阅读说明：本技术 一种同时制备d-脯氨酸和l-1-吡咯啉-5-羧酸的生物法 (Biological method for simultaneously preparing D-proline and L-1-pyrroline-5-carboxylic acid ) 是由 夏仕文 张凡凡 谢永芳 于 2020-03-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种同时制备D-脯氨酸和L-1-吡咯啉-5-羧酸的生物法。该方法以解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-40为发酵菌株,DL-脯氨酸为发酵前体。该菌株首先利用DL-脯氨酸中的部分L-脯氨酸生长并诱导产生L-脯氨酸脱氢酶,剩余L-脯氨酸在L-脯氨酸脱氢酶作用下转化为L-1-吡咯啉-5-羧酸,D-脯氨酸完全保留。发酵液中的细胞不经分离,直接或分批添加DL-脯氨酸,利用胞内L-脯氨酸脱氢酶将其中的L-脯氨酸转化为L-1-吡咯啉-5-羧酸。采用本发明中的发酵/转化级联方式,发酵液中D-脯氨酸浓度达到20g/L,ee>99％,发酵液中L-1-吡咯啉-5-羧酸浓度达到16g/L,产率达到40％。本发明提供的方法工艺简单,环境友好,适合D-脯氨酸和L-1-吡咯啉-5-羧酸的工业化生产。(The invention discloses a biological method for simultaneously preparing D-proline and L-1-pyrroline-5-carboxylic acid, which takes lysine bacillus xylolyticus XX-40 as a fermentation strain and D L-proline as a fermentation precursor.A strain firstly utilizes part of L1-proline in D L0-proline to grow and induce to generate L-proline dehydrogenase, the rest L-proline is converted into 855-1-pyrroline-5-carboxylic acid under the action of L-proline dehydrogenase, the D-proline is completely reserved, cells in fermentation liquor are not separated, D L-proline is directly or added in batches, intracellular L-proline dehydrogenase is utilized to convert L-proline in the D-proline into L-1-pyrroline-5-carboxylic acid, the fermentation/conversion cascade mode provided by the invention is adopted, the concentration of the D-proline in the fermentation liquor reaches 20 g/L, the concentration of the E48-1-pyrroline-5-carboxylic acid in the fermentation liquor reaches 16 g/L, the yield reaches 40%, the method is suitable for industrial production of D-proline, and the environment is friendly to produce D-1-pyrroline-5-carboxylic acid.)

一种同时制备D-脯氨酸和L-1-吡咯啉-5-羧酸的生物法

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体地说，涉及一种同时制备D-脯氨酸和L-1-吡咯啉-5-羧酸的生物法。

背景技术

作为一种重要的五元环非蛋白源氨基酸，D-脯氨酸(D-Proline)是合成多种具有光学活性的吡咯烷衍生物如血清淀粉样P成分(SAP)消耗剂(CN 108368095A)、治疗偏头痛药物依来曲普坦(Eletriptan)的关键手性中间体。

D-脯氨酸的制备方法主要包括化学法和生物法。化学法包括不对称合成法和不对称转换法。

不对称合成法(CN 107827802A)以吡咯烷-2-甲醛为原料，不对称还原为D-吡咯烷-2-甲醇，然后氧化为D-脯氨酸。该法采用昂贵的原料和手性金属催化剂，D-脯氨酸的ee值不高。不对称转换法以L-脯氨酸为原料，正丁醛为催化剂，在正丁酸溶剂中，与L-酒石酸反应制备D-脯氨酸·氨酸酒石酸盐，然后在甲醇中用氨水处理得到D-脯氨酸。该法是目前生产D-脯氨酸的工业化方法，虽然收率和ee值高，但存在生产成本高，环境污染大的缺点。

生物法主要采用生物降解法。日本协和发酵(JP 95-289275)以DL-脯氨酸为原料，50g/L假丝酵母PRD-234菌株利用和同化L-脯氨酸，发酵液中D-脯氨酸浓度达到50g/L，ee99.5％，收率47％。该生物法的缺点是L-脯氨酸只是作为细胞生长的碳氮源，最终转化为二氧化碳，不能循环使用，导致D-脯氨酸的制备成本较高。

