表4：纳米抗体-四价铂偶联体系的结合亲和力和解离速率常数的测定
Group
K<sub>D</sub>(nM)
K<sub>on</sub>(μM<sup>-1</sup> min<sup>-1</sup>)
K<sub>off</sub>(s<sup>-1</sup>)×10<sup>-3</sup>
Nb
23.1
0.31
7.16
[email protected]
24.2
0.36
8.71
[email protected]
22.9
0.40
9.16
[email protected]<sub>4</sub>-PEG
3.4
0.28
0.95
4.本发明制备的纳米抗体-四价铂体系的肿瘤细胞毒性测定
将表皮生长因子表达量不同的A431细胞，MDA-MB-231，A549和表皮生长因子低表达的A2780,MCF-7细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养基中于37℃、5％CO2的条件下培养至细胞贴壁。细胞毒性实验选用增殖旺盛的对数生长期细胞，按照3×103个细胞/孔的密度接种在96孔板中，于培养箱中培养24小时后进行试验。设置实验组、对照组和空白组，实验组加入不同种类，不同浓度的药物，对照组不加入药物，空白组没有接种细胞且不加药物。将培养板中的细胞继续培养72小时。
吸去旧的培养基加入新鲜培养基100μL，然后每孔加入25μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5％MTT)，继续培养4小时。随后，每孔加入100μL二甲基亚砜，于 37℃震荡箱中震荡15-30min，使结晶物充分溶解。使用酶标仪在490nm处测量各孔的吸光度A值。
存活率(％)＝[实验组(S)的A值-空白(B)A值]/[对照组(C)的A值-空白(B)的A值]
细胞毒性测定实验结果如图12和表5所示，结合实施例15-2和图11的结果，可以发现，纳米抗体-四价铂体系的细胞摄取和细胞毒性都具有显著的选择性。EGFR低表达的A2780细胞没有显著的铂药物积累，纳米抗体-四价铂体系对这种细胞的细胞活性也没有产生显著的影响。不同修饰的纳米抗体-四价铂体系对EGFR高表达的A431 细胞表现出的毒性也有一定的差异，聚乙二醇化对纳米抗体-四价铂的细胞毒性没有显著影响，而聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物对EGFR+A431的细胞毒性略有所降低。但是对EGFR-A2780细胞没有明显的生长抑制。体现了聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂的选择性的细胞毒性。此外，通过对不同EGFR表达水平的肿瘤细胞的毒性实验可以看出，聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂对细胞的毒性是EGFR表达水平依赖的。
表5：纳米抗体-四价铂体系的IC50(μM)值
5.本发明制备的纳米抗体-四价铂体系的多细胞球渗透性
根据文献报道的方法培养MCSs(Small 2018,14,1702858)。将T75培养瓶预先用10mL热琼脂糖溶液(1％w/v)覆盖并放置冷却至琼脂糖完全凝固。将EGFR+A431 细胞培养过夜，消化后计数，将EGFR+A431细胞按照1×106个细胞/孔接种于含有1％青霉素－链霉素的15mL DMEM培养基的T75培养瓶中，培养约4天后形成球状体。将MCSs转移到预先经过琼脂糖处理的24孔板中，并与荧光素标记的纳米抗体、纳米抗体-四价铂偶联物、聚乙二醇化纳米抗体-四价铂偶联物或聚乙二醇化的多价纳米抗体-四价铂偶联物(按照50nM Nb的浓度添加)一起培养。在37℃培养4h后，收集 MCSs并用冷的PBS洗涤三次。将MCSs在室温下用4％(w/v)PFA固定1h，并用共焦激光扫描显微镜观察(LSM 710 CLSM，Carl Zeiss，Jena，Germany)。结果如图13 所示，绿色荧光信号分布在MCSs的中心及四周，表明纳米抗体-四价铂体系在体外模型中具有较好的渗透性，通过对荧光密度进行定量分析，可以发现聚乙二醇化和四聚化对纳米抗体的渗透性没有产生显著的影响。
6.本发明制备的纳米抗体-四价铂体系的药代动力学研究
通过共价键偶联聚乙二醇的策略被广泛认为能够增加抗体类药物的体内稳定性和循环半衰期。在本发明的实施例11中，将聚乙二醇通过定点修饰的方法偶联到了多价纳米抗体的框架树枝状聚赖氨酸的碳端。我们期望通过偶联聚乙二醇的方法提高纳米抗体-四价铂的体内循环半衰期，使药物能够有更长循环作用时间。
