一类基于天然胆固醇无规共聚物、制备方法及其应用
阅读说明：本技术 一类基于天然胆固醇无规共聚物、制备方法及其应用 (Random copolymer based on natural cholesterol, preparation method and application thereof ) 是由 盛瑞隆 史向阳 李茂全 王昭 于 2021-01-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一类基于天然胆固醇无规共聚物、制备方法及其应用,该无规共聚物中疏水砌块来源于生物相容性的天然甾体化合物胆固醇,进而通过与聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯(PDMAEMA)进行阳离子开环聚合后加入功能化的胺获得。本发明的基于天然胆固醇无规共聚物其分子结构为两亲性,具有分子量和亲疏水比例可调控的优点,共聚物具有明显较高的各向同性和非液晶性,而且与已知的PDMAEMA相比,具有较好的疏水特性。且可以采用溶剂涂膜法制备层层组装Layer-by-Layer材料。本发明所提供的制备方法具有简便、高效、原料易得的优点,有望作为低成本、高生物相容性的生物修复材料在医学组织工程中得到实际应用。(The invention relates to a random copolymer based on natural cholesterol, a preparation method and application thereof, wherein a hydrophobic building block in the random copolymer is derived from biocompatible natural steroid compound cholesterol, and is obtained by adding functionalized amine after cationic ring-opening polymerization with poly N, N-dimethylaminoethyl methacrylate (PDMAEMA). The molecular structure of the random copolymer based on natural cholesterol is amphiphilic, the random copolymer based on natural cholesterol has the advantages of adjustable molecular weight and hydrophilic-hydrophobic ratio, the copolymer has obviously higher isotropy and non-liquid crystal property, and compared with the known PDMAEMA, the random copolymer based on natural cholesterol has better hydrophobic property. And a Layer-by-Layer assembled Layer-Layer material can be prepared by adopting a solvent coating method. The preparation method provided by the invention has the advantages of simplicity, convenience, high efficiency and easily obtained raw materials, and is expected to be practically applied to medical tissue engineering as a biological repair material with low cost and high biocompatibility.)
技术领域
本发明涉及面向新型天然胆固醇无规共聚物的界面生物材料与生物医药技术领域，具体地说，是一类基于天然胆固醇无规共聚物、制备方法及其应用。
背景技术
