L-塔格糖的合成方法
阅读说明：本技术 L-塔格糖的合成方法 (Synthetic method of L-tagatose ) 是由 张新帅 朱闰婕 李咏欣 于 2021-09-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了L-塔格糖的合成方法,将半乳糖醇在氧化酶GatDH以及激酶TgK联合作用下转化成L-塔格糖-6-磷酸,然后利用磷酸水解酶APase去磷酸得到L-塔格糖；或者D-半乳糖通过还原酶aldR还原成半乳糖醇,然后半乳糖醇通过氧化酶GatDH可转化成L-塔格糖。本发明采用廉价大宗的D-半乳糖或半乳糖醇作为原料,利用多个酶连续转化得到昂贵的L-塔格糖。该制备方案具有多方面的工业应用优势,使用原料便宜、制备路线短、反应条件简单且废物排放低；以上这些特点都很好的符合了当今绿色工业生产的基本要求。(The invention discloses a synthesis method of L-tagatose, which comprises the steps of converting galactitol into L-tagatose-6-phosphate under the combined action of oxidase GatDH and kinase TgK, and then dephosphorizing by using phosphohydrolase APase to obtain L-tagatose; or D-galactose is reduced to galactitol by reductase aldR, and then the galactitol is converted to L-tagatose by oxidase GatDH. The invention adopts cheap bulk D-galactose or galactitol as raw material, and obtains expensive L-tagatose by continuous conversion of a plurality of enzymes. The preparation scheme has the advantages of various industrial applications, cheap used raw materials, short preparation route, simple reaction conditions and low waste discharge; the characteristics well meet the basic requirements of the current green industrial production.)
技术领域
本发明属于生物酶法合成领域，具体涉及L-塔格糖的合成方法。
背景技术
L-塔格糖(L-tagatose)是自然界中存在的一种稀有糖，其也是一种低热量的功能性甜味剂，更是多种洗涤剂、化妆品以及药物的添加剂。与此同时，L-塔格糖也是半乳糖苷酶抑制剂(L-deoxygalactonojirimycin)合成的原料，在癌症的化疗方面也有其特殊的作用。然而，其高昂的价格限制了推广应用(国际知名的糖销售公司Carbosynth上的价格为：L-塔格糖￥20,000/克)。
迄今报道的L-塔格糖的制备有多种方法，但都存在某些缺陷而导致其无法廉价、大规模生产应用。
在化学制备路线中，L-塔格糖的合成需要经历多步的羟基保护、脱保护，这不仅导致其制备路线过长而整体收率太低，同时由于制备过程中的手性消旋问题将极大的困扰后期产品的纯化。
发酵生产L-塔格糖则由于产物浓度及纯度都比较低，导致最终产品纯化成本太高，而无法有效规模化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供L-塔格糖的合成方法，通过多级酶联催化实现了从廉价的半乳糖醇或D-半乳糖到L-塔格糖的直接转化，该制备路线短,反应条件简单，转化率高，所以无论是在生产成本以及环境保护方面都具有显著的优势。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
L-塔格糖的合成方法，包括以下步骤：
(1)取半乳糖醇与三磷酸腺苷二钠盐ATP、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸单钠盐、镁盐和钾盐混合，调节体系pH值为7.0-8.5(反应过程中维持该pH值范围)，加入半乳糖醇脱氢酶(GatDH)、己酮糖激酶(TgK)，室温下反应4-10小时，然后加入草酸钡，搅拌溶解后加入无水乙醇混合沉淀L-塔格糖-6-磷酸，离心收集白色固体沉淀；白色固体沉淀复溶除去Ba2+离子，并进一步纯化后得到L-塔格糖-6-磷酸；
(2)取L-塔格糖-6-磷酸，加入磷酸水解酶(APase)，20-30℃反应2-5小时生成L-塔格糖；
优选地，步骤(1)中还可以同时加入乳酸脱氢酶(LDH)、乙酸激酶(AcK)、丙酮酸钠，和乙酸磷酸溶液，利用乳酸脱氢酶(LDH)将NADH转化成NAD+，乙酸激酶(AcK)将ADP再生成ATP，从而降低辅酶和ATP的用量；
其中，半乳糖醇脱氢酶(GatDH)、己酮糖激酶(TgK)、乳酸脱氢酶(LDH)与乙酸激酶(AcK)的酶活比为2:(3-5):(1-3):(3-8)，优选2:4:1.5:5。
其中，半乳糖醇与丙酮酸钠的摩尔比为(0.90-1.15):1；其他的几种原料，或者是酶的底物，或者是酶起活性所需盐类，其所需用量较少；
步骤(1)所述的白色固体沉淀复溶除去Ba2+离子，是将白色固体沉淀溶解在pH值1.0的Tris缓冲溶液中，加入无水硫酸钠与Ba2+离子反应，生成白色硫酸钡沉淀，过滤除去；
步骤(1)所述的进一步纯化，是将除去Ba2+离子后的上清液调pH值至中性，上样阴离子树酯交换柱，用梯度浓度碳酸氢氨水溶液(0-1N)洗脱分离得到L-塔格糖-6-磷酸。
L-塔格糖的合成方法，包括以下步骤：
取D-半乳糖和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐(NADH)混合，调节溶液pH值为6.5～8.5，加入D-半乳糖还原酶(aldR)和半乳糖醇脱氢酶(GatDH,EC 1.1.1.406)，20-27℃反应4-10小时，生成L-塔格糖；
本发明所使用的D-半乳糖还原酶(aldR)，其野生型(Uniprot ID:A0A2S9ZVX5,EC1.1.1.21)来源于Rhodotorula toruloides，野生型辅酶是NADPH，通过本发明定点改造后，该酶能有效利用NADH，突变位点是：K247W，S248L，R253M，其改造后的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。
所述D-半乳糖还原酶与半乳糖醇脱氢酶的活力比为1:(2.5-4.0)。
上述两种路线中，所述反应(对于路线一是指其步骤(2)中的反应)完成后，除去或回收酶，反应液过阴离子交换树脂除杂，然后除盐、浓缩、结晶，得到L-塔格糖；
所述的除盐，可以采用现有技术方法，比如G25尺寸排阻柱脱盐，或渗透膜除盐。
所述的酶是液体酶或固定化酶；
