一种提高l-羟脯氨酸产量的发酵方法
阅读说明：本技术 一种提高l-羟脯氨酸产量的发酵方法 (Fermentation method for increasing L-hydroxyproline yield ) 是由 熊传波 岳明瑞 杨明贵 杨军 崔涛 于 2020-12-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提高L-羟脯氨酸产量的发酵方法,包括如下步骤：(1)将L-羟脯氨酸生产菌种的种子液接种至装有发酵培养基的灭菌发酵罐中进行发酵初始阶段；发酵条件：温度32-33℃,风量3-4L/min,搅拌转速200rpm,罐压0.02-0.04MPa；当菌种处于对数期时,将搅拌转速缓慢提高至540rpm；(2)当发酵液中的残糖降至0-0.1g/L时,进行发酵中后阶段；发酵条件：温度32-33℃,pH 7.0±0.1,转速750rpm,罐压0.02MPa,风量6-7L/min,200倍稀释发酵液的OD600达到0.6-0.7时,发酵结束。通过本发明方法能够提高L-羟脯氨酸发酵产量及糖酸转化率。(The invention discloses a fermentation method for improving the yield of L-hydroxyproline, which comprises the following steps: (1) inoculating the seed liquid of the L-hydroxyproline production strain into a sterilized fermentation tank filled with a fermentation culture medium for fermentation at an initial stage; fermentation conditions are as follows: the temperature is 32-33 ℃, the air volume is 3-4L/min, the stirring speed is 200rpm, and the tank pressure is 0.02-0.04 MPa; when the strain is in the logarithmic phase, slowly increasing the stirring speed to 540 rpm; (2) when the residual sugar in the fermentation liquor is reduced to 0-0.1g/L, performing the later stage in the fermentation; fermentation conditions are as follows: the temperature is 32-33 ℃, the pH is 7.0 +/-0.1, the rotating speed is 750rpm, the tank pressure is 0.02MPa, the air quantity is 6-7L/min, and when the OD600 of 200 times of diluted fermentation liquor reaches 0.6-0.7, the fermentation is finished. The method can improve the fermentation yield of the L-hydroxyproline and the conversion rate of the saccharic acid.)
技术领域
本发明涉及L-羟脯氨酸生产技术领域，具体涉及一种提高L-羟脯氨酸产量的发酵方法。
背景技术
羟脯氨酸(Hydroxyproline)是亚氨基酸之一，通常在第四位上带有羟基，但有时也在第3位上。由于有两个不对称的碳原子，所以有4种立体异构体。在动物胶和骨胶原中含有L-羟脯氨酸，自然界中不存在D-羟脯酸。L-别羟脯氨酸是从鬼笔鹅膏(AmanitaPhalloides)中得到的有毒的多肽鬼笔环肽(phalloidine)的组成成分。