研究与开发生物相容性界面生物材料已成为生命科学和材料科学等交叉学科领域中最为热门的研究课题之一。正常生理状态下，细胞/组织具有特定的微环境维持其相关功能，在病理条件下，组织的缺损或病变会导致微环境破坏和生理信号异常。界面生物材料可以模拟细胞/组织微环境和重构其成分和形态，研究细胞在生物材料界面的力学响应与信号转导可以指导实现损伤组织的修复，因此研究新型界面生物材料具有重要意义。为了改善界面生物材料的生物相容性、丰富材料的生物学功能和实现仿生效果，采用生物相容性天然产物作为修饰手段制备功能化高分子界面生物材料已成为该领域的研究热点。通过生物相容性天然产物修饰途径，可仿生制备系列促基因转染、促生长因子释放、抗菌、抗肿瘤等具有广泛应用前景的高分子/聚合物界面生物材料。然而目前所使用的高分子材料可设计性、可裁剪性较差，化学性质单一，分子量分布宽，性能难以调控。这些缺点限制了所制备材料在复杂病理微环境下的应用前景。将天然产物引入高分子材料进行改性及制备功能性合成高分子材料，实现修复-治疗智能材料的研发逐渐成为热点，进一步通过“药物-材料结合”的手段可制备系列仿生复合界面材料，用于修复医学和再生医学应用。随着更多高分子聚合物合成方法的出现和加工技术的提高，这些问题在未来都能得到解决，同时也能实现微尺度精准的仿生。
作为一种绿色可再生的天然产物，胆固醇具有可天然来源和疏水结构的特点，其可通过进一步修饰功能片段，如水溶性片段合成新型生物相容性功能聚合物或表面活性剂，我们先前的系列研究工作表明，这些功能分子/聚合物已经在构建功能药物和基因载体生物材料中得到初步应用(Biomacromolecules 2016,17,98-110；International JournalofMolecular Science.2018,19,369；中国专利：CN102161688；CN101870719；CN103214541)。而作为界面生物材料既要满足低毒性、无免疫原性、体内可降解吸收，还要能够和生物组织有效地结合和血液循环中长期稳定存在，并减少与血液中蛋白等成份的非特异性相互作用。在胆固醇衍生物中引入具有良好生物相容性的含氨基功能基团是改善生物相容性和提高生物组织结合性能的有效方法。
聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯(PDMAEMA)是一类具有良好生物相容性的叔氨基聚合物，其中叔胺pKa约为7.5，也具有一定的质子缓冲能力，可通过质子化效应进行细胞膜粘附。DMAEMA单体可通过活性自由基聚合可得到分子量及分布可控的聚合物，并且可经由合理的分子设计得到多种多样的拓扑结构(嵌段、星型、接枝等)。PDMAEMA的分子量、复合物尺寸、制备条件、pH、离子强度、温度等均对PDMAEMA的界面效率产生影响。经亲水嵌段修饰的PDMAEMA的毒性和界面亲水性同时发生了降低，而发现通过聚合物中疏水片段如聚己内酯(PCL)的引入，聚合物的毒性和界面粘附效率相比于单纯的DMAEMA均聚物具有了很大程度的提高。因而在单体的修饰中，疏水修饰DMAEMA聚合物引起了广泛的关注。然而到目前为止，许多功能化DMAEMA聚合物其分子结构不利于其进一步调控，且其制备和分离方法难于精确控制和模式化，从而使得其大规模合成与应用受到了限制。因此，进一步探索和开发同时具有分子结构可调控性，较低细胞毒性以及具有良好生物相容性的天然产物(如胆固醇等)疏水修饰DMAEMA聚合物及其衍生物，将可在很大程度上丰富和扩展疏水修饰DMAEMA聚合物的分子功能多样性及其作为生物医学材料的应用。
另一方面，面向生物界面材料的实际需求，很有必要建立起一种高效率的、易操作的、结构可控的天然胆固醇衍生的阳离子功能聚合物的制备方法，常规大量合成制备该类可控型聚合物，以便进一步深入进行该类新型界面生物材料的性能研究。关于本发明一类基于天然胆固醇无规共聚物、制备方法及其应用目前还未见有相关报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一类基于天然胆固醇无规共聚物、制备方法及其应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
第一方面，本发明提供了一类基于天然胆固醇无规共聚物，如化学结构通式(I)所示：
本发明所述的一类基于天然胆固醇无规共聚物，重复单元为m，n的分子连接结构片段如上式中所示，m,n选自1～200的自然数，优选地，m选自10～80的自然数，n选自10～200的自然数，优选地，n选自10～80的自然数。
第二方面，本发明提供了如上所述一类基于天然胆固醇无规共聚物的制备方法，包括如下步骤：
具体地：在预置搅拌子的干燥Schlenk反应管中加入十二烷基硫醇DDMAT(109.4mg，0.3mmol),偶氮二异丁腈(16.4mg，0.1mmol)、胆固醇-6C-甲基丙烯酸单体(3.33g，6mmol)、DMAEMA单体(4～67mmol)和新蒸的甲苯20mL，经三次液氮冷冻-抽真空-融解通氮气循环，除去反应管中的残留氧气。将反应管浸入预先加热到一定反应温度的油浴中反应一定时间，浓缩反应液滴到非极性有机溶剂中沉淀，并通过极性溶剂-非极性溶剂两次反复溶解-沉淀的方法纯化聚合物，最后真空干燥后得到基于天然胆固醇无规共聚物为浅黄色粉末状产物。