发明内容

本发明为解决现有技术中存在的问题，提供一种同时制备D-脯氨酸和L-1-吡咯啉-5-羧酸的生物法。

本发明的技术路线如下：

本发明中的解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No.M2015520。

鉴于此，本发明采用的技术方案是：一种同时制备D-脯氨酸和L-1-吡咯啉-5-羧酸的生物法，包括解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2在种子培养基中培养制得种子液，然后将种子液接种到发酵培养基中，摇床振荡进行发酵，所述发酵培养基以DL-脯氨酸作为碳氮源。DL-脯氨酸中的L-脯氨酸作为解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2生长的碳氮源，同时诱导解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2产生L-脯氨酸脱氢酶。

当所述发酵培养基中的L-脯氨酸完全消耗时，再次添加DL-脯氨酸，进行微生物转化。

由此，本发明的具体步骤包括：

(1)解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2发酵。解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2在种子培养基中，30℃下摇床振荡(180rpm)培养48小时，制得种子液。种子培养基组成为：3g/L牛肉膏、5g/L酵母膏、5g/L氯化钠，pH6.0。以10％接种量将种子液接入发酵培养基中，30℃下摇床振荡(180rpm)发酵48～72h。发酵培养基组成为：3g/L牛肉膏、5g/L酵母膏、5g/L氯化钠，10～20g/L DL-脯氨酸，pH6.0。

优选地，发酵培养基中DL-脯氨酸的浓度为20g/L，发酵时间为72h。

(2)微生物转化。发酵液中的L-脯氨酸完全消耗时添加10～20g/LDL-脯氨酸，继续转化48～96h直至L-脯氨酸消耗完全。

优选地，DL-脯氨酸的添加浓度为20g/L，分两批次添加，每次添加10g/L，转化96h。

发酵和转化过程中D-脯氨酸、L-脯氨酸、L-1-吡咯啉-5-羧酸的浓度采用柱前手性衍生-高效液相色谱检测。

柱前手性衍生-高效液相色谱条件为：发酵液离心后上清液中加入4g/L三乙胺/乙腈溶液和2g/L 2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖异硫氰酸酯(GITC)/乙腈溶液，30℃下水浴加热20min。离心，采用HPLC分离上清液中的D-脯氨酸和L-脯氨酸的衍生物以及L-1-吡咯啉-5-羧酸。根据校正曲线计算浓度。色谱柱：C18柱；流动相：0.1％三氟乙酸水溶液/甲醇(51:49，v/v)，pH 2.5；流速：1.0ml/min；检测波长：254nm；柱温：25℃。

与现有的D-脯氨酸生物制备法相比，本发明提出的生物法具有以下优点：1)工艺简单。细胞发酵阶段，DL-脯氨酸中的L-脯氨酸既作为细胞生长的碳氮源并诱导细胞产L-脯氨酸脱氢酶。同时，L-脯氨酸在L-脯氨酸脱氢酶作用下转化为L-1-吡咯啉-5-羧酸。转化阶段，L-脯氨酸在L-脯氨酸脱氢酶作用下转化为L-1-吡咯啉-5-羧酸。无论是发酵或是转化阶段，D-脯氨酸完全保留。发酵和转化的级联，使得发酵阶段产生的细胞勿需分离，发酵和转化在同一体系中进行。2)成本低廉。本发明可同时制备D-脯氨酸和L-1-吡咯啉-5-羧酸。L-1-吡咯啉-5-羧酸可经化学催化还原为L-脯氨酸，然后化学或生物消旋为DL-脯氨酸，从而实现L-1-吡咯啉-5-羧酸的循环利用。3)采用本发明中的发酵/转化级联方式，发酵液中D-脯氨酸浓度达到20g/L，ee达到99％以上，发酵液中L-1-吡咯啉-5-羧酸浓度达到16g/L，产率达到40％。

附图说明

图1实施例3中D-脯氨酸和L-脯氨酸衍生物以及L-1-吡咯啉-5-羧酸的柱前手性衍生-HPLC图谱，D-脯氨酸衍生物(D-Pro)和L-脯氨酸衍生物(L-Pro)的保留时间分别为17.8min、15.3min，L-1-吡咯啉-5-羧酸(P5C)的保留时间为12.7min。