一般的蛋白质不存在这种氨基酸。在自然界的羟脯氨酸的甲基衍生物中有左旋水苏碱(betonicine)、右旋水苏碱(turicine)和γ-羟古液酸(γ-hydroxyhygric acid)。在生物体内羟脯氨酸是由脯氨酸合成的，但不是以游离状态，而是在肽链中被羟基化。它的分解作用类似脯氨酸，但以带着羟基的状态进行。分子式：C5H9NO3分子量131.13。呈苦味中的独特甜味，能改善果汁饮料、清凉饮料等的风味的味质。有特殊风味，可作香原料。用途：增味剂、营养强化剂、香味料，主要用于果汁、清凉饮料、营养饮料等；用作生化试剂。
现有的羟脯氨酸生产方法有化学分解法和微生物发酵法两种。化学法是通过明胶、骨胶、干酪素、大豆表皮等蛋白质，用盐酸水解，用亚硝化法提取亚氨酸后经树脂层析后精制、结晶而成，得率约7.0％，并存在着原料来源受限制、生产成本高、污染环境等缺陷而难以实现工业化生产。
微生物发酵法具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点。随着对L-羟脯氨酸发酵法的深入研究，微生物发酵法已成为生产L-羟脯氨酸最主要的方法。根据相关报道，目前国内L-羟脯氨酸的发酵产量水平在50g/L左右，国际水平在70g/L左右，现有的L-羟脯氨酸发酵法仍存在产酸量低、糖酸转化率低的问题。因此，如何对L-羟脯氨酸的发酵工艺进行优化是目前亟需解决的问题。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种提高L-羟脯氨酸产量的发酵方法。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明的第一方面，提供一种提高L-羟脯氨酸产量的发酵方法，包括如下步骤：
(1)将L-羟脯氨酸生产菌种的种子液接种至装有发酵培养基的灭菌发酵罐中进行发酵初始阶段；发酵条件：温度32-33℃，风量3-4L/min，搅拌转速200rpm，罐压0.02-0.04MPa；当菌种处于对数期时，将搅拌转速缓慢提高至540rpm，并实时检测发酵液中糖的含量，当含糖量低于2g/L时，进行补糖，将发酵液中含糖量维持在1.9-2.1g/L；当100倍稀释发酵液的OD600达到0.400时，将风量调为4L/min，搅拌转速提高至600rpm，并停止补糖；
(2)当发酵液中的残糖降至0-0.1g/L时，进行发酵中后阶段；发酵的条件：温度32-33℃，pH 7.0±0.1，转速750rpm，罐压0.02MPa，风量6-7L/min，流加葡萄糖使发酵液中的残糖含量控制在0.05-0.1g/L；52-62h时，200倍稀释发酵液的OD600达到0.6-0.7时，发酵结束。
优选的，所述发酵培养基的成分为：葡萄糖20g/L、(NH4)2SO4 1g/L、酵母粉3g/L、柠檬酸2g/L、KH2PO4 5g/L、K2HPO4 5g/L、MgSO4·7H2O 1.5g/L、FeSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4·H2O 9mg/L、Co(NO3)2·6H2O 9.8mg/L、VB1 0.3mg/L、VB3 0.3mg/L、氨苄霉素100mg/L；pH7.0±0.1。
优选的，步骤(1)中，种子液的接种量为8％。
优选的，所述L-羟脯氨酸生产菌种的种子液是由L-羟脯氨酸生产菌种经一级种子瓶培养和二级种子罐培养得到。
优选的，一级种子瓶培养的培养基为LB液体培养基。
优选的，一级种子瓶中菌种培养至对数期后，将一级种子瓶中的菌液接种至二级种子罐进行培养，接种量为5-15％。
优选的，二级种子罐培养的培养基成分为：葡萄糖30g/L、(NH4)2SO4 1g/L、酵母粉6g/L、柠檬酸2g/L、KH2PO4 2.5g/L、K2HPO4 2.5g/L、MgSO4·7H2O 1g/L、MnSO4·H2O 9mg/L、ZnSO4 12.8mg/L、Co(NO3)2·6H2O 9.8mg/L、VB1 1mg/L、VB3 1mg/L、氨苄霉素100mg/L；pH7.0±0.1。
优选的，二级种子罐培养的条件为：温度32-33℃，pH7.0，风量3-4L/min，搅拌转速200rpm，罐压0.02-0.04MPa。
优选的，步骤(1)中，对发酵液进行补糖时，是通过蠕动泵向发酵液中流加葡萄糖溶液。
菌种在对数期时数量激增，需大量消耗葡萄糖以保证充足的能量进行分裂，此阶段发酵液中糖的含量急剧下降，需将糖控制在2g/L左右。
优选的，发酵时通过流加质量浓度为20-30％的氨水来控制pH。
本发明的第二方面，提供利用上述方法制备得到的L-羟脯氨酸。
本发明的有益效果：
1、本发明方法工艺简单、生产成本低、L-羟脯氨酸的产量及糖酸转化率有较大提高，特别适合用于工业化生产。