纳米抗体-四价铂体系的药代动力学研宄在Nude mice中进行。将小鼠随机分为5组(每组3只)。通过尾静脉向小鼠注射药物(2mg Pt/kg体重)。于注射后5min，30 min，1h，2h，4h，6h，8h，12h，24h对小鼠进行眼眶取血，然后将血液样品在4℃ (3000g，10min)离心，收集血清。用ICP-MS测定血清中Pt的含量。
其结果如图14所示，与纳米抗体-四价铂偶联物相比，聚乙二醇化纳米抗体-四价铂偶联物的血液循环半衰期没有显著增加，而四聚化产物由于其分子量较高(约56 kDa)，能够较长时间的在血清中保持相对较高的浓度，在实验组中显示了最长的血液循环半衰期。除了聚乙二醇链的作用，聚乙二醇化多价纳米抗体四价铂偶联物的尺寸较大从而避免肾小球过滤清除，因此也能够延长体内循环时间。
7.本发明制备的纳米抗体-四价铂体系在小鼠主要器官的积累
为了探究纳米抗体与四价铂的偶联物的组织分布情况以及聚乙二醇化修饰和纳米抗体四聚对药物分布的影响，将顺铂，纳米抗体-四价铂偶联物，聚乙二醇化纳米抗体 -四价铂偶联物和聚乙二醇化的多价纳米抗体-四价铂偶联物以每只小鼠40μg Pt的剂量给药，小鼠在注射一段时间后处死。摘取心脏，肝脏，脾脏，肺和肾脏等主要器官，用PBS冲洗两次，滤纸擦干后称重。将各组织切成小块，酸消化后采用ICP-MS测定器官中Pt含量。
如图15A所示，对比顺铂，纳米抗体-四价铂偶联物，聚乙二醇化纳米抗体-四价铂偶联物和聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物治疗组在注射12h后主要器官的 Pt积累量，可以看到纳米抗体-四价铂体系在肝肾中的积累均明显低于顺铂。说明了聚乙二醇化修饰降低了纳米抗体-四价铂体系在肝脏中的富集。而且从图15B中看出，聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物在注射小鼠的24h内，其在肝脏中的积累量没有显著变化，在肾脏中的量也逐渐下降。
8.本发明制备的纳米抗体-四价铂体系在肿瘤内的积累
按照40μg Pt/只鼠的剂量对EGFR+A431异种荷瘤的小鼠(每组平行n＝3)进行尾静脉给药。于注射后3h，6h，9h，12h，24h时处死小鼠。取出肿瘤，用冷PBS洗涤两次，在滤纸上擦干并将取出的肿瘤称重。将肿瘤组织切成小块，酸消化后用ICP-MS 测定Pt的含量。
比较不同铂药在肿瘤组织中的积累量，从实验结果图16来看，聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物治疗组的肿瘤组织铂含量最高。并且，聚乙二醇化纳米抗体-四价铂偶联物和聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物在肿瘤部位的药物积累随时间变化的趋势不同。这种趋势的差异可能与分子尺寸相关，也可能与纳米抗体铂与靶细胞的结合能力相关。
9.本发明制备的纳米抗体-四价铂体系的组织渗透能力
在本发明中，在mTGase的催化连接下产生了分子量差异较大的两种产物。其中分子量较大的聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物表现出了最长的血液循环半衰期，为药物能够保持长效发挥作用奠定了基础。然而，药物尺寸常常与其组织渗透能力相关联。纳米抗体铂的组织穿透性也是药物评价非常重要的一个评判标准。我们通过免疫荧光检测本发明中实施例的组织渗透性。将荧光素标记的纳米抗体，聚乙二醇化纳米抗体，聚乙二醇化的多价纳米抗体，以及他们的四价铂偶联物按照0.15μM Nb 的剂量注射于EGFR+A431荷瘤小鼠中。注射后6h处死小鼠，切下肿瘤并固定在4％多聚甲醛中。固定肿瘤后的下一步是使肿瘤在30％蔗糖溶液中浸泡过夜。将样品在低温恒温器中切成8μm厚的切片，按照产品protocol要求将样品与相应的抗体进行孵育。在具有10倍或20倍物镜的Zeiss LSM710Meta共聚焦显微镜下观察样品的荧光信号。
如图17所示，蓝色为细胞核(DAPI)，绿色荧光来自FITC标记的纳米抗体，红色荧光来自血管(Cy5)。可以看到，在所有的测试组中绿色荧光信号明显且均匀分散，表明纳米抗体-四价铂体系具备纳米抗体优异的组织渗透能力。而且，无论是偶联上小分子金属药物，还是对纳米抗体进行聚乙二醇化或多聚化，对纳米抗体靶向性和组织渗透均没有显著影响。
10.本发明制备的纳米抗体-四价铂体系在动物水平的治疗效果
