一种提高组氨酸发酵纯度的方法
阅读说明：本技术 一种提高组氨酸发酵纯度的方法 (Method for improving histidine fermentation purity ) 是由 刘佳 王海波 谢畅丰 于 2021-10-20 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物技术的发酵工程技术领域,具体涉及一种提高组氨酸发酵纯度的方法。它包括A、斜面活化培养,从冰箱取出保藏菌种的甘油管,均匀涂布斜面培养茄瓶进行活化,活化温度28-32℃,培养6-10h,形成菌落；B、种子过程控制,取50ml无菌水于步骤A的茄瓶,刮下菌落形成菌悬液,接入种子培养罐中的种子培养基中,培养温度28-32℃,流加氨水控制pH6.5-7.5,培养至种子液的OD650达到8-12；C、发酵过程控制,将步骤B的种子液接种量5-15％入发酵罐的发酵培养基中,控制温度28-32℃,流加氨水控制pH6.5-7.5,过程中控制溶氧20-50％。与现有组氨酸发酵技术相比,发酵放罐液中的组氨酸纯度提高13％以上,同时组氨酸的重量体积百分比也提高很多。(The invention belongs to the technical field of fermentation engineering of biotechnology, and particularly relates to a method for improving histidine fermentation purity. A, slant activation culture, namely taking a glycerol tube for preserving strains out of a refrigerator, uniformly coating a slant culture eggplant bottle for activation, and culturing for 6-10 hours at the activation temperature of 28-32 ℃ to form colonies; B. b, controlling a seed process, namely taking 50ml of sterile water to put into the eggplant bottle in the step A, scraping bacterial colonies to form bacterial suspension, inoculating the bacterial suspension into a seed culture medium in a seed culture tank, controlling the culture temperature to be 28-32 ℃, adding ammonia water in a flowing manner to control the pH to be 6.5-7.5, and culturing until the OD650 of a seed solution reaches 8-12; C. and C, controlling the fermentation process, namely adding 5-15% of the seed liquid inoculation amount in the step B into a fermentation culture medium in a fermentation tank, controlling the temperature to be 28-32 ℃, adding ammonia water in a flowing manner, controlling the pH to be 6.5-7.5, and controlling the dissolved oxygen to be 20-50% in the process. Compared with the prior histidine fermentation technology, the purity of histidine in the fermentation tank discharging liquid is improved by more than 13 percent, and the weight volume percentage of histidine is also improved greatly.)
技术领域
本发明属于生物技术的发酵工程技术领域，具体涉及一种提高组氨酸发酵纯度的方法。