2、本发明通过厌氧催化发酵提高L-羟脯氨酸发酵产量及糖酸转化率，其中L-羟脯氨酸产量超过100g/L，糖酸转化率在30％以上，与现有技术相比，L-羟脯氨酸产率和糖酸转化率得到极大的提高。
3、本发明进一步优化了L-羟脯氨酸的发酵工艺，通过流加葡萄糖使发酵液中残糖含量控制在0-0.1g/L，既不会构成底物限制，又不会引起“葡萄糖效应”，菌种的生产能力得到最大限度的发挥。
4、本发明发酵方法可以通过发酵罐进行自动控制，工艺操作简便、设备要求低、发酵时间短、生产成本低、经济效益显著，特别适合工业化大规模生产。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分介绍的，目前现有的L-羟脯氨酸发酵法仍存在产酸量低、糖酸转化率低的问题，因此，仍需进一步技术攻关，以提高L-羟脯氨酸的发酵产率。
基于此，本发明提供了一种提高L-羟脯氨酸产率的发酵方法，将羟脯氨酸生产菌种接种至含有发酵培养基中进行发酵，得到L-羟脯氨酸。
培养条件的优化与否直接影响到代谢方式及代谢流量的变化，从而影响目的产物的产量。其中，发酵培养基的组成和配比对菌种的生长、L-羟脯氨酸的形成、产品的质量和产量等都有很大的影响。本发明对发酵培养基的组成进行了优化，优化后的发酵培养基的组成如下：
葡萄糖20g/L、(NH4)2SO41g/L、酵母粉3g/L、柠檬酸2g/L、KH2PO4 5g/L、K2HPO4 5g/L、MgSO4·7H2O 1.5g/L、FeSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4·H2O 9mg/L、Co(NO3)2·6H2O 9.8mg/L、VB1 0.3mg/L、VB3 0.3mg/L、氨苄霉素100mg/L(灭菌结束后加入)；pH 7.0±0.1。
本发明的发酵培养基中，选择KH2PO4和K2HPO4作为酸碱缓冲对，其作用相当重要，低pH下，菌种受负反馈调节的抑制，即产物过多抑制代谢活动，所以添加KH2PO4和K2HPO4使发酵培养基的pH维持稳定状态，有助于提高菌种的利用率；酵母粉和柠檬酸是必须有的组分，菌种为营养缺陷型工程菌，若无酵母粉和柠檬酸菌种不生长；本发明发现Fe2+、Mg2+、Mn2 +、Zn2+、Co2+、Cu2+是影响本发明所构建的工程菌菌体生长的重要离子，本发明用吸收光谱和薄层层析相结合的方法研究了Fe2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Co2+、Cu2+对工程菌生长及氨基酸合成的影响，发现适量浓度的Fe2+、Mg2+、Mn2+、Co2+可促进菌体生物量增加，总氨基酸合成量也增加，而后又通过正交实验确定了Fe2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、间的作用关系和各种微量元素用量；本发明的发酵培养基中，添加了VB1、VB3两种维生素，是因为生产菌种为工程菌，适量添加维生素会对工程菌生物量增加起到促进作用；本发明的发酵培养基中，添加了适量的柠檬酸，菌种柠檬酸合酶的酶活被人为降低，故通过添加适量的柠檬酸来保证菌体柠檬酸循环的正常进行，有足够的能量来保证羟脯氨酸的生物合成正常进行。
氨苄霉素抗性基因作为标记基因通过质粒导入菌体，氨苄霉素对大多数细菌有效，本发明研究发现，在发酵培养基中加入适量氨苄霉素后，发酵罐染菌几率接近0％，降低因操作失误而造成的染菌的可能性，同时也能起到筛选作用，因多次传代导致质粒丢失的工程菌无法继续存活、无法与产酸较高的工程菌争抢资源。
综上，本发明通过对发酵培养基组成和用量的优化，使之更有利于菌种的生长、L-羟脯氨酸的形成。
本发明还给出了发酵的关键工艺控制，包括：
采用分段供糖方式控制所述发酵的发酵液中的葡萄糖浓度。发酵初始阶段是指菌种在生长曲线上处于延滞期和对数期前中期的阶段，当菌种处于延滞期末期时，菌体数量增长不明显，此时即可定义为发酵初始阶段结束，维持初始条件：发酵温度32-33℃，风量3-4L/min，搅拌转速200rpm，罐压0.02-0.04MPa；上述初始条件是为了减少菌种处于延滞期的时间，通过研究得出在此条件下菌种能最快的进入对数期。
当菌种处于对数期时，将搅拌转速缓慢提高至540rpm，并实时检测发酵液中糖的含量，当含糖量低于2g/L时，使用蠕动泵缓慢补糖；含糖量下限值的确定是在不影响菌体数量增加的同时，为下一阶段更好的控制含糖量而确定的。