进一步地，以上制备方法中所述的十二烷基硫醇DDMAT(109.4mg，0.3mmol),偶氮二异丁腈(16.4mg，0.1mmol)、胆固醇-6C-甲基丙烯酸单体(3.33g，6mmol)投料量比例固定，而DMAEMA单体投料比例范围是(4～67mmol)，优选6～26mmol。
进一步地，以上制备方法中所述的反应温度为50-100℃，特别优选60-80℃。
进一步地，以上制备方法中所述的反应时间为8-24h，特别优选10-15h。
进一步地，所述极性有机溶剂包括四氢呋喃、1，4-二氧六环、三氯甲烷、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮及其混合溶剂。
进一步地，所述非极性溶剂包括正己烷、环己烷、石油醚、二丙醚、二异丙醚及其混合溶剂。
第三方面，本发明提供了如上所述的天然胆固醇无规共聚物在制备促基因转染界面生物材料/促生长因子释放界面生物材料/抗菌界面生物材料/抗肿瘤界面生物材料中的应用。
本发明优点在于：
1、本发明所提供的一类基于天然胆固醇无规共聚物界面生物材料的合成方法简单高效，功能分子主体可来源于大量存在的胆固醇类天然产物，其余分子结构片段可来源于可工业级大量制备的有机化工原料，合成方法易推广、成本低、可规模化制备，可工业生产性好。
2、本发明提供的一类基于天然胆固醇无规共聚物界面生物材料具有两亲性和界面活性，聚合物具有较高的各向同性和非液晶性，可用作生物活性界面材料，而且与已知的PDMAEMA相比，具有较好的疏水特性。
3、本发明所提供的一类基于天然胆固醇无规共聚物界面生物材料，具有较好的生物相容性，可以采用溶剂涂膜法制备层层组装Layer-by-Layer材料，有望在作为生物修复材料在医学组织工程中得到实际应用，有很好的应用前景。
附图说明
附图1是实施例1-4中一类基于天然胆固醇无规共聚物界面生物材料P1-P4在不同温度下的液晶相/非液晶相形貌。
附图2是实施例1-4中一类基于天然胆固醇无规共聚物界面生物材料P1-P4的截面接触角的Dataphysis OCA20(German)光学视频成像和接触角数据。
附图3是实施例1-4中所述的一类基于天然胆固醇无规共聚物界面生物材料的MTT法细胞毒性评价数据。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1基于天然胆固醇无规共聚物P1(PDMAEMA18-PMChol16)的合成
在预置搅拌子的干燥Schlenk反应管中加入十二烷基硫醇DDMAT(109.4mg，0.3mmol),偶氮二异丁腈(16.4mg，0.1mmol)、胆固醇-6C-甲基丙烯酸单体(3.33g，6mmol)、DMAEMA单体(0.91g,6mmol)和新蒸的甲苯20mL，经三次液氮冷冻-抽真空-融解通氮气循环，除去反应管中的残留氧气。将反应管浸入预先加热到80℃的油浴中反应12h，浓缩反应液滴到石油醚中沉淀，并通过两次甲醇-环己烷反复溶解-沉淀的方法纯化聚合物，最后真空干燥后得到基于天然胆固醇无规共聚物P1为浅黄色粉末状产物2.26g，产率82％。
聚合物P1的化学结构
实施例2基于天然胆固醇无规共聚物P2(PDMAEMA30-PMChol16)的合成
在预置搅拌子的干燥Schlenk反应管中加入十二烷基硫醇DDMAT(109.4mg，0.3mmol),偶氮二异丁腈(16.4mg，0.1mmol)、胆固醇-6C-甲基丙烯酸单体(3.33g，6mmol)、DMAEMA单体(1.81g,12mmol)和新蒸的甲苯20mL，经三次液氮冷冻-抽真空-融解通氮气循环，除去反应管中的残留氧气。将反应管浸入预先加热到80℃的油浴中反应10h，浓缩反应液滴到环己烷中沉淀，并通过两次丙酮-正己烷反复溶解-沉淀的方法纯化聚合物，最后真空干燥后得到基于天然胆固醇无规共聚物P2为浅黄色粉末状产物2.11g，产率76％。
聚合物P2的化学结构
实施例3基于天然胆固醇无规共聚物P3(PDMAEMA43-PMChol16)的合成
在预置搅拌子的干燥Schlenk反应管中加入十二烷基硫醇DDMAT(109.4mg，0.3mmol),偶氮二异丁腈(16.4mg，0.1mmol)、胆固醇-6C-甲基丙烯酸单体(3.33g，6mmol)、DMAEMA单体(2.41g，18mmol)和新蒸的甲苯20mL，经三次液氮冷冻-抽真空-融解通氮气循环，除去反应管中的残留氧气。将反应管浸入预先加热到80℃的油浴中反应12h，浓缩反应液滴到正己烷中沉淀，并通过两次乙腈-正己烷反复溶解-沉淀的方法纯化聚合物，最后真空干燥后得到基于天然胆固醇无规共聚物P3为浅黄色粉末状产物1.98g，产率72％。