若采用液体酶，则反应后调节反应体系pH值至强酸性，沉淀蛋白，并离心除去；
若采用固定化酶，则反应后过滤回收。
优选地，所述的反应物加入到三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)、羟乙基哌嗪乙硫磺酸(Hepes)缓冲液或3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲液中反应；磷酸盐缓冲体系不宜在此处使用，会导致酶的反应活性很低。
所述的固定化酶，由以下步骤制得：
将所需的酶混合或单独溶解在50mM pH 8.0的磷酸钾溶液中，随后加入40mM苯氧乙酸以及LX-1000EP环氧树脂至缓冲液，室温搅拌5小时后过滤出固定化酶，最后用清水以及25mM pH 8.0磷酸缓冲液各洗涤三次后低温干燥待用；
固定化的aldR与GatDH混合酶具有对应液体酶的70-85％的活性。固定化Apase活性是对应液体酶的85-94％。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明采用市面上廉价、大宗的D-半乳糖或半乳糖醇作为原料，利用多个酶连续转化得到昂贵的L-塔格糖。该制备方案具有多方面的工业应用优势，使用原料便宜、制备路线短、反应条件简单且废物排放低；以上这些特点都很好的符合了当今绿色工业生产的基本要求。
2、本发明一条路线以廉价的半乳糖醇(￥1200/kg,aladdin试剂网)作为原料，通过耦合球形红杆菌体内的一个半乳糖醇脱氢酶(GatDH,EC 1.1.1.406)与丙酸杆菌的己酮糖激酶(TgK,EC 2.7.1.209)高收率转化成L-塔格糖-6-磷酸，然后在磷酸水解酶(APase,EC3.1.3.1)作用下脱磷酸得到L-塔格糖；该反应中通过引入辅酶NAD+再生酶(LDH,EC1.1.1.27)以及ATP再生酶(AcK,EC 2.7.2.1)可有效再生辅酶，从而显著减少其用量。
3、本发明的另外一条制备路线，以D-半乳糖为原料，耦合D-半乳糖还原酶(aldR)与球形红杆菌体内的一个半乳糖醇脱氢酶(GatDH,EC 1.1.1.406)，可将D-半乳糖直接转化成L-塔格糖，该反应采用D-半乳糖还原酶(aldR,EC 1.1.1.21)，利用NADH作为辅酶生成NAD+(aldR天然酶的辅酶是NADPH)，而脱氢酶GatDH则又可将NAD+还原成NADH，从而有效实现辅酶在两步反应中的循环使用，从而只需加入催化剂量的辅酶；该方案简化了工艺，同时有效提高两步的转化率。
附图说明
图1是L-塔格糖的HPLC谱图。
图2是L-塔格糖的1H-NMR谱图。
图3是酶的SDS-PAGE凝胶检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明所涉及的有关酶的信息如下：
半乳糖醇脱氢酶(GatDH)：来源于类球红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)(PDB:2WDZ,EC 1.1.1.406)，其氨基酸和DNA序列分别如SEQ.ID.NO.1和NO.7所示；
乳酸脱氢酶(LDH)：来源于放射根瘤菌(Agrobacterium fabrum)(Uniprot ID:A9CFS1,EC 1.1.1.27)，其氨基酸和DNA序列分别如SEQ.ID.NO.2和NO.8所示；
己酮糖激酶(TgK)：来源于丙酸杆菌(Propionibacterium namnetense)(UniprotID:F9NVE9,EC 2.7.1.209)，其氨基酸和DNA序列分别如SEQ.ID.NO.3和NO.9所示；
乙酸激酶(AcK)：来源于大肠杆菌(E.coli)(Uniprot ID:P0A6A3,EC 2.7.2.1)，其氨基酸和DNA序列分别如SEQ.ID.NO.4和NO.10所示；
碱性磷酸水解酶(APase)：来源于铜绿色假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(Uniprot ID:P35482,EC 3.1.3.1)，其氨基酸和DNA序列分别如SEQ.ID.NO.5和NO.11所示。
实施例1：乙酸磷酸水溶液的制备
将65ml磷酸(85％，2.0mol)溶解到500ml的乙酸乙酯中，然后冷却到0℃；往该溶液中缓慢滴加190ml冷却的醋酐(2.0mol)。上述混合液在0℃搅拌反应8小时，倒入含500ml水、250克冰以及64克碳酸氢钠的3升反应瓶。混合液继续在低温搅拌直到无气泡产生。上层乙酸乙酯相分离后扔掉，剩下的水相pH值调到3后用1.0L、500mL乙酸乙酯萃取两次除去大部分残余的乙酸。最后用氢氧化纳将含乙酸磷酸的水溶液pH调节至中性备用，通过酶活测试证明得到600ml 1.1N的乙酸磷酸水溶液。
实施例2：以半乳糖醇作为原料，制备L-塔格糖
(1)以半乳糖醇作为原料，液体酶(GatDH、TgK)制备L-塔格糖-6-磷酸
在1L 50mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中先后加入27.3克半乳糖醇(150mM)，17.6克丙酮酸钠(160mM)、2.2克三磷酸腺苷二钠盐ATP(4mM)、1.38克烟酰胺腺嘌呤二核苷酸单钠盐(2mM)、165ml乙酸磷酸溶液(180mM)、2.8克氯化镁(30mM)、1.5克氯化钾(20mM)；待pH值调节到8.0后，加入半乳糖醇脱氢酶GatDH 2000U、己酮糖激酶TgK4000U、乳酸脱氢酶LDH 1500U以及乙酸激酶AcK 5000U启动反应；在反应过程中添加酸碱维持体系pH 7.0-8.5之间，室温缓慢搅拌8小时后，往反应液中加入38.2克草酸钡(150mmol)，搅拌溶解后与两倍体积的无水乙醇混合沉淀L-塔格糖-6-磷酸。离心收集该白色固体，然后缓慢溶解在pH 1.0的Tris缓冲溶液中，待溶清后加入21.2克无水硫酸钠(150mmol)除溶液中的Ba2+离子，此时白色沉淀即为硫酸钡；随后过滤除去硫酸钡并将上清液pH用NaOH水溶液调至7.0，上样D201阴离子树酯交换柱(晶祥化工)并用梯度(0-1N)碳酸氢氨水溶液洗脱分离得到39克L-塔格糖-6-磷酸粗品(收率98％)。
(2)用固定化的磷酸水解酶(APase)水解L-塔格糖-6-磷酸得L-塔格糖
将26克L-塔格糖-6-磷酸(100mM)、77mg氯化镁(2mM)溶解在1L 25mM pH 7.0的Tris.HCl溶液中，然后加入2000U固定化磷酸水解酶APase，该混合溶液在25℃缓慢搅拌4个小时后，直接过滤分离回收固定化酶。反应液利用D201阴离子树酯交换柱纯化(纯水作为流动相)，磷酸杂质吸附在树脂上而L-塔格糖直接流出，最后用G25尺寸排阻柱脱盐然后再低温抽干，得到13.2克白色泡沫(收率73％)，为L-塔格糖。固定化磷酸水解酶(APase)回收后保留了95％的初始活性。
所得产物做HPLC分析，采用Phenomenex(菲罗门)Rezex RCM系列单糖分析色谱柱(8mm×300mm,9μm)，使用温度是70℃；用纯水做流动相，流速1ml/min,折射率检测器(SHODEX RI-101)检测，产物的HPLC谱图如图1所示。
产物的1H-NMR谱图如图2所示，Varian 600兆核磁，D2O为溶剂。