将植有A431细胞异种移植瘤的小鼠随机分成5组(每组5只小鼠)。在肿瘤体积达到约100-200mm3之后，将顺铂，聚乙二醇化纳米抗体-四价铂偶联物，聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物(1-2mg Pt/kg体重)或PBS对小鼠进行尾静脉注射给药。所有药物在第0天，第4天和第8天进行注射。每天测量小鼠的体重和肿瘤体积。按照公式V＝lw2/2计算肿瘤体积(mm3)，其中l和w表示肿瘤的长度和宽度。抑制率按照以下公式计算：[1-(Vtf-Vti)/(Vpf-Vpi)]×100％。(Vtf和Vti分别代表治疗组起始和治疗后的肿瘤体积，Vpf和Vpi分别代表PBS组起始和治疗后的肿瘤体积)。
如图18A所示，相对于PBS对照组，顺铂，聚乙二醇化纳米抗体-四价铂偶联物，聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物对A431细胞异种移植瘤的抑制率分别是 30.32％，31.64％和63.78％。顺铂组和聚乙二醇化纳米抗体-四价铂偶联物组的治疗效果差异不显著，而聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物具有最显著的治疗效果。
另外图18B的实验结果显示，小鼠的体重变化也有所不同。顺铂治疗组小鼠的体重在后期明显下降，而聚乙二醇化纳米抗体-四价铂治疗组在治疗前期对小鼠体重产生轻微影响，后期没有显著影响。而聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物对小鼠的体重几乎没有影响。
11.使用聚乙二醇化多价纳米抗体四价铂偶联物治疗后的免疫组化分析
最后一次测量小鼠的肿瘤体积，动物模型治疗结束。24h后，将小鼠处死。摘除肿瘤组织和其他主要器官并用4％甲醛固定并包埋在石蜡中。然后将这些组织切成5μm 厚的切片。对肿瘤和其他主要器官进行TUNEL染色，观察细胞凋亡的情况。相关操作按照试剂盒要求进行。样品制备完成后采用Zeiss LSM 710倒置激光共焦扫描显微镜成像系统检测。
免疫组化分析实验结果如图19所示。该结果表明，相较于顺铂和聚乙二醇化纳米抗体-四价铂偶联物，聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物对肝肾等主要的器官的损伤较低。结合小鼠的体重变化情况(图18B)，说明聚乙二醇化多价纳米抗体四价铂偶联物对小鼠模型的肿瘤组织产生了较高的毒性，而只产生了较低得系统毒性，从而体现了纳米抗体的靶向性及多聚化降低了传统金属药物的毒副作用。
12.纳米抗体四价铂体系对肿瘤EGFR表达水平的影响
靶向EGFR的纳米抗体与EGFR的结合能够诱发抗体－受体复合物的细胞内在化，纳米抗体与EGFR的结合对表皮生长因子相关下游信号通路也会产生一定的干扰。为探究纳米抗体-四价铂体系对肿瘤细胞表面EGFR水平产生的影响，对EGFR在肿瘤部位的表达水平进行免疫组化分析和Western blot分析。
取治疗后肿瘤组织约500mg放入匀浆器中，加入250μL裂解液(使用前按试剂盒protocol加入蛋白酶抑制剂)进行研磨。收集的蛋白液于4℃离心收集上清(14000 rpm，15min)。提取的总蛋白通过BCA法定量(操作步骤参照产品protocol)。配制 8％SDS-PAGE用于蛋白电泳分离，电泳分离后通过湿法转膜(PVDF膜)将蛋白转移到膜上。通过EGFR抗体以及作为内参的Tubulin抗体及二抗孵育后，进行显影。
免疫组化结果如图20A所示，PBS对照组的实验结果显示，肿瘤组织整体细胞呈EGFR高表达状态。顺铂实验组肿瘤组织的EGFR水平变化较小，而纳米抗体铂组(聚乙二醇化的单价与多价纳米抗体四价铂偶联物)治疗后组织的EGFR水平有所降低。
Western blot分析结果如图20B所示，聚乙二醇化的单价与多价纳米抗体四价铂偶联物治疗组使肿瘤组织总体的EGFR水平降低，与免疫组化实验结果一致。
结合所有的实验结果，依照本发明提供的方法制备的纳米抗体-四价铂，聚乙二醇化纳米抗体-四价铂和聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物中，聚乙二醇化多价纳米抗体-四价铂偶联物显示出了更特别的性质，其具有优良的稳定性，肿瘤穿透力和靶向能力，而且较大的尺寸延长了循环时间，在抗肿瘤应用中发挥了良好的抑制肿瘤的作用的同时也降低了金属药物的系统毒性。
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