背景技术
组氨酸作为20种氨基酸之一，被广泛应用于医药、食品添加剂、饲料等领域。目前国内发酵法生产组氨酸的制备方法已较为普及，多篇发明专利申请了有关菌种的基因工程改造和发酵应用，但大多还是实验研发阶段。而关于实际工业生产的发酵工程领域中，对组氨酸发酵工程工艺的相关研究内容还比较少。在现有技术方案中，组氨酸生产菌在工业应用上普遍存在发酵放罐液中组氨酸的含量较低、组氨酸的纯度较低，存在其他氨基酸导致提取后处理难度高问题。
发明内容
针对上述技术问题，本发明通过调整斜面活化培养、种子过程控制菌落、发酵过程控制的各种技术参以及流加补糖，控制发酵的溶氧水平达指定范围，从而达到提到组氨酸发酵纯度的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：一种提高组氨酸发酵纯度的方法，步骤为：
A、斜面活化培养，从冰箱取出保藏菌种的甘油管，均匀涂布斜面培养茄瓶进行活化，活化温度28-32℃，培养6-10h，形成菌落；
B、种子过程控制，取50ml无菌水于步骤A的茄瓶，刮下菌落形成菌悬液，接入种子培养罐中的种子培养基中，培养温度28-32℃，流加氨水控制pH6.5-7.5，培养至种子液的OD650达到8-12；OD650是指分光光度计650nm波长下的吸光度值，OD值即使用分光光度计测定种子液的吸光度，其大小表示种子液中菌体的多少，其数值越大表示菌体越多；过程中控制溶氧≥30％；
C、发酵过程控制，将步骤B的种子液接种量5-15％入发酵罐的发酵培养基中，控制温度28-32℃，流加氨水控制pH6.5-7.5，过程中控制溶氧20-50％；
所述的步骤C中，所述发酵培养基水解后还原糖下降至2-4％后，流加浓度为45-75％的蔗糖，调整蔗糖流速控制溶氧20-50％。即随菌体快速增长消耗所述发酵培养基，菲林试剂法检测随时检测还原糖的浓度。本发明中，所述的百分浓度均是原材料重量g/总培养基体积L*100％，即重量体积百分比。
进一步：在上述提高组氨酸发酵纯度的方法中，所述步骤B种子培养基配比，蔗糖20-40g/L，甘蔗糖蜜3.0-11.5g/L，玉米浆12-18g/L，酵母粉0.5-2.0g/L，硫酸铵2.0-5.0g/L，磷酸二氢钾0.5-2.0/L，硫酸镁0.1-0.5g/L，硫酸锰0.5-2.0mg/L，硫酸亚铁2-8mg/L，生物素0.1-0.5mg/L，硫胺素0.1-0.5mg/L，溶解于水。
所述步骤B种子培养基配比，蔗糖35g/L，甘蔗糖蜜7g/L，玉米浆18g/L，酵母粉2g/L，硫酸铵4g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰1mg/L，硫酸亚铁5mg/L，生物素0.1mg/L，硫胺素0.1mg/L，溶解于水。
所述步骤C的发酵培养基配比，蔗糖40-120g/L，甘蔗糖蜜3.0-11.5g/L，玉米浆12-18g/L，酵母粉0.5-2.0g/L，硫酸铵2.0-4.0g/L，磷酸二氢钾0.5-2.0g/L，硫酸镁0.1-0.5g/L，硫酸锰0.5-2.0mg/L，硫酸亚铁2-8mg/L，生物素0.1-0.5mg/L，硫胺素0.1-0.5mg/L，溶解于水。
所述步骤C的发酵培养基配比，蔗糖80g/L，甘蔗糖蜜7g/L，玉米浆18g/L，酵母粉2g/L，硫酸铵4g/L，磷酸二氢钾1g/，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰1mg/L，硫酸亚铁5mg/L，生物素0.2mg/L，硫胺素0.2mg/L，溶解于水。
优选的，所述步骤A斜面活化培养活化温度30℃，培养8h。所述步骤B种子过程控制中，所述培养温度30℃，流加氨水控制pH7.0，培养至种子液的OD650达到10。所述步骤C发酵过程控制中，种子液接种量10％入发罐，控制温度30℃，流加氨水控制pH7.0，发酵前10小时内，控制溶氧前期≥30％，之后控制溶氧20-30％。所述步骤C流加浓度蔗糖时，过程控制水解后还原糖下降至3％后开始流加浓度为60％的蔗糖，调整蔗糖流速控制溶氧20-30％。
与现有技术相比，本发明的一种提高组氨酸发酵纯度的方法，步骤为：A、斜面活化培养，从冰箱取出保藏菌种的甘油管，均匀涂布斜面培养茄瓶进行活化，活化温度28-32℃，培养6-10h，形成菌落；B、种子过程控制，取50ml无菌水于步骤A的茄瓶，刮下菌落形成菌悬液，接入种子培养罐中的种子培养基中，培养温度28-32℃，流加氨水控制pH6.5-7.5，培养至种子液的OD650达到8-12；OD650是指分光光度计650nm波长下的吸光度值，OD值即使用分光光度计测定种子液的吸光度，其大小表示种子液中菌体的多少，其数值越大表示菌体越多；过程中控制溶氧≥30％；C、发酵过程控制，将步骤B的种子液接种量5-15％入发酵罐的发酵培养基中，控制温度28-32℃，流加氨水控制pH6.5-7.5，过程中控制溶氧20-50％；尤其是所述的步骤C中，所述发酵培养基水解后还原糖下降至2-4％后，流加浓度为45-75％(重量体积百分比)的蔗糖，调整蔗糖流速控制溶氧20-50％。本发明正是控制菌体处于基础代谢生长状态的关键控制点，调整蔗糖流速控制溶氧20-50％，该数据参数是发明人经过反复试验，反复调整得来的，其技术效果明显，与现有工艺控制残糖在2-3％范围相比，发酵放罐液中的组氨酸纯度提高13％以上，同时组氨酸的重量体积百分比也提高很多。