综合图1和图2，可以推断产物为L-塔格糖。
实施例3：以D-半乳糖作为原料，液体酶(aldR,GatDH)制备L-塔格糖
在1L 50mM pH 7.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入18克D-半乳糖(100mM),0.71克还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐(NADH,1mM)，然后调节溶液pH值到7.5后，加入粗酶液(1000U aldR、3000U GatDH启动反应，维持反应液在25℃缓慢搅拌8个小时，在反应过程中通过添加酸碱来维持反应体系pH 6.5～8.5。反应结束后加入HCl水溶液调节pH到1.0终止反应、沉淀蛋白，过滤除去；然后调节反应液至pH 7.0后利用D201阴离子交换树脂纯化，收集的产品溶液最后利用反渗透膜除盐后浓缩、结晶(乙醇:水,1.5:1,v:v)得13.5克L-塔格糖(收率75％)。
所得产物的HPLC谱图和1H-NMR谱图分别同图1、图2，推断产物为L-塔格糖。
实施例4：以D-半乳糖作为原料，固定化混合酶(aldR,GatDH)制备L-塔格糖
与实施例3类似，但混合固定的aldR、GatDH酶而非液体酶被用来催化。反应结束后固定化酶还可以回收使用。
同样在1L 50mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入18克D-半乳糖(100mM),0.71克还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐(NADH,1mM)，然后调节溶液pH值到8.0后，加入4000U固定化酶(aldR:GatDH活力比1:4)启动反应，维持反应液在25℃缓慢搅拌10个小时，反应过程中维持体系pH 6.5～8.5。待反应完成后过滤回收固定化酶(固定化酶用50mM pH 8.0Tris缓冲液洗涤三次后4℃保存待用)，滤液pH值调节到7.0后利用D201阴离子交换树脂纯化，收集的产品溶液最后利用反渗透膜除盐后浓缩、结晶(乙醇:水,1.5:1,v:v)得11克L-塔格糖(收率61％)，过滤回收的固定化混合酶具有80％的初始酶活力。
所得产物的HPLC谱图和1H-NMR谱图分别同图1、图2，推断产物为L-塔格糖。
实施例5：酶的发酵生产
本专利所用酶为发酵生产所得，以下是制备酶的基本操作流程：
首先通过基因公司(安徽通用生物)合成该酶所对应的基因序列(SEQ.ID.NO.1～NO.6)，然后通过NdeI/XhoI酶切位点亚克隆到pET28a质粒上，并将该质粒转入E.coli(BL21)(擎科生物)细胞进行平板培养，最后挑单克隆进行液体逐级放大培养。
以下是细胞逐级放大培养的基本流程，首先将平板上的单菌落转入5ml含50μM卡那霉素的LB培养液中(37℃)进行培养，当细胞生长至对数期后接种到250ml含同样抗菌素的LB培养液中，最后再转入5L培养发酵罐里进行培养；当细胞OD600约为20时加入0.5mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)26℃诱导蛋白表达6小时，然后离心(4000rpm,15min)收集湿细胞30-55g。
为验证酶的表达，首先取少量细胞与三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)缓冲液(50mM,pH 8.0)混合均匀，随后利用冻融法破碎细胞，高速离心后取上清液跑SDS-PAGE蛋白凝胶(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶)确定蛋白可溶表达(图3)；
确认正确的剩余细胞先与缓冲液混匀(10克湿细胞与约200ml上市缓冲液混合)，然后进行高压破碎细胞、高速离心(16000rpm,45min)除细胞壁，最后所获得含酶清液(即为粗酶液)直接进行后续使用(该液体粗酶活力在150～350U/ml,U是室温一分钟转化1μmol的底物所需酶量)或进一步纯化后固定化使用(固体酶反应时)。
LB培养基构成为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉，1％NaCl，1％磷酸氢二钾、1％磷酸氢二钾以及5％的甘油。
实施例6：酶的固定
向上述收集的半乳糖还原酶(aldR)、半乳糖醇脱氢酶(GatDH)、磷酸水解酶(APase)粗酶液中逐量加入硫酸铵固体直至酶析出(35％-60％,w/v硫酸铵/缓冲液)。该酶固体随后通过离心收集(10000rpm,12min)，并缓慢溶入25mM pH 8.0的Tris缓冲液中,最后经G25尺寸排阻色谱柱脱盐(购于Sigma)以及利用DEAE Seplite FF(西安蓝晓公司)阴离子交换柱分离得到初纯化液体酶aldR、GatDH、APase。
初纯化液体酶aldR、GatDH利用LX-1000EP环氧树脂(西安蓝晓公司)按照一定活性比进行一次性混合固定；纯化酶APase同样利用LX-1000EP进性单独固定。
固定的基本方法为：将aldR与GatDH混合溶解在1L 50mM pH 8.0的磷酸钾溶液中，随后加入40mM苯氧乙酸以及300克LX-1000EP环氧树脂至缓冲液，室温搅拌4小时后过滤出固定化酶，最后用清水以及25mM pH 8.0磷酸缓冲液各洗涤三次后低温干燥待用。固定化的aldR与GatDH混合酶具有对应液体酶的70-85％的活性。
磷酸水解酶(APase)的固定方法与上述混合酶固定基本相同，2000U初纯化的APase溶液固定化后酶活是液体酶的85-94％。
半乳糖醇脱氢酶(GatDH)、己酮糖激酶(TgK)、乳酸脱氢酶(LDH)和乙酸激酶(AcK)的固定方法与上述混合酶固定基本相同。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南师范大学
<120> L-塔格糖的合成方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 254
<212> PRT
<213> 类球红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)
<220>
<223> GatDH
<400> 1
Met Asp Tyr Arg Thr Val Phe Arg Leu Asp Gly Ala Cys Ala Ala Val
1 5 10 15
Thr Gly Ala Gly Ser Gly Ile Gly Leu Glu Ile Cys Arg Ala Phe Ala
20 25 30
Ala Ser Gly Ala Arg Leu Ile Leu Ile Asp Arg Glu Ala Ala Ala Leu
35 40 45
Asp Arg Ala Ala Gln Glu Leu Gly Ala Ala Val Ala Ala Arg Ile Val
50 55 60
Ala Asp Val Thr Asp Ala Glu Ala Met Thr Ala Ala Ala Ala Glu Ala
65 70 75 80
Glu Ala Val Ala Pro Val Ser Ile Leu Val Asn Ser Ala Gly Ile Ala