当100倍稀释发酵液的OD600达到0.400时，将风量调为4L/min，搅拌转速提高至600rpm；根据本工程菌的一步生长曲线，此时菌种应处于对数期末期至稳定期，此时提升转速是为了让培养基中的营养物质分配更加均衡，同时提高风量以提供充足的氧气，使菌体生物量增加。
当发酵液中的残糖降至0-0.1g/L时，开始发酵，发酵的条件为：温度32-33℃，pH7.0±0.1，转速750rpm，罐压0.02MPa，风量6-7L/min，流加葡萄糖，使发酵液中的残糖含量控制在0.05-0.1g/L；52-62h时，200倍稀释发酵液的OD600达到0.6-0.7时，发酵结束。上述参数能使工程菌的产酸能力最大化，这是最适合本工程菌的发酵方法。
发酵过程中，为保证反应的顺利进行，还包括补消泡剂、补氨水和补糖的步骤。补糖是通过补料罐，在蠕动泵控制流速的情况下补入发酵罐的。通过流加葡萄糖使发酵液中残糖含量控制在0.05-0.1g/L，既不会构成底物限制，又不会引起“葡萄糖效应”，菌种的生产能力得到最大限度的发挥。
补氨水是将一定浓度的氨水，例如质量浓度为20-30％的氨水通过蠕动泵控制流速流加到发酵罐中，使发酵液的pH维持在7.0，pH高了或低了都会影响产酸。
消泡剂则是根据发酵罐中的泡沫情况进行流加。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
酵母粉的型号为OXOIDLP0021。
本发明的发酵过程中相关指标的检测方法：
1.OD值测定：发酵液用蒸馏水稀释至1/50、1/100、1/200后，用分光光度计于600nm处测定OD值。
2.pH：酸度计测定。
3.溶氧：利用电极在线测定，溶氧以溶氧电极在空气中的溶氧水平设定为100％，以饱和亚硫酸钠溶液中的溶氧为0。
4.残糖含量、发酵液中糖含量：分别通过M100葡萄糖检测仪和滴定法进行测定。
5.L-羟脯氨酸含量：采用纸上层析方法。
本发明所用的微生物菌种保藏采用甘油管超低温保藏。发酵过程采用二级发酵罐发酵。本发明实验所用的发酵罐为35L发酵罐。
实施例1：一种提高L-羟脯氨酸产量的发酵方法
包括如下步骤：(1)将L-羟脯氨酸生产菌种的种子液接种按接种量为8％接种至装有发酵培养基的灭菌发酵罐中进行发酵初始阶段；发酵条件：温度32-33℃，风量3-4L/min，搅拌转速200rpm，罐压0.02-0.04MPa；当菌种处于对数期时，将搅拌转速缓慢提高至540rpm，并实时检测发酵液中糖的含量，当含糖量低于2g/L时，使用蠕动泵缓慢补糖，将发酵液中含糖量维持在1.9-2.1g/L；当100倍稀释发酵液的OD600达到0.400时，将风量调为4L/min，搅拌转速提高至600rpm，并停止补糖；
发酵培养基的成分为：葡萄糖20g/L、(NH4)2SO4 1g/L、酵母粉3g/L、柠檬酸2g/L、KH2PO4 5g/L、K2HPO4 5g/L、MgSO4·7H2O 1.5g/L、FeSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4·H2O 9mg/L、Co(NO3)2·6H2O 9.8mg/L、VB1 0.3mg/L、VB3 0.3mg/L、氨苄霉素100mg/L(灭菌结束后加入)；pH 7.0±0.1；
(2)当发酵液中的残糖降至0-0.1g/L时，进行发酵中后阶段；发酵的条件：温度32-33℃，pH 7.0，转速750rpm，罐压0.02MPa，风量6-7L/min，流加葡萄糖使发酵液中的残糖含量控制在0.05-0.1g/L；48h后，发酵液中糖的含量会较难控制，且羟脯氨酸产酸达到80g/L以上；62h时，200倍稀释发酵液的OD600达到0.7时，发酵结束；63h开始放罐、杀罐。
所述L-羟脯氨酸生产菌种的种子液是由L-羟脯氨酸生产菌种经一级种子瓶培养和二级种子罐培养得到。一级种子瓶中菌种培养至对数期后(种子液培养10h左右，50倍稀释的种子液OD600nm在0.300-0.330左右)，将一级种子瓶中的菌液接种至二级种子罐进行培养，接种量为5-15％。
一级种子瓶培养的培养基为LB液体培养基；二级种子罐培养的培养基成分为：葡萄糖30g/L、(NH4)2SO4 1g/L、酵母粉6g/L、柠檬酸2g/L、KH2PO4 2.5g/L、K2HPO4 2.5g/L、MgSO4·7H2O 1g/L、MnSO4·H2O 9mg/L、ZnSO4 12.8mg/L、Co(NO3)2·6H2O 9.8mg/L、VB1 1mg/L、VB3 1mg/L、氨苄霉素100mg/L(灭菌结束后加入)；pH 7.0±0.1。