具体实施方式
本下面将结合实施案例对本发明的内容作进一步的说明，实施案例中所提及的内容并非对本发明的限定，仅用于说明本发明，过程中各个原材料的选择可因地制宜而对结果并无实质性影响。
对比例1
种子培养基配比：蔗糖35g/L，甘蔗糖蜜7g/L，玉米浆18g/L，酵母粉2g/L，硫酸铵4g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰1mg/L，硫酸亚铁5mg/L，生物素0.1mg/L，硫胺素0.1mg/L，溶解于水。发酵培养基配比：蔗糖80g/L，甘蔗糖蜜7g/L，玉米浆18g/L，酵母粉2g/L，硫酸铵4g/L，磷酸二氢钾1g/，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰1mg/L，硫酸亚铁5mg/L，生物素0.2mg/L，硫胺素0.2mg/L，溶解于水。
斜面活化培养：从超低温冰箱取出保藏菌种的甘油管，均匀涂布斜面培养茄瓶进行活化，30℃培养8h。
种子过程控制：取50ml无菌水于茄瓶，轻轻刮下菌落形成菌悬液。接入种子培养罐中，培养温度30℃，流加氨水控制pH7.0，0h风量300L/h，转速150rpm，根据OD增长情况适当增加风量和转速，溶氧控制移种前调百，过程中控制溶氧≥30％。过程中监控OD增长，培养至种子液的OD650达到10。发酵过程控制：种子液接种量10％入发酵罐，控制温度30℃，流加氨水控制pH7.0，0h风量800L/h，转速300rpm，根据OD增长情况适当增加风量和转速，过程中内控制溶氧前期≥30％,(前期一般为发酵前10小时)，之后控制溶氧20-30％。补料过程控制：水解后还原糖下降至3％后开始流加60％的补糖，控制残糖2-3％。利用5L发酵罐发酵40-50h，经高效液相色谱法测定，产生组氨酸平均值17.2g/L，其组氨酸纯度平均值为83.5％。
实施例1
种子培养基配比：蔗糖35g/L，甘蔗糖蜜7g/L，玉米浆18g/L，酵母粉2g/L，硫酸铵4g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰1mg/L，硫酸亚铁5mg/L，生物素0.1mg/L，硫胺素0.1mg/L，溶解于水。发酵培养基配比：蔗糖80g/L，甘蔗糖蜜7g/L，玉米浆18g/L，酵母粉2g/L，硫酸铵4g/L，磷酸二氢钾1g/，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰1mg/L，硫酸亚铁5mg/L，生物素0.2mg/L，硫胺素0.2mg/L，溶解于水。
斜面活化培养：从超低温冰箱取出保藏菌种的甘油管，均匀涂布斜面培养茄瓶进行活化，30℃培养8h。
种子过程控制：取50ml无菌水于茄瓶，轻轻刮下菌落形成菌悬液。接入种子培养罐中，培养温度30℃，流加氨水控制pH7.0，0h风量300L/h，转速150rpm，根据OD增长情况适当增加风量和转速，溶氧控制移种前调百，过程中控制溶氧≥30％。过程中监控OD增长，培养至种子液的OD650达到10。
发酵过程控制：种子液接种量10％入发酵罐，控制温度30℃，流加氨水控制pH7.0，0h风量800L/h，转速300rpm，根据OD增长情况适当增加风量和转速，发酵0至10小时内,过程中控制溶氧前期≥30％，之后控制溶氧20-30％。
补料过程控制：水解后还原糖下降至3％后开始流加60％的补糖，调整补糖流速控制溶氧20-30％。
利用5L发酵罐发酵50-60h，经高效液相色谱法测定，产生组氨酸含量平均值19.2g/L，其组氨酸纯度平均值为94.6％。与即对比例1相比，分别提高了11.6％和13.3％。
上述仅为本发明较佳实施方式，在没有脱离本实用新构思前提下，任何显而易见组合替换均应落入本发明的保护范围之内。在本发明的精神和原则之内作任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求保护范围之内。
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