85 90 95
Arg Leu His Asp Ala Leu Glu Thr Asp Asp Ala Thr Trp Arg Gln Val
100 105 110
Met Ala Val Asn Val Asp Gly Met Phe Trp Ala Ser Arg Ala Phe Gly
115 120 125
Arg Ala Met Val Ala Arg Gly Ala Gly Ala Ile Val Asn Leu Gly Ser
130 135 140
Met Ser Gly Thr Ile Val Asn Arg Pro Gln Phe Ala Ser Ser Tyr Met
145 150 155 160
Ala Ser Lys Gly Ala Val His Gln Leu Thr Arg Ala Leu Ala Ala Glu
165 170 175
Trp Ala Gly Arg Gly Val Arg Val Asn Ala Leu Ala Pro Gly Tyr Val
180 185 190
Ala Thr Glu Met Thr Leu Lys Met Arg Glu Arg Pro Glu Leu Phe Glu
195 200 205
Thr Trp Leu Asp Met Thr Pro Met Gly Arg Cys Gly Glu Pro Ser Glu
210 215 220
Ile Ala Ala Ala Ala Leu Phe Leu Ala Ser Pro Ala Ala Ser Tyr Val
225 230 235 240
Thr Gly Ala Ile Leu Ala Val Asp Gly Gly Tyr Thr Val Trp
245 250
<210> 2
<211> 337
<212> PRT
<213> 放射根瘤菌(Agrobacterium fabrum)
<220>
<223> LDH
<400> 2
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Ser
<210> 3
<211> 576
<212> PRT
<213> 丙酸杆菌(Propionibacterium namnetense)
<220>
<223> TgK
<400> 3
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1 5 10 15
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Gly Ala Val Leu Gly Asp Glu Asp Arg Ala Asp Lys Asp Ala Ile Arg
450 455 460
Gln Ala Ala Arg Ala Ala Leu Asp Ala Val Thr Arg Leu Gly Gly Ala
465 470 475 480
Lys Ala Gly Asp Lys Thr Met Val Asp Ala Met Ile Pro Phe Val Thr
485 490 495
Thr Leu Glu Ser Ser Ala Asp Ala Leu Pro Gln Ala Trp Glu Ser Ala
500 505 510
Cys Arg Ala Ala Asp Ala Ala Ala Gln Ala Thr Ser Glu Met Thr Ala
515 520 525
Lys Ile Gly Arg Ala Arg Pro Leu Gly Glu Lys Ser Leu Gly Thr Pro
530 535 540
Asp Pro Gly Ala Met Ser Phe Cys Glu Val Val Val Ala Val Gly Ser
545 550 555 560
Val Leu Ser Thr Ser Ala Ser Ser Asn Gly Gly Leu Arg Ala Gln Arg
565 570 575
<210> 4
<211> 400
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(E. coli)
<220>
<223> AcK
<400> 4
Met Ser Ser Lys Leu Val Leu Val Leu Asn Cys Gly Ser Ser Ser Leu
1 5 10 15
Lys Phe Ala Ile Ile Asp Ala Val Asn Gly Glu Glu Tyr Leu Ser Gly
20 25 30
Leu Ala Glu Cys Phe His Leu Pro Glu Ala Arg Ile Lys Trp Lys Met
35 40 45
Asp Gly Asn Lys Gln Glu Ala Ala Leu Gly Ala Gly Ala Ala His Ser
50 55 60
Glu Ala Leu Asn Phe Ile Val Asn Thr Ile Leu Ala Gln Lys Pro Glu
65 70 75 80
Leu Ser Ala Gln Leu Thr Ala Ile Gly His Arg Ile Val His Gly Gly
85 90 95
Glu Lys Tyr Thr Ser Ser Val Val Ile Asp Glu Ser Val Ile Gln Gly
100 105 110
Ile Lys Asp Ala Ala Ser Phe Ala Pro Leu His Asn Pro Ala His Leu
115 120 125
Ile Gly Ile Glu Glu Ala Leu Lys Ser Phe Pro Gln Leu Lys Asp Lys
130 135 140
Asn Val Ala Val Phe Asp Thr Ala Phe His Gln Thr Met Pro Glu Glu
145 150 155 160
Ser Tyr Leu Tyr Ala Leu Pro Tyr Asn Leu Tyr Lys Glu His Gly Ile
165 170 175
Arg Arg Tyr Gly Ala His Gly Thr Ser His Phe Tyr Val Thr Gln Glu
180 185 190
Ala Ala Lys Met Leu Asn Lys Pro Val Glu Glu Leu Asn Ile Ile Thr
195 200 205
Cys His Leu Gly Asn Gly Gly Ser Val Ser Ala Ile Arg Asn Gly Lys
210 215 220
Cys Val Asp Thr Ser Met Gly Leu Thr Pro Leu Glu Gly Leu Val Met
225 230 235 240
Gly Thr Arg Ser Gly Asp Ile Asp Pro Ala Ile Ile Phe His Leu His
245 250 255
Asp Thr Leu Gly Met Ser Val Asp Ala Ile Asn Lys Leu Leu Thr Lys