聚合物P3的化学结构
实施例4基于天然胆固醇无规共聚物P4(PDMAEMA72-PMChol16)的合成
在预置搅拌子的干燥Schlenk反应管中加入十二烷基硫醇DDMAT(109.4mg，0.3mmol),偶氮二异丁腈(16.4mg，0.1mmol)、胆固醇-6C-甲基丙烯酸单体(3.33g，6mmol)、DMAEMA单体(3.58g,24mmol和新蒸的甲苯20mL，经三次液氮冷冻-抽真空-融解通氮气循环，除去反应管中的残留氧气。将反应管浸入预先加热到90℃的油浴中反应12h，浓缩反应液滴到正己烷中沉淀，并通过两次甲醇-二异丙醚反复溶解-沉淀的方法纯化聚合物，最后真空干燥后得到基于天然胆固醇无规共聚物P4为浅黄色粉末状产物2.35g，产率84％。
聚合物P4的化学结构
表1、实施例1-4中基于天然胆固醇无规共聚物(P1-P4)表征数据
注：Mn,NMR表示核磁数均分子量；Mn,GPC表示凝胶排阻色谱数均分子量；PDI表示聚合物分子量分布。
实施例5基于天然胆固醇无规共聚物界面生物材料的溶液性能
将实施例1-4合成所得基于天然胆固醇无规共聚物界面生物材料P1-P4(5mg)加入到2mL纯水中。将其置入超声波清洗器内100W功率并事先设定20min，超声分散然后以纯水定容至10mL，室温下孵育30min得到天然胆固醇无规共聚物界面生物材料P1-P4的微米级悬浮液，随后将样品2mL量取于聚丙烯超声离心管中拍照。
实施例6基于天然胆固醇无规共聚物界面生物材料的液晶性能测试
采用热台偏光显微镜(POM)测试基于天然胆固醇无规共聚物界面生物材料(P1-P4)在不同温度下的液晶相/非液晶相形貌，由配有Linkam LTS350热台的Olympus BX51偏光显微镜观察得到。首先将0.5mg基于天然胆固醇无规共聚物界面生物材料P1-P4缓慢升温至165～180℃，等温10min使液晶相完全转变为各向同性相，然后以1℃/min的降温速度降至30～45℃，等温1～12h之后进行观测并拍摄其液晶相织构图片。
结果：如图1所示，采用热台偏光显微镜(POM)成像从图中可以看出基于天然胆固醇无规共聚物界面生物材料P1-P4具有非液晶性和各向同性，由于天然胆固醇的液晶相具有各向异性而不利于成膜制备界面生物材料，P1-P4的非液晶性和各向同性表明该类共聚物具有良好的成膜特性。
实施例7基于天然胆固醇无规共聚物界面生物材料的界面亲疏水性能测试
本发明实施例1-4中所述的一类基于天然胆固醇无规共聚物界面生物材料的界面接触角实验：将2.0mg天然胆固醇无规共聚物P1-P4在1mL有机溶剂二氯甲烷中充分溶解后滴于普通医学载玻片表面使溶剂自然挥发制得天然胆固醇无规共聚物薄膜，滴上去离子水，然后采用Dataphysis OCA20(German)光学视频接触角仪器测量水与天然胆固醇无规共聚物薄膜的接触角，实验中采用3次测得的平均值作为最终数据。同时拍摄水滴在天然胆固醇无规共聚物薄膜界面的形貌。
结果：如图2所示，P1接触角102.9±1.6o，P2接触角98.5±3.1o，P3接触角93.1±1.2o，P4接触角95.9±0.5o，水滴的延展性随之增加。结果表明，增加PDMAEMA的比例可以有效增加天然胆固醇无规共聚物界面生物材料的界面亲水特性，从而有利于今后在该类界面生物材料基质上进行细胞粘附和生长性能的亲疏水调控。
实施例8基于天然胆固醇无规共聚物界面生物材料的细胞毒性测试
本发明实施例1-实施例4中所述的一类基于天然胆固醇无规共聚物界面生物材料的MTT法细胞毒性评价：首先人肝癌细胞HepG2以每孔5×104细胞的密度接种于96孔培养板中，于37℃培养箱中培养到12h后，加入不同浓度的基于天然胆固醇无规共聚物界面生物材料，在37℃下继续培养24h。然后加入20μL MTT(5mg/mL)溶液，37℃下放置4小时。采用Biotek ELX-800酶标仪在490nm波长下分析。本专利中所得HepG2细胞毒性实验数据采用t-检验法进行统计分析，平均值和标准偏差由每个样品3次测试结果进一步处理得到。HepG2细胞相对存活率(％)＝(样品OD490－样品OD630)/(对照OD490－对照OD630)×100％。
结果：如图3所示，P1-P4在人肝癌细胞HepG2中的细胞毒性较低，且可以通过调节PDMAEMA的比例对其细胞毒性进行调控，该类基于天然胆固醇的无规共聚物的较低的细胞毒性和较好的生物相容性，有利于今后在该类界面生物材料基质上进行细胞粘附和生长性能的亲疏水调控，有望在修复医学组织工程方面得到应用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
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