图2实施例5中D-脯氨酸和L-脯氨酸衍生物以及L-1-吡咯啉-5-羧酸的柱前手性衍生-HPLC图谱，D-脯氨酸衍生物(D-Pro)和L-脯氨酸衍生物(L-Pro)的保留时间分别为17.9min、15.4min，L-1-吡咯啉-5-羧酸的保留时间为12.8min。

具体实施方式

以下所述实施例仅为本发明构思下的基本说明，根据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均属于本发明保护的范围。

实施例1：解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2种子液制备

解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2在种子培养基中，30℃下摇床振荡(180rpm)培养48小时，制得种子液。种子培养基组成为：3g/L牛肉膏、5g/L酵母膏、5g/L氯化钠，pH6.0。

实施例2：解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2发酵

以10％接种量将种子液接入200mL发酵培养基中，30℃下摇床振荡(180rpm)发酵培养48小时。发酵培养基组成为：3g/L牛肉膏、5g/L酵母膏、5g/L氯化钠，10g/L DL-脯氨酸，pH6.0。发酵液中D-脯氨酸的ee值为99.4％，L-1-吡咯啉-5-羧酸浓度为3.5g/L，产率36％(以DL-脯氨酸投料量计算)。

实施例3：解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2发酵

以10％接种量将种子液接入200mL发酵培养基中，30℃下摇床振荡(180rpm)发酵培养72小时。发酵培养基组成为：3g/L牛肉膏、5g/L酵母膏、5g/L氯化钠，20g/L DL-脯氨酸，pH6.0。发酵液中D-脯氨酸的ee值为99.1％，L-1-吡咯啉-5-羧酸浓度为6.4g/L，产率33％(以DL-脯氨酸投料量计算)。

实施例4：微生物转化

以10％接种量将种子液接入200mL发酵培养基中，30℃下摇床振荡(180rpm)发酵培养72小时。发酵培养基组成为：3g/L牛肉膏、5g/L酵母膏、5g/L氯化钠，20g/L DL-脯氨酸，pH6.0。发酵液中添加2g DL-脯氨酸(10g/L发酵液)，30℃下摇床振荡(180rpm)转化48h。发酵液中D-脯氨酸的ee值为99.4％，L-1-吡咯啉-5-羧酸浓度为11.2g/L，产率38％(以DL-脯氨酸投料量计算)。

实施例5：微生物转化

以10％接种量将种子液接入200mL发酵培养基中，30℃下摇床振荡(180rpm)发酵培养72小时。发酵培养基组成为：3g/L牛肉膏、5g/L酵母膏、5g/L氯化钠，20g/L DL-脯氨酸，pH6.0。发酵液中添加2g DL-脯氨酸(10g/L发酵液)，30℃下摇床振荡(180rpm)转化48h。发酵液中补加2g DL-脯氨酸(10g/L发酵液)，30℃下摇床振荡(180rpm)继续转化48h。发酵液中D-脯氨酸的ee值为99.0％，L-1-吡咯啉-5-羧酸浓度为16.2g/L，产率41％(以DL-脯氨酸投料量计算)。

实施例6：其它发酵条件研究

接种和其它培养条件与实施例2相同，发酵培养基中DL-脯氨酸浓度为30g/L，发酵时间96h。发酵液中D-脯氨酸的ee值为74.7％，L-1-吡咯啉-5-羧酸浓度为9.2g/L，产率31％(以DL-脯氨酸投料量计算)。

接种和其它培养条件与实施例2相同，发酵培养基中DL-脯氨酸浓度为40g/L，发酵时间120h。发酵液中D-脯氨酸的ee值为48.9％，L-1-吡咯啉-5-羧酸浓度为9.5g/L，产率21％(以DL-脯氨酸投料量计算)。

实施例7：其它微生物转化条件研究

接种和培养条件与实施例4相同。发酵液中添加4g DL-脯氨酸(20g/L发酵液)，30℃下摇床振荡(180rpm)转化96h。发酵液中D-脯氨酸的ee值为67.3％，L-1-吡咯啉-5-羧酸浓度为12.4g/L，产率32％(以DL-脯氨酸投料量计算)。