260 265 270
Glu Ser Gly Leu Leu Gly Leu Thr Glu Val Thr Ser Asp Cys Arg Tyr
275 280 285
Val Glu Asp Asn Tyr Ala Thr Lys Glu Asp Ala Lys Arg Ala Met Asp
290 295 300
Val Tyr Cys His Arg Leu Ala Lys Tyr Ile Gly Ala Tyr Thr Ala Leu
305 310 315 320
Met Asp Gly Arg Leu Asp Ala Val Val Phe Thr Gly Gly Ile Gly Glu
325 330 335
Asn Ala Ala Met Val Arg Glu Leu Ser Leu Gly Lys Leu Gly Val Leu
340 345 350
Gly Phe Glu Val Asp His Glu Arg Asn Leu Ala Ala Arg Phe Gly Lys
355 360 365
Ser Gly Phe Ile Asn Lys Glu Gly Thr Arg Pro Ala Val Val Ile Pro
370 375 380
Thr Asn Glu Glu Leu Val Ile Ala Gln Asp Ala Ser Arg Leu Thr Ala
385 390 395 400
<210> 5
<211> 368
<212> PRT
<213> 铜绿色假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)
<220>
<223> APase
<400> 5
Met Phe Lys Arg Ser Leu Ile Ala Ala Ser Leu Ser Val Ala Ala Leu
1 5 10 15
Val Ser Ala Gln Ala Met Ala Val Thr Gly Gly Gly Ala Ser Leu Pro
20 25 30
Ala Glu Leu Tyr Lys Gly Ser Ala Asp Ser Ile Leu Pro Ala Asn Phe
35 40 45
Ser Tyr Ala Val Thr Gly Ser Gly Thr Gly Lys Asn Ala Phe Leu Thr
50 55 60
Asn Asn Ser Ser Leu Phe Gly Thr Thr Gly Thr Val His Tyr Ala Gly
65 70 75 80
Ser Asp Ser Val Leu Ser Gly Ser Glu Leu Thr Thr Tyr Asn Ser Asn
85 90 95
Tyr Asn Gly Thr Tyr Gly Pro Leu Ile Gln Ile Pro Ser Val Ala Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Pro Tyr Arg Lys Asp Gly Asn Thr Thr Leu Asn Leu
115 120 125
Thr Ser Ala Gln Leu Cys Asp Ala Phe Ser Gly Ala Lys Thr Thr Trp
130 135 140
Gly Gln Leu Leu Gly Thr Thr Asp Ser Thr Pro Ile Arg Ile Val Tyr
145 150 155 160
Arg Thr Gly Ser Ser Gly Thr Thr Glu Leu Phe Thr Arg His Leu Asn
165 170 175
Ser Ile Cys Pro Thr Arg Phe Ala Thr Asn Ser Thr Phe Thr Asn Ala
180 185 190
Arg Leu Pro Ala Gly Gly Thr Leu Pro Ser Asn Trp Val Gly Val Ala
195 200 205
Ala Thr Ser Thr Val Val Ser Thr Val Lys Ala Thr Asn Gly Ser Leu
210 215 220
Gly Tyr Val Ser Pro Asp Ala Val Asn Ile Asn Ser Asn Ala Glu Val
225 230 235 240
Ser Arg Val Asn Gly Asn Leu Pro Thr Gln Ala Asn Val Ser Thr Ala
245 250 255
Leu Gly Ser Val Ala Pro Pro Ala Asn Ala Ala Asp Arg Ala Asp Pro
260 265 270
Ser Lys Trp Val Pro Val Phe Thr Asn Pro Ser Ala Gly Tyr Ser Ile
275 280 285
Val Gly Tyr Thr Asn Phe Val Phe Gly Gln Cys Tyr Lys Asp Ala Ser
290 295 300
Val Ser Thr Asp Val Arg Ala Phe Ile Asn Lys His Tyr Gly Gly Thr
305 310 315 320
Thr Thr Asn Ala Ala Val Ala Ala His Gly Phe Ile Pro Leu Thr Pro
325 330 335
Ala Trp Lys Ser Ala Ile Val Ser Ala Phe Tyr Thr Gly Thr Ser Glu
340 345 350
Asn Leu Ala Ile Gly Asn Thr Asn Val Cys Asn Thr Lys Gly Arg Pro
355 360 365
<210> 6
<211> 290
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> aldR
<400> 6
Met Gly Ala Glu His Ala Val Ala Ser Pro Phe Thr Leu Ala Ser Ser
1 5 10 15
Val Lys Leu Arg Asn Gly Ala Gln Met Pro Arg Leu Gly Phe Gly Val
20 25 30
Phe Gln Ser Thr Asn Ala Lys Ala Ser Thr Ala His Ala Leu Thr Met
35 40 45
Gly Tyr Arg His Ile Asp Ser Ala Arg Tyr Tyr His Asn Glu Glu Glu
50 55 60
Val Cys Ala Ala Val Gln Lys Phe Ser Gly Gly Asn Leu Pro Asn Glu
65 70 75 80
Gly Thr Gly Lys Val Trp Leu Thr Thr Lys Val Met Gly Gln Glu His
85 90 95
Gly Thr Asp Gln Thr Asn Lys Ala Val Asp Glu Ser Val Ala Ile Ala
100 105 110