二级种子罐培养的条件为：温度32-33℃，pH7.0，风量3-4L/min，搅拌转速200rpm，罐压0.02-0.04MPa。
在发酵过程中，通过蠕动泵流加质量浓度为25％的氨水，使发酵液的pH维持在7.0左右；并根据发酵罐中的泡沫情况，流加消泡剂进行消泡处理。
经检测发现，采用本实施例的发酵工艺，放罐体积22.92L，产羟脯氨酸2476g，产酸量108g/L，实际耗糖量6112g，杀后含糖量96g/L，糖酸转化率：(96*22.92)/6112*100％＝36％。
实施例2：一种提高L-羟脯氨酸产量的发酵方法
包括如下步骤：
(1)将L-羟脯氨酸生产菌种的种子液接种按接种量为8％接种至装有发酵培养基的灭菌发酵罐中进行发酵初始阶段；发酵条件：温度32-33℃，风量3-4L/min，搅拌转速200rpm，罐压0.02-0.04MPa；当菌种处于对数期时，将搅拌转速缓慢提高至540rpm，并实时检测发酵液中糖的含量，当含糖量低于2g/L时，使用蠕动泵缓慢补糖，将发酵液中含糖量维持在1.9-2.1g/L；当100倍稀释发酵液的OD600达到0.400时，将风量调为4L/min，搅拌转速提高至600rpm，并停止补糖；
发酵培养基的成分为：葡萄糖20g/L、(NH4)2SO4 1g/L、酵母粉3g/L、柠檬酸2g/L、KH2PO4 5g/L、K2HPO4 5g/L、MgSO4·7H2O 1.5g/L、FeSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4·H2O 9mg/L、Co(NO3)2·6H2O 9.8mg/L、VB1 0.3mg/L、VB3 0.3mg/L、氨苄霉素100mg/L(灭菌结束后加入)；pH 7.0±0.1；
(2)当发酵液中的残糖降至0-0.1g/L时，进行发酵中后阶段；发酵的条件：温度32-33℃，pH 7.0，转速750rpm，罐压0.02MPa，风量6-7L/min，流加葡萄糖使发酵液中的残糖含量控制在0.05-0.1g/L，38h时，发酵液中葡萄糖含量为0.11g/L，停止补糖；40h时，发酵液中葡萄糖含量下降，重新开始补糖；52h后，发酵液中糖的含量较难控制，且羟脯氨酸产酸达到80g/L以上；62h时，200倍稀释发酵液的OD600达到0.66时，发酵结束；63h开始放罐、杀罐。
所述L-羟脯氨酸生产菌种的种子液是由L-羟脯氨酸生产菌种经一级种子瓶培养和二级种子罐培养得到。一级种子瓶中菌种培养至对数期后(种子液培养10h左右，50倍稀释的种子液OD600nm在0.300-0.330左右)，将一级种子瓶中的菌液接种至二级种子罐进行培养，接种量为5-15％。
一级种子瓶培养的培养基为LB液体培养基；二级种子罐培养的培养基成分为：葡萄糖30g/L、(NH4)2SO4 1g/L、酵母粉6g/L、柠檬酸2g/L、KH2PO4 2.5g/L、K2HPO4 2.5g/L、MgSO4·7H2O 1g/L、MnSO4·H2O 9mg/L、ZnSO4 12.8mg/L、Co(NO3)2·6H2O 9.8mg/L、VB1 1mg/L、VB3 1mg/L、氨苄霉素100mg/L(灭菌结束后加入)；pH 7.0±0.1。
二级种子罐培养的条件为：温度32-33℃，pH7.0，风量3-4L/min，搅拌转速200rpm，罐压0.02-0.04MPa。
在发酵过程中，通过蠕动泵流加质量浓度为25％的氨水，使发酵液的pH维持在7.0左右；并根据发酵罐中的泡沫情况，流加消泡剂进行消泡处理。
经检测发现，采用本实施例的发酵工艺，放罐体积22.7L，产羟脯氨酸2338g，产酸量103.5g/L，实际耗糖量6732g，杀后含糖量91.15g/L，糖酸转化率：(91.15*22.7)/6732*100％＝30.7％。
对比例1
与实施例1相比，步骤(2)中，发酵中后阶段的发酵条件不进行残糖含量控制。结果与实施例1相比，耗糖量增加15％左右，产酸下降20％左右，其他次级代谢产物增加，严重增加后期提取的难度。
对比例2
与实施例1相比，改变发酵培养基的成分，发酵培养基的成分中不含Co(NO3)2·6H2O、VB1和VB3。结果在发酵罐中，20小时时OD600还达不到0.400，菌体数量不够，后期几乎不产酸。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。