Lys Lys Tyr Gly Leu Thr Trp Asp Leu Phe Leu Leu His Asp Pro Thr
115 120 125
Ala Gly Lys Gln Lys Arg Leu Glu Ala Trp Lys Val Leu Ile Glu Lys
130 135 140
Arg Asp Gln Gly Leu Ile Lys Ser Ile Gly Val Ser Asn Phe Gly Val
145 150 155 160
Lys His Leu Glu Gln Ile Lys Glu Ala Gly Leu Glu Thr Pro Glu Val
165 170 175
Asn Gln Ile Glu Leu His Pro Phe Leu Gln Gln Arg Asp Ile Val Glu
180 185 190
Tyr Cys Glu Lys Glu Gly Ile Val Val Glu Ala Tyr Cys Pro Ile Leu
195 200 205
Arg Gly Lys Arg Phe Asp Asp Pro Thr Leu Val Glu Leu Ser Lys Lys
210 215 220
His Ser Val Thr Val Pro Gln Ile Leu Ile Arg Trp Ser Leu Gln Lys
225 230 235 240
Gly Phe Val Pro Leu Pro Trp Leu Asp Thr Pro Gly Met Ile Gln Ala
245 250 255
Asn Ala Asp Leu Trp Asp Phe Glu Leu Asp Glu Gly Asp Met Gln Gln
260 265 270
Met Glu Lys Leu Asp Glu Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Pro Val Asn
275 280 285
Val Glu
290
<210> 7
<211> 765
<212> DNA
<213> 类球红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)
<220>
<223> GatDH
<400> 7
atggattatc gcaccgtgtt tcgcctggat ggcgcgtgcg cggcggtgac cggcgcgggc 60
agcggcattg gcctggaaat ttgccgcgcg tttgcggcga gcggcgcgcg cctgattctg 120
attgatcgcg aagcggcggc gctggatcgc gcggcgcagg aactgggcgc ggcggtggcg 180
gcgcgcattg tggcggatgt gaccgatgcg gaagcgatga ccgcggcggc ggcggaagcg 240
gaagcggtgg cgccggtgag cattctggtg aacagcgcgg gcattgcgcg cctgcatgat 300
gcgctggaaa ccgatgatgc gacctggcgc caggtgatgg cggtgaacgt ggatggcatg 360
ttttgggcga gccgcgcgtt tggccgcgcg atggtggcgc gcggcgcggg cgcgattgtg 420
aacctgggca gcatgagcgg caccattgtg aaccgcccgc agtttgcgag cagctatatg 480
gcgagcaaag gcgcggtgca tcagctgacc cgcgcgctgg cggcggaatg ggcgggccgc 540
ggcgtgcgcg tgaacgcgct ggcgccgggc tatgtggcga ccgaaatgac cctgaaaatg 600
cgcgaacgcc cggaactgtt tgaaacctgg ctggatatga ccccgatggg ccgctgcggc 660
gaaccgagcg aaattgcggc ggcggcgctg tttctggcga gcccggcggc gagctatgtg 720
accggcgcga ttctggcggt ggatggcggc tataccgtgt ggtga 765
<210> 8
<211> 1014
<212> DNA
<213> 放射根瘤菌(Agrobacterium fabrum)
<220>
<223> LDH
<400> 8
atgcgcattg tggtgtatag cgcgaaaccg tatgatcgcc agtttctgga tgaagcggcg 60
cgcccgggca ccgatctgca gtattgcgaa gcgcgcctga gcccggaaac cgtggcgctg 120
gcggatggcg cggtggcgat ttgcgcgttt gtgaacgatg atctgagccg cccggtgctg 180
gaaaaactgg cgggcatggg cgtgcgcctg gtggcgctgc gctgcgcggg ctttaaccag 240
gtggatctgg cggcggcgga aaaactgggc ctgaccattg cgcgcgtgcc ggcgtatagc 300
ccgtatgcgg tggcggaaca taccatggcg ctgattctga gcctgaaccg caaaattcat 360
cgcgcgtata accgcgtgcg cgaaggcaac tttgcgctgg atggcctgct gggctttgat 420
ctgcatggca aaaccatggg cattgtgggc accggcaaaa ttggcgcgat ttttgcgcgc 480
attgcggcgg gctttggctg ccgcctgatt ggccatgatc tgcatccgaa cccggattgc 540
gaagcgctgg gcatgaccta tggcacccgc gaagaactgt ttcgcaccag cgatattgtg 600
gcgctgatgt gcccgctgac ccgcgaaacc cgccatctga ttcgccgcga aaccctgccg 660
ctgctgaaaa aaggcgtgat gctgattaac accagccgcg gcgcgattat tgataccccg 720
gcggcgatta ccggcctgaa agatggcacc attggcagcc tgggcattga tgtgtatgaa 780
gaagaagcgg atctgttttt tgaagatctg agcaacgatg tgctgcgcga tgatgtgttt 840
gcgcgcctgc tgacctttcc gaacgtgctg gtgaccggcc atcagggctt ttttacccag 900
gaagcgctga aaaacattgc ggataccacc attggcaaca ttgaaagctt tgtggatacc 960
ggcaaagcgc tgcatgcggt gagcaccgaa cagctggcgg gcgcggtgag ctaa 1014
<210> 9
<211> 1731
<212> DNA
<213> 丙酸杆菌(Propionibacterium namnetense)
<220>
<223> TgK
<400> 9
atgacccgcc tggtgaacaa cccggatgat tttccgagcc aggcggtggc gggcctggtg 60
agcgcgtttc cgaactatgt gcgcccggtg tttggcggcg tggtgcgcgc ggcgcgcacc 120
gatcgcaaag tggcgctggt ggtgggcggc ggcagcggcc attatccggc gtttgcgggc 180
tgggtgggcc cgggctttgc ggatggcgcg gtgtgcggca acatttttag cagcccgagc 240
gcgagccagg cgtatgcggt gtgcaaagcg gcggatcgcg gcgcgggcgt gctgattggc 300
tttggcaact atgcgggcga tgtgctgcat tttggccagg cggcggaacg cctgcgcagc 360
gaaggcattg atgcgcgctg cctgctggtg accgatgata ttgcgagcgg ccaggaacat 420
ctgaaacgcc gcggcattgc gggcgatctg ccggtgttta aagtgaccgc ggcggcgtgc 480
gaagaaggcc gccgcattga tgaagtggtg gcggtgtttg atcgcgtgaa cgatcgcacc 540
cgcagcctgg gcgtggcgtt tgcgggctgc accctgccgg gctgcgatga accgctgttt 600
cgcgtggaag cgacccagat gggcgtgggc atgggcattc atggcgaacc gggcattcat 660
gatgaagcgc tgggcaccgc ggatgaagtg gcggcgatgc tggtggatcg cctgctggcg 720
gatcgcccga acaacagcgg cacccgcgtg gtgccgattg tgaacggcct gggcagcacc 780
aaatatgaag aactgtttgt gctgtggaac agcgtgagcc gccgcctgga agatgcgggc 840
ctgaccattg tggatccgca ggtgggcgaa tttgtgacca gcctggatat ggcgggcgtg 900
agcctgaccc tggtgtggct ggatgatgtg attgaaccgc tgtggctggc ggcgtgcgat 960
accccggcgt ttcgccgcgg caccgtggcg caggtggatt ttgataccac cccgctgccg 1020
caggaagtgg aacagattag cattaccaaa ccgggcagcc atgtgagcca gcgcctggcg 1080
ggcgtgattg tgcaggcgct ggaagcggtg gcgacccgcc tgagcgaacg cagcggcgaa 1140
ctgggccgcc tggatagcgt ggcgggcgat ggcgatcatg gcattggcat gacccgcggc 1200
agccaggcgg cgctggcgga agcgcgccgc gtgcgcggcg atggcgcggg cgcggcgacc 1260
accctgagcg cggcgggcct ggcgtggagc gaacatgcgg gcggcaccag cggcgcgctg 1320
tggggcgcgg tgctgaccgg ctttggcgcg gtgctgggcg atgaagatcg cgcggataaa 1380
gatgcgattc gccaggcggc gcgcgcggcg ctggatgcgg tgacccgcct gggcggcgcg 1440
aaagcgggcg ataaaaccat ggtggatgcg atgattccgt ttgtgaccac cctggaaagc 1500
agcgcggatg cgctgccgca ggcgtgggaa agcgcgtgcc gcgcggcgga tgcggcggcg 1560
caggcgacca gcgaaatgac cgcgaaaatt ggccgcgcgc gcccgctggg cgaaaaaagc 1620
ctgggcaccc cggatccggg cgcgatgagc ttttgcgaag tggtggtggc ggtgggcagc 1680
gtgctgagca ccagcgcgag cagcaacggc ggcctgcgcg cgcagcgctg a 1731
<210> 10
<211> 1203
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(E. coli)
<220>
<223> AcK
<400> 10
atgagcagca aactggtgct ggtgctgaac tgcggcagca gcagcctgaa atttgcgatt 60
attgatgcgg tgaacggcga agaatatctg agcggcctgg cggaatgctt tcatctgccg 120
gaagcgcgca ttaaatggaa aatggatggc aacaaacagg aagcggcgct gggcgcgggc 180
gcggcgcata gcgaagcgct gaactttatt gtgaacacca ttctggcgca gaaaccggaa 240
ctgagcgcgc agctgaccgc gattggccat cgcattgtgc atggcggcga aaaatatacc 300
agcagcgtgg tgattgatga aagcgtgatt cagggcatta aagatgcggc gagctttgcg 360
ccgctgcata acccggcgca tctgattggc attgaagaag cgctgaaaag ctttccgcag 420
ctgaaagata aaaacgtggc ggtgtttgat accgcgtttc atcagaccat gccggaagaa 480
agctatctgt atgcgctgcc gtataacctg tataaagaac atggcattcg ccgctatggc 540
gcgcatggca ccagccattt ttatgtgacc caggaagcgg cgaaaatgct gaacaaaccg 600
gtggaagaac tgaacattat tacctgccat ctgggcaacg gcggcagcgt gagcgcgatt 660
cgcaacggca aatgcgtgga taccagcatg ggcctgaccc cgctggaagg cctggtgatg 720
ggcacccgca gcggcgatat tgatccggcg attatttttc atctgcatga taccctgggc 780
atgagcgtgg atgcgattaa caaactgctg accaaagaaa gcggcctgct gggcctgacc 840
gaagtgacca gcgattgccg ctatgtggaa gataactatg cgaccaaaga agatgcgaaa 900
cgcgcgatgg atgtgtattg ccatcgcctg gcgaaatata ttggcgcgta taccgcgctg 960
atggatggcc gcctggatgc ggtggtgttt accggcggca ttggcgaaaa cgcggcgatg 1020
gtgcgcgaac tgagcctggg caaactgggc gtgctgggct ttgaagtgga tcatgaacgc 1080
aacctggcgg cgcgctttgg caaaagcggc tttattaaca aagaaggcac ccgcccggcg 1140
gtggtgattc cgaccaacga agaactggtg attgcgcagg atgcgagccg cctgaccgcg 1200
taa 1203
<210> 11
<211> 1107
<212> DNA
<213> 铜绿色假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)
<220>
<223> APase
<400> 11
atgtttaaac gcagcctgat tgcggcgagc ctgagcgtgg cggcgctggt gagcgcgcag 60
gcgatggcgg tgaccggcgg cggcgcgagc ctgccggcgg aactgtataa aggcagcgcg 120
gatagcattc tgccggcgaa ctttagctat gcggtgaccg gcagcggcac cggcaaaaac 180
gcgtttctga ccaacaacag cagcctgttt ggcaccaccg gcaccgtgca ttatgcgggc 240
agcgatagcg tgctgagcgg cagcgaactg accacctata acagcaacta taacggcacc 300
tatggcccgc tgattcagat tccgagcgtg gcgaccagcg tgaccgtgcc gtatcgcaaa 360
gatggcaaca ccaccctgaa cctgaccagc gcgcagctgt gcgatgcgtt tagcggcgcg 420
aaaaccacct ggggccagct gctgggcacc accgatagca ccccgattcg cattgtgtat 480
cgcaccggca gcagcggcac caccgaactg tttacccgcc atctgaacag catttgcccg 540
acccgctttg cgaccaacag cacctttacc aacgcgcgcc tgccggcggg cggcaccctg 600
ccgagcaact gggtgggcgt ggcggcgacc agcaccgtgg tgagcaccgt gaaagcgacc 660
aacggcagcc tgggctatgt gagcccggat gcggtgaaca ttaacagcaa cgcggaagtg 720
agccgcgtga acggcaacct gccgacccag gcgaacgtga gcaccgcgct gggcagcgtg 780
gcgccgccgg cgaacgcggc ggatcgcgcg gatccgagca aatgggtgcc ggtgtttacc 840
aacccgagcg cgggctatag cattgtgggc tataccaact ttgtgtttgg ccagtgctat 900
aaagatgcga gcgtgagcac cgatgtgcgc gcgtttatta acaaacatta tggcggcacc 960
accaccaacg cggcggtggc ggcgcatggc tttattccgc tgaccccggc gtggaaaagc 1020
gcgattgtga gcgcgtttta taccggcacc agcgaaaacc tggcgattgg caacaccaac 1080
gtgtgcaaca ccaaaggccg cccgtag 1107
<210> 12
<211> 873
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> aldR
<400> 12
atgggcgcgg aacatgcggt ggcgagcccg tttaccctgg cgagcagcgt gaaactgcgc 60
aacggcgcgc agatgccgcg cctgggcttt ggcgtgtttc agagcaccaa cgcgaaagcg 120
agcaccgcgc atgcgctgac catgggctat cgccatattg atagcgcgcg ctattatcat 180
aacgaagaag aagtgtgcgc ggcggtgcag aaatttagcg gcggcaacct gccgaacgaa 240
ggcaccggca aagtgtggct gaccaccaaa gtgatgggcc aggaacatgg caccgatcag 300
accaacaaag cggtggatga aagcgtggcg attgcgaaaa aatatggcct gacctgggat 360
ctgtttctgc tgcatgatcc gaccgcgggc aaacagaaac gcctggaagc gtggaaagtg 420
ctgattgaaa aacgcgatca gggcctgatt aaaagcattg gcgtgagcaa ctttggcgtg 480
aaacatctgg aacagattaa agaagcgggc ctggaaaccc cggaagtgaa ccagattgaa 540
ctgcatccgt ttctgcagca gcgcgatatt gtggaatatt gcgaaaaaga aggcattgtg 600
gtggaagcgt attgcccgat tctgcgcggc aaacgctttg atgatccgac cctggtggaa 660
ctgagcaaaa aacatagcgt gaccgtgccg cagattctga ttcgctggag cctgcagaaa 720
ggctttgtgc cgctgccgtg gctggatacc ccgggcatga ttcaggcgaa cgcggatctg 780
tgggattttg aactggatga aggcgatatg cagcagatgg aaaaactgga tgaaggctat 840
gcggtgagct ggaacccggt gaacgtggaa tga 873
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